黄瓜与西芹间作土壤细菌多样性及其对黄瓜枯萎病-中国生态农业学报

西芹腐根物质浸提液作用后黄瓜枯萎病菌弱毒菌株的筛选及致弱机理的研究黄瓜枯萎病(Cucumber wilt)是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的一种土传病害,病菌生活力极强,以菌丝体、菌核和厚垣孢子在土壤、病残体和种子上越冬,在土壤中可存活5-6年或更长的时间。

近年来,随着设施栽培生产黄瓜的不断发展,使得黄瓜枯萎病病害问题十分突出,发病程度也日趋严重。

近年来,国内外学者应用植物化感技术防控病害已成为植物病害防控新的趋势。

化感作用虽然是近二十多年来得到科学界普遍重视的研究领域,但是利用化感作用筛选病原菌的弱毒菌株及其致病机理的研究并不普遍。

本实验在室内培养基条件下,利用西芹腐根及根际区土壤乙醇、丙酮和蒸馏水浸提液进行作用1代和连续多代作用黄瓜枯萎病菌后继代培养,研究其对黄瓜枯萎病菌的化感作用效果及温室人工接种致病力变化情况,以筛选黄瓜枯萎病菌的弱毒菌株,并对其致病力稳定性研究；和对不同浸提液处理的每一代病菌孢子数量的形成和孢子萌发率及菌体分泌的镰刀菌算含量、果胶酶活性、纤维素酶活性和β-葡萄糖苷酶活性进行测定,目的以研究黄瓜枯萎病菌的致弱作用机理。

1.西芹腐根及根际区土壤乙醇、丙酮和蒸馏水浸提液处理1代黄瓜枯萎病菌后未筛选到黄瓜枯萎病菌的弱毒菌株。

不同浸提液处理在第1代对黄瓜枯萎病菌菌落生长表现为显著的化感抑制作用,随代数的增加抑制作用减小,处理菌落直径均<其浸提剂对照<总对照；不同浸提液处理后与其对照和总对照相比,病情指数均降低,致病力下降,未降到弱毒菌株的范围。

西芹腐根乙醇、丙酮和蒸馏水处理第6代的病情指数分别为58.67%、57.83%和61.67%；西芹腐根际区土乙醇、丙酮和蒸馏水处理的病情指数分别为59.17%、58.83%和62.67%。

2.西芹腐根及根际区土壤乙醇、丙酮和蒸馏水浸提液连续多代(6代)处理黄瓜枯萎病菌后筛选到3株黄瓜枯萎病菌的弱毒菌株,分别为第5代腐根乙醇和腐根丙酮、第6代腐根际区土壤乙醇浸提液处理。

西芹浸提液处理后黄瓜枯萎病菌弱毒菌株的筛选及其诱导抗生研究由黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）侵染而引起的黄瓜枯萎病，是世界性的根际土传病害，一般年限发病率为10～30%，给黄瓜生产造成了巨大的经济损失。

采用化学药剂进行防治会带来“3R”问题，且污染环境。

嫁接换根虽说可以从根本上防治枯萎病，但是由于嫁接技术相对有难度，嫁接后管理繁琐，嫁接后黄瓜品质下降等原因导致实际生产中推广面积有限。

利用黄瓜枯萎病菌弱毒菌株的诱导抗病性技术进行防治已经成为新的病害控制措施。

本实验在培养基条件下，用西芹鲜根、鲜根际区物及种子的丙酮、乙醇和蒸馏水浸提液对黄瓜枯萎病菌分别进行处理1代和每代处理而后连续培养，每1代均测定不同处理病菌的菌落直径及其田间致病力，用以筛选黄瓜枯萎病菌的弱毒菌株。

与此同时，测定每1代不同处理病菌分泌的毒素—镰刀菌酸含量及细胞壁降解酶活性，用以研究不同西芹鲜根物质及种子的浸提液对黄瓜枯萎病菌的致弱作用机理。

随后用筛选到的黄瓜枯萎病菌弱毒菌株作为诱导物进行了黄瓜枯萎病诱导抗性的研究。

主要结果如下：1.50mg mL-1的西芹鲜根、根际区物及种子的丙酮、乙醇、蒸馏水浸提液分别处理1代后，不同处理均表现为第1代枯萎病菌的直径受抑制作用最强，以后随着继代培养代数的增加，各处理与其对照间差异不显著，抑制作用逐渐减小。

