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最新七章吸光光度法Spectrophotometry

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第七章 吸光光度法 (1)

第七章 吸光光度法 (1)

2 一些基本名词和概念
吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小
A～ 关系
最大吸收波长 max：光吸收最大处的波长
Δ
对比度(Δ ):络合物最大吸 收波长( MRmax)与试剂最大 吸收波( Rmax)之差
max
吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同 波长光的吸光度不同。吸 光度最大处对应的波长称 为最大吸收波长λmax
ΔE=E2-E1=hν
不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级， 其能量差也不相同。仅当照射光光子提供的能量(hν)与被照物 质的基态与激发态能量之差ΔE相等时才能发生吸收。所以物 质对光的吸收具有选择性。
h
S3 S2
E3 E2 E1
A
S1
S0
纯电子能态 间跃迁
S2 h
E0
锐线光谱
A

光的互补
若两种不同颜色的单色光按一定的 强度比例混合得到白光，那么就称 这两种单色光为互补色光，这种现 象称为光的互补。

10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
105 cm
无 线 电 波
可
绿 蓝绿 绿蓝 蓝 红
2、化学反应引起的偏离 L-B中浓度(c) 应指吸光物质的平衡浓度， 即吸光型体的平衡浓度。 实际常用吸光物质的分析浓度。只有当平衡 浓度等于或正比于分析浓度时，其吸光度符合 比尔定律。但溶液中吸光物质常因缔合、离解、 互变异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的 相互作用等而形成新的化合物或改变吸光物质 浓度，这些都将导致偏离比尔定律。如

浙江大学分析化学 9 吸光光度法(070612)

浙江大学分析化学 9 吸光光度法(070612)

一、朗伯—比尔定律 当一束平行的单色光照射到有色溶液时，光的一部分将 被溶液吸收，一部分透过溶液。
设入射光强度为I0，透过光强度为I，溶液的浓度为c， 液层宽度为b，经实验表明它们之间有下列关系：
A= lg(I0/I) = abc
此式为朗伯—比尔定律 的数学表达式。
A= lg(I0/I) = abc
吸收曲线: 用不同波长的单色光照射， 测定吸光度，如果以波长 为横坐标，吸光度为纵坐 标即可得一条曲线称为吸 收曲线（如右图）。
设入射光强度为I0， 透过光强度为I
A= lg(I0/I)
1,10 邻二氮杂菲亜铁不同波长光的
吸光度不同。吸光度最大处对应的波 长称为最大吸收波长λmax （2）不同浓度的同一种物质， 其吸收曲线形状相似λmax不变；
朗伯—比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。例如 使用波长为b的复合光,由于1 和 2 处的k1和k2 不相同, 可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。
•A= lg(I0/I)=k cb
入射光总强度为I01+I02, 透射光总强度为I1+I2
k1= k2, A= k cb 成线性关系
物质颜色和吸收光的关系
物质颜色 吸收光颜色 吸收光波长/nm 黄绿 紫 400~450 黄 蓝 450~480 橙 绿蓝 480~490 紫 红 蓝绿 490~500 紫红 绿 500~560 紫 黄绿 560~580 蓝 蓝 黄 580~600 绿蓝 橙 600~650 蓝绿 红 650~780 青蓝
25.0 106 g 4 c 5.0010（g L1 ) 50.0 103 L
则根据朗伯—比尔定律 A=abc，
A 0.300 a 3.0010-2 L.g-1.cm1 bc 2.0cm 5.00104 g L1

吸光光度法

吸光光度法

(1)棱镜的色散
棱镜有玻璃和石英两种材料．它们的色散原理是依 据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不 同波长的光分开． 由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于 350 ~ 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域 内．石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 ~ 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三 个光 域．
目视比色法特点： 目视比色法的主要缺点是准确度不高，如 果待测液中存在第二种有色物质，甚至会 无法进行测定。 由于许多有色溶液颜色不稳定，标准系列 不能久存，经常需在测定时配制，比较麻 烦。 但设备简单，操作简便，比色管内液层厚 使观察颜色的灵敏度较高，且不要求有色 溶液严格服从比耳定律，因而它广泛应用 于准确度要求不高的常规分析中。
（2）光栅的色散
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用 于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有 良好的、几乎均匀一致的分辨能力．它具有色散波
1. 光色的互补关系
单色光； 复合光； 人眼能感觉到的光称为可见光（其波长范围大约 在400~750nm之间）。 日光、白炽灯光等可见光都是复合光。
如果把两种适当颜色的单色光按一定强度比例混 合后，就能得到白光。我们便称这两种单色光为 互补色光。
2. 物质对光的选择吸收

