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分光度光度法分光光度法学习资料一、分光光度法的基本概念1. 定义- 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
它利用物质对光的选择性吸收特性，不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长的光有不同程度的吸收。
2. 原理基础- 朗伯 - 比尔定律（Lambert - Beer law）是分光光度法的基本定律。
- 朗伯定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与光通过的路径长度成正比，即A = k_1b（其中A为吸光度，b为光程长度，k_1为比例常数）。
- 比尔定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与吸光物质的浓度成正比，即A = k_2c（其中c为吸光物质的浓度，k_2为比例常数）。
- 合并朗伯定律和比尔定律得到朗伯 - 比尔定律：A=varepsilon bc，其中varepsilon为摩尔吸光系数，单位为L/(mol· cm)，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力，varepsilon越大，表明该物质对该波长光的吸收能力越强。
二、分光光度计的结构与组成1. 光源- 提供足够强度和稳定的连续光谱。
在可见光区常用钨灯或卤钨灯，其发射光的波长范围为320 - 2500nm；在紫外光区常用氢灯或氘灯，发射光的波长范围为180 - 375nm。
2. 单色器- 它的作用是将光源发出的复合光分解为单色光。
主要部件包括狭缝、准直镜和色散元件（如棱镜或光栅）。
通过调节狭缝宽度可以控制出射光的带宽和光强。
3. 样品池- 用于盛放被测溶液。
在可见光区可以使用玻璃样品池，而在紫外光区则需使用石英样品池，因为玻璃对紫外光有吸收。
4. 检测器- 检测透过样品池后的光强，并将光信号转换为电信号。
常见的检测器有光电管和光电倍增管等。
光电倍增管具有更高的灵敏度，可检测微弱的光信号。
5. 信号显示与处理系统- 将检测器输出的电信号进行放大、处理，并以吸光度或透光率等形式显示出来。
分光光度法原理
分光光度法是一种利用物质对特定波长的光吸收特性进行分析和测定的方法。
该方法利用了物质对特定波长光的吸收现象，通过测量光线通过样品溶液后的光强度的差异来分析溶液中物质的含量或浓度。
分光光度法的原理基于比尔－朗伯定律，该定律认为物质对光的吸收量与光通过物质的路径长度和物质溶液中物质的摩尔浓度成正比。
根据比尔－朗伯定律，光的吸收量与样品中物质的浓度存在线性关系。
通过测量样品溶液对特定波长光的吸收强度，可以推断出溶液中物质的浓度。
分光光度法的实验步骤一般包括以下几个方面：首先，选择适合的波长进行测量，波长的选择要使得被测物质对光的吸收峰值较大；其次，通过一束光线照射样品溶液，光线经过溶液后，通过一个光电传感器测量光线透过样品溶液后的强度；然后，将测得的光强度与参比溶液的光强度（即溶液中被测物质浓度为零时的光强度）进行比较，得到样品溶液中被测物质的浓度；最后，根据相关的浓度与光吸光度定量关系，计算出样品溶液中被测物质的精确浓度。
分光光度法具有灵敏度高、测量范围广、操作简便等优点。
由于可以选择不同波长的光进行测量，在不同波长下对不同物质的测量具有选择性。
这使得分光光度法在许多领域中被广泛应用，如生物化学、药学、环境科学等。
分光光度法的基本原理
分光光度法是一种常用于分析、确定物质浓度的方法。
其基本原理是将待测物质溶液通过一束光束，然后通过光学系统使光束分成两部分，分别通过样品液和对照液，最终两束光束再重合形成一个荧光强度差。