鲜根、根际区物及种子的3种浸提液对黄瓜枯萎病菌的致病力有致弱作用，各处理的病情指数随着继代培养代数的增加，表现为先减小后增大。

至第6代时，西芹鲜根丙酮、乙醇、蒸馏水浸提液处理的病情指数分别为27.5、29.2和28.3；西芹根际区物丙酮、乙醇、蒸馏水浸提液处理的病情指数分别为28.3、27.5和28.3；西芹种子丙酮、乙醇、蒸馏水浸提液处理的病情指数分别为29.2、28.3和28.3。

实验通过西芹鲜根、根际区物、种子的3种浸提液1代处理后，继代培养6代未能获得黄瓜枯萎病菌的弱毒菌株。

西芹种子浸提液对黄瓜枯萎病菌化感作用及其机理的研究黄瓜枯萎病是一种分布较广、为害较重、防治困难的典型的世界性根际土传病害,随着连作年限的增加,发病率明显增高,严重威胁和阻碍着黄瓜生产。

利用化感作用防治土传病害是当今植物保护的新思路、新方法。

本试验采用蒸馏水、乙醇、丙酮作为浸提剂,获得西芹种子的浸提液,研究了在培养基条件下各浸提液对黄瓜枯萎病菌的化感作用,并深入探讨了其对黄瓜枯萎病菌的化感作用机理,且对化感物质进行了层析分离,为利用化感作用防治黄瓜枯萎病提供了科学的理论依据,主要结果如下:1.蒸馏水、乙醇、丙酮的西芹种子浸提液都对黄瓜枯萎病菌有化感作用,浓度越大化感作用越强。

其化感作用效果在所试浓度范围内均是50 mg·mL~-1浓度的处理对黄瓜枯萎病菌的抑制作用最强,50 mg·mL-1浓度的3种浸提液处理144 h后对黄瓜枯萎病菌的抑制与对照相比蒸馏水浸提液为31.07%,乙醇浸提液为49.60%,丙酮浸提液为57.50%。

丙酮、乙醇浸提液的化感作用强度大于蒸馏水浸提液。

2.黄瓜枯萎病菌经西芹种子各浸提液化感作用后,黄瓜枯萎病菌菌丝变细,分叉少;孢子形成、孢子萌发均受到不同程度的化感抑制作用,孢子形成抑制率分别为40.32%、62.26%、60.42%,孢子萌发抑制率分别为13.85%、27.28%、28.08%。

在电镜下观察各处理病菌孢子膜结构遭到破坏,胞内结构紊乱,内容物外渗。

各浸提液处理后,黄瓜枯萎病菌分泌的三种细胞壁降解酶(果胶酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶)的活性较对照降低。

其产生的毒素(镰刀菌酸)含量较对照分别降低了20.02%、31.50%、34.18%。

各浸提液对黄瓜枯萎病菌的细胞膜透性有明显的影响,其质膜的相对电导率分别较对照升高了5.54%、15.57%、18.90%;丙二醛含量较对照分别升高了7.95%、26.36%、35.62%。

可溶性蛋白质含量较对照分别降低了26.62%、25.27%、27.45%。

西芹鲜根浸提液对黄瓜枯萎病菌化感作用机理的研究在培养基条件下,用西芹鲜根浸提液处理黄瓜枯萎病菌,对化感作用方式、保护酶活性、细胞壁降解酶活性及菌体代谢物质含量进行测定后,以研究西芹鲜根浸提液对黄瓜枯萎病菌的化感作用机理。

结果表明:不同西芹鲜根浸提液(丙酮、乙醇和蒸馏水)处理后黄瓜枯萎病菌菌丝生长受到抑制,病菌孢子数量减少,孢子萌发率降低,其中丙酮、乙醇和蒸馏水浸提液处理后菌丝生长抑制率分别为27%、25.7%、3.3%,孢子数量抑制率为65%、73.9%、9.9%,孢子萌发率为58.08%、57.3%、78.04%,较对照降低了17.92%、15.61%、4.46%。

