碱裂解法大量提取质粒DNA

碱裂解法提取质粒DNA的研究碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。

该方法通过将大肠杆菌等细菌细胞进行碱性处理，使其细胞壁溶解，并释放出质粒DNA。

以下是对碱裂解法提取质粒DNA的研究进行详细介绍。

首先，进行实验前的准备工作。

实验材料包括大肠杆菌含质粒的培养液，碱性裂解液，中和液，以及一些常规实验室工具。

准备条件优化的培养基，如Luria-Bertani培养基，以获得高质量的质粒DNA。

将培养的大肠杆菌细胞进行离心，取得细菌细胞的沉淀，并将其重悬于适量的碱性裂解液中。

碱性裂解液的配制对提取质粒DNA的质量具有重要影响。

通常，碱性裂解液包括Tris-HCl缓冲液（pH 8.0-8.5）、EDTA （0.1M，pH 8.0）以及SDS（0.5%-1.0%）。

在碱性裂解液中，细胞壁受到破坏，并且其中的DNA被释放出来。

为了进一步提取质粒DNA，需要添加RNase A（最终浓度为20μg/mL）来降解细胞中的RNA。

此外，可以根据需要添加蛋白酶K（最终浓度为100μg/mL）来去除大部分的蛋白质。

接下来，使用酒精沉淀法来纯化质粒DNA。

首先，加入等体积的冰冷异丙醇，使DNA和异丙醇充分混合，然后进行离心。

在高速离心后，离心管底部会形成一个白色的DNA沉淀。

利用移液枪将上层液体倒掉，然后用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，移液枪将乙醇沉淀洗涤掉。

最后，利用离心机将样品离心至全速，将乙醇溶液除去，并风干沉淀。

最后，使用合适的缓冲液溶解DNA，以达到所需的浓度。

为了确定提取的质粒DNA的纯度和浓度，可以使用紫外光谱仪来测定其260nm和280nm的吸光度比值。

这个比值可用于评估质粒DNA中的蛋白质污染情况。

如果蛋白质污染特别严重，可以使用氯仿、酒精沉淀等方法进行进一步清除。

此外，还可以使用琼脂糖凝胶电泳来检测提取的质粒DNA的大小和完整性。

通过比较不同样品的DNA迁移位置，可以快速确定质粒DNA的大小。

总结：碱裂解法是一种非常常用且简单的提取质粒DNA的方法。

碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。

以下是具体的实验原理和操作步骤。

实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。

接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。

最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。

操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。

在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。

2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。

使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。

将上清液倒掉，保留菌体沉淀。

3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。

轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。

4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。

这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。

5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。

上清液中含有蛋白质和其他污染物。

6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。

7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。

将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。

8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。

9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。

注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。

2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。

3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。

4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。

总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。

质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。

）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。

保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。

）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。

注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。

b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。

3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。

注：最后菌液的OD600值应为0.4。

由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。

4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。

注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。

碱裂解法大量制备质粒DNA所需试剂：溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌15min，贮存于4℃。

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释) 1％SDS 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。

于室温放置5-10分钟。

当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。

为防止NaOH接触空气中的CO2使溶液发生反应，所以要现用现配。

溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml 冰乙酸11.5ml 水28.5ml。

所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。

RNA酶：将RNA酶粉剂100mg溶于10mMTris-CI(pH:7.5)，15mMNaCI中，定容至10ml，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

实验步骤：（1）将大肠杆菌菌株涂抹于含50μl/ml卡那霉素的LA平板上，37℃条件下培养过夜。

（2）取一单菌落于3ml液体LB培养基(含50ug/ml卡那霉素)，37℃，220rpm/min培养过夜。

（3）从过夜培养液中取lml加入到1000ml的液体LB培养基(含50ug/ml卡那霉素)中，37℃，220rpm/min，培养约8个小时。

（4）将菌液分装到50ml离心管中，10000rmin/min 离心30s,收集培养物中的菌体, 尽量弃尽上清, 重复此操作2-3次，收集一定菌液；（5）加入10ml溶液Ｉ（含1％RNA酶），在涡旋器上使菌体充分重悬; 或用微量移液器混匀；（6）加入10ml 溶液Ⅱ，立即将离心管缓慢颠倒数3- 5 次直到溶液变澄清，冰浴2min；（7）加入10ml溶液Ⅲ,缓慢颠倒离心管3- 5 次直至白色絮状物充分形成, 冰浴2min;（8）12000rpm/min 离心10min后将上清转入另一管中,分装成两管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），在室温下4000 rpm/min离心10min。

碱裂解法提取质粒DNA溶液 I ： 50 mM Glu / 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA （pH 8.0）；重悬菌体，供应缓冲环境。

（pH 很重要）。

葡萄糖：最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，增加粘稠度，削减 摇摆时对DNA 的机械剪切力。

如缺了葡萄糖对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

所以 说溶液I 中葡萄糖是可缺的。

EDTA ：它是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在分子生物学试剂中的主要作用是抑制 DNase 的活性和抑制微生物生长。

在溶液1中加入高达10 mM 的EDTA,就是要把E.coli 细胞中 的全部二价金属离子都螯合掉。

若不加EDTA,只要是在短时间里完成质粒抽提，也不怕DNA 会快速被降解，由于最终溶解质粒的TE 缓冲液中有EDTA 。

假如哪天你手上正好缺了溶液I,只要用等体积的水，或LB 培育基来悬浮菌体就可以了。

留 意菌体肯定要悬浮匀称，不能有结块。

NaOH ：用新奇的NaOH,是为了保证NaOH 没有汲取空气中的CO2而减弱了碱性。

裂解细 胞的主要是碱，而不是SDS,所以才叫碱法抽提。

NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠 杆菌还是哺乳动物细胞，遇到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双 层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。

用了不新奇的NaOH,即便有SDS 也无法有 效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。

只用SDS 也能抽提得到少量质粒，由于SDS 也是弱碱。

加SDS 是为下一步操作做铺垫。

留意：一，时间不能过长,在这样的碱性条件下基因组DNA 片断会渐渐断裂；二，必需温 顺混合,不然基因组DNA 也会断裂。

溶液III ： 3M KAc∕2M HAc o 加入后就会有大量的沉淀消失，与SDS 的加入有关系。

假如在溶液II 中不加SDS 时也会有很少量的沉淀，明显是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。

实验一碱裂解法抽提质粒DNA[实验原理]质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。

宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。

质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。

质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。

制备质粒载体是分子生物学的常规技术。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

[实验目的]1、掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。

2、掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。

[实验步骤]1、试剂配制（1）LB培养液10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。

碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。

碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

）细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。

下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。

溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。

下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。

2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。

3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。

通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。

4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。

5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。

6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。

7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。

8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。

9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。

10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。

11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。

12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。

实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。

质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。

质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。

一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。

二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。

在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。

通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。

在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。

通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。

三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。

2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。

3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。

4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。

5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。

6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。

7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。

8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。

9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。

10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。

四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。

通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。

2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。