待测物质会对入射光束进行吸收，导致出射光束的强度减弱，而对照液不会对光束产生吸收作用，出射光束强度不变。
通过测量两束光的强度差异，可以推断待测物质的浓度。
分光光度法使用光栅或棱镜使入射光束通过色散，然后通过滤光片选择特定波长的光，再通过样品液和对照液后，出射光会被光电池或光电二极管接收，转化为电信号。
根据输出的电信号强度，可以计算出待测物质的浓度。
分光光度法的优点是测量精度高、灵敏度高、操作简便。
它可以在高浓度样品中进行测量，可以使用各种波长的光来进行分析。
然而，它也存在一些限制，例如对色散（波长漂移）的影响比较大，需要定期校准光谱仪器。
此外，分光光度法对于有色物质的测量更准确，对于无色物质的测量精度较低。
第七章分光光度法分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
（在选定波长下，被测定溶液对光的吸收程度与溶液中吸光组分的浓度有简单的定量关系）。
根据被利用的光波长范围可分为可见、紫外、红外光谱法。
利用可见光进行分光光度分析时，通常将被测定组分通过化学反应转变成有色化合物，然后进行吸光度的测量。
因此分光光度法在一定意义上使用着比色法，吸光光度法等名词，本章重点讨论可见分光光度法。
一、分光光度法（一）光的基本性质光是电磁波。
其波长范围很广，如果以波长或频率为序排列可得到如下电磁波谱图。
光谱名称波长范围跃迁类型分析方法X—射线远紫外光近紫外光可见光近紫外光中红外光远红外光微波无线电波0.1—10nm10—200nm200—400nm400—760nm0.76—2.5μm2.5—5.0μm500—1000μm0.1—100cm1—1000mK.L层电子中层电子价电子分子振动分子振动和低位转动分子振动X—射线光谱法真空紫外光度法紫外可见光度法比色可见光度法近红外光谱法中红外光谱法远红外光谱法微波光谱法核磁共振光谱法光有微粒二象性，波动性是指光按波的形式传播。
如光的折射、衍射、偏振和干涉等，光的波长λ，频率γ与速度c的关系为：λγ=c式中λ以cm表示，γ以Hz表示，c为光速2.7979×1010cm/s（真空中）光同时又具有粒子性，如电效应就明显地表现其粒子性。
光是由“光微粒子”（光量子或光子）组成的，光量子的能量可表示为γhE=h为普朗克常数6.6262×10-34J.S可见上式把光的波粒两相性用h统一起来了。
结论：不同波长（或频率）的光，其能量不同，短波的能量大，长波的能量小。
（二）物质对光的吸收吸收光谱有原子吸收光谱和分子吸收光谱。
原子吸收光谱是由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波而引起的。
原子吸收分光光度法就是根据原子的这种性质所引起来的。
分子吸收光谱比较复杂。
这是由分子结构的复杂性引起的，在同一电子能级中有几个振动能级，而在同一振动能级中又有几个转动能级，电子能级之间的能量差一般为1~20电子伏特。
因此，电子能级跃迁而产生的吸收光谱，位于紫外-可见光部分。
这种又价电子跃迁而产生的分光光谱称为电子光谱。
在电子能级变化时，不可避免地也伴随着分子振动和转动能级的变化，因此，分子的电子光谱通常比原子的线状光谱复杂的多，呈带状光谱。
如果用近红外线（1~0.05ev ）激发分子，则不是以引起电子能级的跃迁，而只能引起分子振动能级（1~0.05ev ）和转动能级（<0.05ev ）的跃迁，这样得到的光谱称为振动-转动光谱或红外吸收光谱。
各种物质的分子对红外光的选择性吸收与其分子的结构密切相关。
各种色光按一定比例混合而成的，各种色光的波长范围不同。
物质的颜色正是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的，物质对光吸收的特征更清楚的描述吸收曲线（吸收光谱）物质不同，内部结构不同，吸收光谱不同。
CuSO 4溶液 兰色 吸收互补色 黄色KMnO 4溶液 紫红 吸收互补色 黄绿（三）比色与分光光度法的特点1、可以测定试样中的微粒组分2、灵敏度高，准确度高。