7.5目视比色与分光光度计
定义：用眼睛观察，比较待测 物质溶液颜色深浅以测定其含 量的方法 标准系列 应用： 准确度要求不高的中间 控制 限界分析：要求确定样品 中待测组分含量是否在规定的 最高含量限界以下 特点： 未知样品 1. 优点：仪器简单、操作方 便、适于大批样品的分析 2.缺点： 主观性大、准确度差
当一束白光（强度为I0 ）通过下列几种溶液，溶 液呈现的颜色和吸收光的关系如下图：

比色分析

比色分析
第三节 比色分析法实践
为了提高测定的灵敏度和准确度，减少分析误差，必须选择合适的反应条件和分析条 件。
A=-lgT=kbc
(7－5)
式7-5即为朗伯－比尔定律的数学表达式。它是分光光度法定量分析的依据。
其中k为吸光系数(absorptivity)。在溶液的组成量度c用mol⋅L-1，液层厚度b以cm为单位
时，则吸光系数称为摩尔吸光系数(molar absorptivity)，常用符号ε表示，其单位为L⋅mol-
人眼能感觉到的光的波长大约在400∼700nm之间，称为可见光。白光是一种混合光， 若将白光通过棱镜，便可分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等七种颜色的光。这种单一
波长的光叫单色光。各种单色光的近似波长范围如表7-2。 表7-2 各种色光的近似波长范围颜色λFra biblioteknm红
620∼760
橙
590∼620
黄
560∼590
光灯
棱镜
器
WFD－7型
国产751型分光光度计，是最早使用的分光光度计之一，其光学系统图如图7-6所示
。
图7-6 751型分光光度计光学系统立体图
由光源发出的连续辐射光线，射到聚光镜上，会聚后再经过平面镜转角90°，反射至 入射狭缝，由此入射到单色器内，狭缝正好位于球面准直镜的焦面上，当入射光经过准直 镜反射后就以一束平行光射向棱镜(该棱镜背面度铝)，光线进入棱镜后，进行散射，入射 角在最小偏向角，入射光在铝面上反射后是依原路稍偏转一个角度后反射回来。这样从棱 镜色散出来的光再经过准直镜反射后，就会聚集在出射狭缝上，出射狭缝和入射狭缝是一 体的。
单色光是很不容易得到的。它通常是包含一定波长范围的有限宽度的谱带。若所含的波长
范围越宽，则单色光越不纯。单色光不纯将导致吸收系数值改变，从而使测定结果发生偏

吸光光度法

吸光光度法

2．两组分吸收光谱部分重叠
λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Ca λ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Cb
1 测定， A1a＝1abC
2 测定A2ab,
Aab 2
A2a
A2b

2abCb2bC
3．两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定 解线性方程组法
解线性方程组法
步骤：
“复合光”，只是这种光的波长范围很窄而已，所以说，单色光并非是一条几何线。
A或
单一波长， 固定； 不同波长， 不同。
2
1
1 对应的 1较小 2 对应的 2较大
在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色光带来的影响，一般选用峰值波 长进行测定。
此外，选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。
T = 36.8 %
A = 0.434
I
I-dI
It
db b
Alg 1 Kcb T
T ： 透光率
A： 吸光度
1.0
100
T
A
0.5
50
A T%
0
0
C
2、朗伯-比尔定律的前提条件
（1）入射光为单色光 （2）吸收发生在均匀介质中（无散射） （3）吸光质点间无相互作用
3、吸光系数 Absorptivity
1 测定 1a和1b；A1ab 2 测定 a2和b2；A2ab
A 1 a b A 1 a A 1 b 1 a b C a 1 b b C b
A 2 a b A 2 a A 2 b a 2 b C a b 2 b C b 为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。
解联立方程，可求得Ca, Cb
入射光 I0