不同西芹鲜根浸提液作用后黄瓜枯萎病菌菌丝后继生长依然受到化感抑制作用,化感抑制强度随时间的延长呈现减弱趋势。

不同西芹鲜根浸提液处理后黄瓜枯萎病菌分泌的细胞壁降解酶活性均降低,从果胶酶活性来看,丙酮浸提液化感抑制作用最强,乙醇浸提液次之,差值分别为-10.384、-8.201,最后是蒸馏水浸提液;从β-葡萄糖苷酶活性看,丙酮浸提液化感抑制作用最强,其次是蒸馏水浸提液,最后是乙醇浸提液,差值分别为-32.982、-24.508和-17.085。

对纤维素酶活性而言,丙酮浸提液化感抑制作用最强,乙醇次之,差值分别为-4.168和-3.181,最后为蒸馏水浸提液;菌体中SOD,POD,CAT酶活性均降低,丙酮浸提液处理后SOD、POD活性降低幅度最大,差值分别为-13.414和-26.172 ,乙醇浸提液次之,差值为-11.462和-25.181,最后是蒸馏水浸提液。

丙酮浸提液处理后CAT活性降低的幅度最大,差值为-11.318,其次是蒸馏水浸提液,差值为-3.785,最后是乙醇浸提液;可溶性蛋白质含量下降,丙二醛和过氧化氢含量升高,乙醇浸提液处理后菌体代谢的蛋白质含量减少的幅度最大,丙酮浸提液次之,差值分别为-34.647和-19.752,最后为蒸馏水浸提液,丙酮浸提液处理后菌体代谢的丙二醛含量增加的幅度最大,乙醇次之,最后是蒸馏水浸提液,差值分别为44.837、10.491、6.150。

32(2)215-220 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2016年4月黄瓜炭疽病拮抗细菌的筛选及其抑制效果谢学文，董瑞利，石延霞，柴阿丽，朱发娣，李宝聚*（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘要：从连作多年的黄瓜根际土样中筛选得到1株对黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare具有较强拮抗活性的菌株WF−3。

通过菌落形态观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。

活体盆栽条件下，该菌株对黄瓜炭疽病的防治效果为66.48%。

两年的田间试验表明拮抗菌株WF−3培养物对黄瓜炭疽病具有良好的防治效果，防效分别为68.14%和73.70%。

关键词：黄瓜炭疽病菌；拮抗细菌；甲基营养型芽孢杆菌；黄瓜中图分类号：S432；S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2016)0-0215-06 Screening and Inhibition Effect of Antagonistic Bacteria against Cucumber AnthracnoseCaused by Colletotrichum orbiculareXIE Xuewen, DONG Ruili, SHI Yanxia, CHAI Ali, ZHU Fadi, LI Baoju*(Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)Abstract: A bacterial strain WF-3 isolated from rhizosphere soil of cucumber in a continuous cucumber cropping system, exhibited a high antagonistic effect on cucumber anthracnose caused by Colletotrichum orbiculare.This strain was identified as Bacillus methylotrophicus according to its morphological, physiological and biochemical characterizations and the analysis of 16S rDNA gene sequence. In this paper, we have investigated the control effect of WF-3 against cucumber anthracnose via pot and field experiments. Results showed that in the pot experiment the control effect was 66.48%, while in a two-year field test conducted with the cultures of WF-3, the good control effect of 68.14% and 73.70% was obtained in 2013 and 2014, respectively, which proved that WF-3 can effectively control cucumber anthracnose.Key words:Colletrichum orbiculare; antagonistic bacteria; Bacillus methylotrophicus; cucumber黄瓜炭疽病由葫芦科刺盘孢菌Colletotrichum orbiculare sp.引起，是一种重要的黄瓜病害，主要为害黄瓜叶片、茎蔓和果实，全生育期均可发病，病菌以菌丝体或拟菌核在种子上或随病残体在土壤中越冬，防治难度较大。