（相对微粒组分测定比色5~10%，分光光度法2~5%）3、应用广泛，水质（环境）药品。
食品中的标准测定方法。
4、简便快速，设备不繁。
二、吸收的基本定律（一）朗伯—比耳定律当一束平行单色光通过任何均匀，非散射的固体、液体或气体介质时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。
设入射光强度为Io',吸收光强度为Ia ，透过光强度为It ，反射光度为IrIo'=Ia + It + Ir + Id 散射光强度Id在吸光光度分析中，通常将试液和空的溶液分别置于同样质料及厚度的吸收池中，然后让强度为Io'的单色光分别通过这两个吸收池，在测量其透过光的强度。
此时，反射光强度基本上是不变的，且影响可以相互抵消，故上式可简化为：Io=Ia+ It （散射光强度亦如此）T I I ot = 透光率或透光度 温度升高，溶液对光的吸收强度下降 实践证明，溶液对光的吸收程度，与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有关，若入一定，则A 只与b 、c 有关。
朗伯（1760）比耳（1852）研究了光的吸收与溶液液层的厚度b 及溶液浓度c 的定量关系：A=Kbc ①T TA I I o lg 1log lg -=== ② 朗伯—比耳定律的数学表达式。
(Lambert —Beer Law)它表明：当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正比。
它是进行光谱定量分析额理论基础。
式中比例常数K ，与吸光物质的性质，入射光波长及温度等因素有关。
（二）吸光系数和摩尔吸光系数1、上式①中 c 单位 g/L b 单位 cm 时K=a 称为吸光系数 L.g-1.cm-1 A=abc2、上式①中 c 单位 mol/L b 单位 cm 时K=ε 称为摩尔吸光系数 L.mol-1.cm-1 A=εbc所以，ε表示吸光度质点的浓度为1mol/L,溶液厚度为1cm 时，溶液对光的吸收能力。
不能直接测量。
需要计算求得。
Ε的无力意义：当吸光物质浓度为1mol/L,吸收池厚度为1cm ，以一定波长的光通过时，所获得的吸光度值A 。
ε值取决于入射光的波长和吸光物质的特性，也受溶剂和温度的影响，ε值反映了方法的灵敏度，它与仪器质量有关，但主要与吸收光的波长有关。
【例题】浓度为0.05mg/L 的Fe 2+溶液，与1.10一邻二氢杂菲显色反应后生成橙红色配合物，在508nm 波长处用2cm 比色皿进行测定，得到T=50%，求得配合物（1.10一邻二氢杂菲亚铁）（Fe 的质量55.85）的a 和ε。
解 30.02lg 21lg lg ==-=-=T A 114cm ..300100.5230.0---=⨯⨯==g L bc A a 114..107.130085.55--⨯=⨯==cm mol L Ma ε上式计算时注意单位和有效数字。
（三）偏离朗伯—比耳定量的因素根据朗伯—比耳定率，当吸收池厚度保持不变，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过坐标原点的直线。
但是实际工作中，常常遇到偏差线性关系的现象，即曲线向下负偏离和向上正偏离。
造成这些现象原因很多，可以分为物理方面因素和化学方面因素。
1、物理因素（1）单色光不纯所引起的偏离在光度分析仪中，使用的是连续光源，用单色器分光，用狭缝控制光谱带的宽度，因而投射到吸收溶液中的入射光，常常是一个有限宽度的光谱带，二不是真正的单色光。
由于非常单色光使吸收光谱的分辨率下降，因而导致对朗— 比耳定律偏离。
入射光的纯度与仪器质量有关。
性能好的分光光度计，其所用入射光的波长范围较窄即“单色光”的纯度高。
因此，用这种分光光度计进行测量，较之用简易型分光光度计或电比色计进行测量所得标准曲线的线性范围要窄，即偏离朗伯—比耳定率的程度要小。