吸光光度法Absorptionphotometry

吸光光度法Absorptionphotometry
吸收光谱
不同物质具有不同的吸收光谱，每种物质都有其 独特的吸收特征。
光谱分析
通过分析物质的光谱，可以确定其组成和浓度。
光的吸收与吸收光谱
光的吸收
当光通过介质时，某些波长的光会被介质吸收， 其余的光则通过。
吸收光谱
不同物质具有不同的吸收光谱，每种物质都有其 独特的吸收特征。
光谱分析
通过分析物质的光谱，可以确定其组成和浓度。
有机物分析
对于一些有机物，如酚类、胺类、苯 甲酸等，吸光光度法可用于测定其浓 度，通过在特定波长下测量溶液的吸 光度值，可推算出有机物的含量。
在化学分析中的应用
金属离子检测
吸光光度法可用于检测水样、土壤、 食品等样品中的重金属离子，如铜、 铅、锌等，通过测定特定波长下的吸 光度值，可计算出金属离子的浓度。
未来发展方向与展望
提高准确度和精密度
通过改进实验方法和仪器设备，提高吸光光度法的准确度和精密 度。
拓展应用领域
进一步拓展吸光光度法的应用领域，特别是在新兴领域如生物医学、 环境监测和食品安全等方面的应用。
发展新方法和技术
结合其他技术如光谱技术、色谱技术等，发展新的吸光光度法方法 和仪器，提高检测效率和准确性。
01
准备标准溶液和待测样 品，配制适当的缓冲溶 液。
02
将比色皿放入分光光度 计中，调整波长至所需 测量波长。
03
分别将参比溶液和待测 溶液倒入比色皿中，记 录吸光度值。
04
根据标准曲线计算待测 样品的浓度。
实验步骤与操作流程
01
准备标准溶液和待测样 品，配制适当的缓冲溶 液。
02
将比色皿放入分光光度 计中，调整波长至所需 测量波长。
在环境监测中的应用

第7章吸光光度法


19.7.21
31
有机显色剂:
生色团（生色团） 能吸收紫外-可见光的基团 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团产生
n→ π*跃迁和π→ π*跃迁, 跃迁E较低
－N＝N－，－N＝O，
O
C=S,－N
O
（共轭双键）πe
注：当出现几个生色团共轭，则几个生色团所产生的 吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长 将比单个生色团的吸收波长长，强度也增强
注：一般可用空白对比校正消除
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45
二、化学因素
浓度过高，吸光质点之间作用 改变 化学反应,浓度发生变化 以C代替平衡浓度 解离 络合 使C与平衡浓度的正比关系破坏 缔合
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46
三、干扰及消除
1.干扰情况： 干扰物质本身有颜色 干扰物质与显色剂反应有吸收 干扰物质与显色剂反应虽没吸收，但消耗显色 剂 干扰物质生成沉淀
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15
A,T,C之间的关系
A = lg (I0/It)
A = lg(1/T)
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16
吸光度(A)、透光率(T)与浓度(c)的关系
A
T
T = 10-kbc
A=kbc
线性关系
c
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17
二、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度
1.摩尔吸光系数： : L·mol-1·cm-1
单色光的装置。 棱镜:玻璃350 ～ 3200 nm, 石英185 ～ 4000 nm 光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便
19.7.21
24
单色器
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同
白光 入射狭缝 准直透镜

吸光光度法及722 型分光光度计的使用

吸光光度法及722 型分光光度计的使用一：吸光光度法基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法。

（一）光线：光线的波长：200nm-400nm 紫外线*400-750nm可见光*>750nm 红外线光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。

（二）物质的吸收光谱及颜色：1．物质的原子吸收光谱和原子发射光谱：原子的最外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱。

激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，形成原子发射光谱。

不同的溶液其光谱不同，即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同，对某一特定波长的光存在吸收峰。

2．可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成，当可见光穿过某一溶液时，由于特定波长的光被吸收而使溶液呈现相应的颜色。

（如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光(600nm)而成蓝色）不同颜色的溶液对不同波长的光其吸收能力不同。

（三）光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：一束平行单色光（Io）通过有色的透明溶液时，一部分的光可以透过溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,还有一部分被器皿表面反射（Ir）,则：Io=It+Ia+Ir 。

那么，该溶液透光率为: T = It / Io 。

1．Lambert 定律：设有一束平行单色光,通过液层厚度为b 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2bk2 为吸光系数，为常数。

与入射光波长、溶液性质、浓度和温度有关；A 为吸光度（又称光密度O.D 或消光度E），当入射光波长、吸光溶液的浓度和温度一定时，A 与b 成正比。

2．Beer 定律：设有一束平行单色光,通过浓度为c 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k4ck2 为常数。