盆栽下西芹根物质对黄瓜枯萎病病菌的化感作用及其对相关酶
的影响
本试验在盆栽的条件下,用西芹根物质(根提取物和根际区物)不同溶剂、不同浓度的浸提液在黄瓜幼苗期进行灌根处理,以研究其对黄瓜植株生长和枯萎病病菌的化感效果,同时对浸提液处理后黄瓜叶片内的几种关键酶和MDA含量进行分析。

研究结果表明:1.西芹鲜根浸提液对黄瓜植株生长有化感促进作用,在处理浓度范围内,蒸馏水和乙醚浸提液随处理浓度的提高,化感促进作用在逐渐增强,而乙醇浸提液处理2的化感效果表现最好,其中经蒸馏水浸提液处理黄瓜植株后对株高、茎粗和叶面积的最大促进率分别为45.98%、14.85%和82.90%,乙醇浸提液处理黄瓜植株后对株高、茎粗和叶面积的最大促进率分别为50.03%、36.14%和48.73%,蒸馏水和乙醇浸提液对黄瓜植株生长化感促进效果最好。

2.西芹根际区物浸提液对黄瓜植株生长有化感促进作用,在处理浓度范围内,处理浓度越高,促进作用越强,且西芹鲜根浸提液对黄瓜植株生长化感促进效果明显优于西芹根际区物浸提液处理。

3.分别用蒸馏水、乙醇和乙醚浸提液处理黄瓜植株后,使黄瓜叶片内的SOD、POD和CAT活性显著和极显著提高, MDA含量却显著和极显著的下降,因而使黄瓜植株具有较强的抗病性。

4.西芹鲜根浸提液和根际区物浸提液处理黄瓜植株后对黄瓜枯萎病菌有化感抑制作用,且化感作用强弱与浸提液的浓度有关。

西芹根际区物各浸提液对黄瓜枯萎病病菌化感抑制效果弱于西芹鲜根浸提液对黄瓜枯萎病病菌的抑制效果。

蒸馏水和乙醇浸提液对黄瓜枯萎病菌化感抑制效果最好,乙醚不适合做西芹根物质的浸提剂。

盆栽下西芹根物质对黄瓜植株生长和枯萎病病菌化感作用的研
究
本试验是利用西芹根物质(根提取物和根际区物提取物)对黄瓜植株形态指
标和枯萎病病菌的敏感指数来表明之间的化感作用。

在黄瓜幼苗第一片真叶展开且叶片横宽达到4cm时,及此后第3d、第5d用西芹根物质浸提液处理(灌根)黄
瓜幼苗,分别于处理后第5d、第10d和第18d测量黄瓜植株株高、茎粗和最大叶叶片横宽,且在最后1次测量后每株接种30ml浓度为4.0×106个孢子/ml的黄
瓜枯萎病病菌,观察化感作用。

主要结果如下:1.西芹鲜根水浸提液处理后黄瓜植株株高表现化感抑制作用;西芹根物质乙醇浸提液处理后黄瓜植株茎粗、最大叶叶片面积表现化感促进作用;西芹鲜根水浸提液处理后黄瓜植株茎粗、最大叶叶片面积,随处理浓度的增大化感促进作用逐渐转变为抑制作用,株高则随浓度的增大化感抑制作用增大。

2.西芹根际区物水浸提液处理后,在黄瓜植株株高、最大叶叶片面积上表现化感抑制作用,而黄瓜植株茎粗则表现化感促进作用;西芹根际区物浸提液处理后随浓度
的增大,对黄瓜植株茎粗的化感作用增大;且各处理随处理时间的延长,化感作用呈现减弱的趋势。

3.盆栽下西芹鲜根水浸提液处理黄瓜植株后对黄瓜枯萎病病菌有化感抑制
作用,经浓度为25%、18.75%和10%的鲜根水浸提液处理后化感效果分别为-0.145、-0.109和-0.0909;以空白水为对照,西芹鲜根乙醇浸提液处理后,对黄瓜枯萎病
病菌表现化感抑制作用,化感效果为-0.0909;以空白乙醇为对照,西芹鲜根乙醇
浸提液处理黄瓜植株后对黄瓜枯萎病病菌的化感效果(RI)为-0.123,表现化感抑制作用。