入射光波长的选择，对偏离朗伯—比耳定律的程度常有影响，在实际工作中，通常选择吸光物质的最大吸收波长m λ的光为入射光，这样，不仅保证测定有较高的灵敏度，而且由于此处的吸收曲线较平坦，21εε和相差不大，故偏离朗伯—比耳定律的程度是较小的。
（2）非平行光或入射光散射引起的偏离若入射光不垂直通过吸收池，就使通过吸收溶液的实际光程大于吸收池的厚度，这种影响较小。
有时溶液中存在胶粒或不溶性悬浮微粒时，使一部分入射光产生散射，实测吸光度增大，因而导致偏离朗伯—比耳定律。
2化学因素即溶液中的化学反应引起的偏离。
溶液中的吸光物质常因离解、缔合形成新的化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度。
因而导致偏离朗伯—比耳定律。
例如：K 2CrO 7溶液中有下列平衡Cr 2O 72- + H 2O = 2HCrO 4- = 2H + + 2CrO 42-橙 黄溶液中Cr 2O 72-及CrO 42-(或HCrO 4-)的相对浓度，与溶液的稀释程度及酸度有关。
对于K 2Cr 2O 7的中性水溶液，当加水稀释后，由于离解溶液中Cr 2O 72-相对溶液必须逐渐减小，而CrO 42-的相对浓度逐渐增大。
测定K 2Cr 2O 7溶液的吸光度时，如果于波长350nm 处进行测量，则随着K 2Cr 2O 7溶液浓度的增大，其中CrO 42-的相对浓度越来越小，而CrO 42-所产生的吸光度较Cr 2O 72-产生的吸光度为大，其结构将导致标准曲线向下弯曲。
很明显，如果于等吸收碘波长445nm 处进行测量，尽管存在离解平衡。
也不会发生偏离朗伯—比耳定律的情况。
三、比色仪和分光光度计（一）目视比色法—标准比色管用肉眼观察，比较溶液颜色深浅以确定物质含量的方法。
才用标准系列溶液方法。
原理是要透过光强度相等时，则两个比色管中的溶液相等。
bc A II o ε==lg bc o I I ε-=∴10 11110c b o I I ε-=标准液 颜色深度相同时，则 I 标准液=I 测试液 22210c b o I I ε-=测试液 222111c b c b εε=∴由于标准系列与试液都是在相同条件下显色的，且是同一种显色物质，所以21εε=，又因为液层厚度相等b 1=b 2则c 1=c 2。
【特点】1、简单，适用大批试样分析。
2、稀溶液中微量物质的测定。
3、可在复合光下进行，某些显色反应不符合朗伯—比耳定律仍然可用。
4、准确度较差，相对误差5~20%。
（二）光电比色法—581-G 光电比色计1、概述：借助于光电比色计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制标准工作曲线，然后根据被测试液的吸光度，从标准工作曲线上得到被测物质的浓度或含量。
它与目视比色法在原理上并不相同，前者比较吸收，后者比较透过。
但是，①光电池代替人肉眼，提高了准确度。
②当有某些有色物质共存时，可以采用适当的滤光片或适当的参比溶液来消除干扰，选择性提高。
2、581—G 光电比色计①光源：6~12V 钨丝灯，配有稳压装置聚光镜使其成为平行光②滤光片：从光源出发的连续光谱中分出某一波长范围的光作为吸光光度法的光源，理论上纯度越高越好，但纯度太高时，其强度就会太小，难以准确进行测量，一般允许一定波长范围是60nm,如测定470nm 则440nm~500nm 兰光透过（光谱半宽度）光谱半宽度越小，透过的单色光就越纯。
测定时，滤光片透光率最大的光，应该就是被测定有色试液吸收最大的光。
即：滤光片的颜色与被测液颜色成互补色。
③比色皿：无色透明，能耐腐蚀性的玻璃或石英制成。
同样厚度的比色皿之间透光率相差应小于0.5%,要干净。
④光电池：“疲劳”现象，光电池收强光照射或连续使用的时间太长时，光电流很快升至一较高值，然后逐渐下降，此时应暂停使用，置于暗处，使之恢复原来的灵敏度。