由Beer 定律可知：当入射光波长、吸光溶液的厚度和温度一定时，A 与c 成正比。

吸光光度分析法Spectrophotometry


常数。
在生物学研究中的应用
蛋白质测定
吸光光度法是测定蛋白质含量的常用方法之一。通过测定 蛋白质溶液在紫外区的吸光度，可以计算出蛋白质的浓度。 该方法具有操作简便、准确度高的优点。
DNA和RNA定量
吸光光度法可以用于DNA和RNA的定量分析。通过测定 DNA或RNA在特定波长下的吸光度，可以计算出其浓度 和纯度，从而进行定量分析。
智能化与自动化
自动化检测系统
在线监测与远程监控
自动化检测系统可实现样品自动进样、 自动检测和自动处理等功能，提高检 测效率。
在线监测和远程监控技术可实现实时 监测和远程控制，提高监测效率和准 确性。
智能算法与软件
智能算法和软件的应用可实现光谱数 据的自动处理、分析和解释，提高检 测准确度。
06
结论
04
吸光光度分析法的优缺点
优点
高灵敏度
吸光光度分析法具有较高的灵敏 度，能够检测低浓度的物质，尤
其在痕量分析中表现出色。
操作简便
该方法操作简便，实验过程相 对简单，易于实现自动化和标 准化。
应用广泛
吸光光度分析法适用于多种不 同类型样品的分析，如水、土 壤、生物体等。
成本较低
该方法所需的仪器设备和试剂 相对便宜，降低了分析成本。
微型化与便携化
01
02
03
便携式光谱仪
便携式光谱仪可方便地携 带至现场进行快速检测， 具有操作简便、结果准确 等优点。
手持式光谱仪
手持式光谱仪可直接手持 操作，方便快捷，可广泛 应用于环境监测、食品安 全等领域。
微型化检测器
微型化检测器具有体积小、 重量轻、功耗低等优点， 可应用于便携式仪器和微 型化仪器中。

7 吸光光度法


0.20
0.10 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10 mg/mL
32
7.2 光吸收基本定律
朗伯-比尔定律的适用条件
1. 单色光
应选用max处或肩峰处测定。
2. 吸光质点形式不变
离解、络合、缔合会破坏线性关系
应控制条件(酸度、浓度、介质等)。 3. 稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强。
33
7.3 吸光光度法的仪器
玻璃或石英
4. 检测器(detector)：
5.显示装置
38
7.3 吸光光度法的仪器
分光光度计类型
单波长单光束
单波长双光束
39
电管或光电倍增管 入射光单色性强、灵 敏度高、准确度好。
方法比较 分光装置 检测系统 特点
目视比色法 无 肉眼
36
7.3 吸光光度法的仪器
分光光度计型号
S22PC
NV202
SP-2102UVPC 722型
37
7.3 吸光光度法的仪器
分光光度计部件
1. 光源(Light source)：
可见光区：钨灯，碘钨灯（320 ～ 2500 nm）
2. 单色器(monochromator)：棱镜或光栅
3. 比色皿(cuvette)：
26
A abc
摩尔吸光系数：
A bc
关系： ＝ M a
例 1

50mL 比 色 管 中 ， 加 入 含 有 0.025mg的 Fe2+溶液，加入邻二氮菲显色剂，用水 稀释至50mL，用2cm比色池，在分光光 度计上测得吸光度 A=0.190 ，计算摩尔 吸光系数 ？
A 0.190 1.1104 (L mol-1 cm1 ) bc 2 0.025 55.85 50
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* 含有多种吸光物质的溶液，由于各吸光物质对 某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光物 质的吸光质点之间相互不发生化学反应，当某 一波长的单色光通过这样一种含有多种吸光物 质的溶液时，溶液的总吸光度应等于各吸光物 质的吸光度之和。这一规律称吸光度的加和性。
为透射比或透光度，用T表示溶液的透 射比愈大，表示它对光的吸收愈小;相反， 透射比愈小，表示它对光的吸收愈大。
T It I0
7.1 概述
朗伯(Lambert J H)和比尔(Beer A)分别 于1760和1852年研究了光的吸收与溶液层的 厚度及溶液浓度的定量关系，二者结合称为
朗伯-比尔定律，也称为光的吸收定律。
* 复合光（multiplex light）：由不同波长组成的光。
* 紫外光（ultraviolet light）：波长200~400 nm。
* 可见光（visible light）：人眼能感觉到的光，波
长在400~750 nm。它是由红、橙、黄、绿、青、 蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的
* 波段（wave band）：各种色光的波长范围不同。
当一束强度为I0的平行单色光垂直照射到长 度为b的液层、浓度为c的溶液时，由于溶液
中吸光质点(分子或离子)的吸收，通过溶液后
光的强度减弱为I：
AlgIo Kbc AlgIo lg1
I
IT
7.1 概述
* 朗伯-比尔定律表明：当一束单色光通过含有
吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质 的浓度及吸收层厚度成正比。这是进行定量分 析的理论基础。比例常数K与吸光物质的性质、 入射光波长及温度等因素有关。
进 入 夏 天 ，少 不了一 个热字 当头， 电扇空 调陆续 登场， 每逢此 时，总 会想起 那 一 把 蒲 扇 。蒲扇 ，是记 忆中的 农村， 夏季经 常用的 一件物 品。 记 忆 中 的故 乡 ， 每 逢 进 入夏天 ，集市 上最常 见的便 是蒲扇 、凉席 ，不论 男女老 少，个 个手持 一 把 ， 忽 闪 忽闪个 不停， 嘴里叨 叨着“ 怎么这 么热” ，于是 三五成 群，聚 在大树 下 ， 或 站 着 ，或随 即坐在 石头上 ，手持 那把扇 子，边 唠嗑边 乘凉。 孩子们 却在周 围 跑 跑 跳 跳 ，热得 满头大 汗，不 时听到 “强子 ，别跑 了，快 来我给 你扇扇 ”。孩 子 们 才 不 听 这一套 ，跑个 没完， 直到累 气喘吁 吁，这 才一跑 一踮地 围过了 ，这时 母 亲总是 ，好似 生气的 样子， 边扇边 训，“ 你看热 的，跑 什么？ ”此时 这把蒲 扇， 是 那 么 凉 快 ，那么 的温馨 幸福， 有母亲 的味道 ！ 蒲 扇 是 中 国传 统工艺 品，在 我 国 已 有 三 千年多 年的历 史。取 材于棕 榈树， 制作简 单，方 便携带 ，且蒲 扇的表 面 光 滑 ， 因 而，古 人常会 在上面 作画。 古有棕 扇、葵 扇、蒲 扇、蕉 扇诸名 ，实即 今 日 的 蒲 扇 ，江浙 称之为 芭蕉扇 。六七 十年代 ，人们 最常用 的就是 这种， 似圆非 圆 ， 轻 巧 又 便宜的 蒲扇。 蒲 扇 流 传 至今， 我的记 忆中， 它跨越 了半个 世纪， 也 走 过 了 我 们的半 个人生 的轨迹 ，携带 着特有 的念想 ，一年 年，一 天天， 流向长
I0 ' IaItIr
7.1 概述
在吸光光度分析法中，试液和空白溶 液分别置于同样质料及厚度的吸收池中， 然后让强度为I‘0的单色光分别通过这两个 吸收池，再测量其透过光的强度。此时反 射光强度基本上是不变的，且其影响可以 相互抵消。
I0' IaIt
7.1 概述
透射比或透光度 （Transmittance） 透 过 光 强 度 It 与 人 射 光 强 度 Io 之 比 称
吸收程度最大处的波长，用λmax表示
* 吸光度（absorbance）
在可见光，KMnO4溶液 对波长525 nm附近绿色光 的吸收最强，而对紫色和 红色的吸收很弱。λmax= 525 nm。浓度不同时， 光吸收曲线形状相同， λmax不变，吸光度不同。
7.1 概述
（4）目视比色法(colorimetry)和吸光光度法 的特点
蓝 绿蓝 蓝绿
绿 黄绿
黄 橙
450~480 480~490 490~500 500~560 560~580 580~600 600~650 650~750
蓝绿
红
7.1 概述
* 吸收光谱曲线或光吸收曲线（ absorption curve）： 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。
* 最大吸收波长（maximum absorption wavelengh ）：光
d 仪器简单、操作简便、快速。
7.1 概述
2 光吸收的基本定律
(1) 朗伯-比尔定律 （Lambert-Beer law） 当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固
体、液体或气体介质时，一部分被吸收，一部分 透过介质，一部分被器皿的表面反射。如图6-3所 示，设人射光强度为I'0，吸收光强度为Ia，透过光 强度为It，反射光强度为Ir。
长 的 时 间 隧 道，袅
七章吸光光度法Spectrophotometr
第七章 吸光光度法 Spectrophotometry
思考题
1 光度分析法的误差来源? 2 如何设计光度分析法？ 3 光度分析法的仪器特点？
7.1 概述
* 单色光（monochromat源自c light）：具同一波长的光。
* 互补色光（complementary color light）：按一 定比例混合，得到白光（white light）。
* 物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性 吸收作用而产生的。
7.1 概述
表6-2 物质颜色和吸收颜色的关系
物质颜色
吸收光
颜色
波长范围λ/nm
黄绿
紫
400~450
黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝
a 灵敏度高。常用于测定试样中质量分数为 1%~10-5的微量组分，甚至可测定低至质量分数为 10-6~10-8的痕量组分。
b 准确度较高。目视比色法的相对误差为 5%~10%，吸光光度法为2%~5%。
c 应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化 合物都可以直接或间接地用目视比色法或吸光光 度法进行测定。