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不同抗原修复液和固定时间对免疫组化结果的影响【摘要】目的针对不同的抗原修复液与时间对免疫组化所产生的影响进行探讨。
方法取出26例乳腺浸润性导管癌标本试样。
其中的每例中附着4个时间点，这四个时间点组分别为：立即固定组，延迟12小时固定组，延迟24小时固定组和延迟48小时固定组。
依次对所选取4块肿瘤组织，在肿块部位进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片等相关操作，利用行he染色方法验证试验中的肿瘤组织，再通过抗原修复液展开免疫组化验证实验。
结果ck7、er和c-erbb-2在4组试样在不等的时间和不同的抗原修复液的乳癌组织间表现出了不同的效果，并且结果的差异可以从统计学角度进行分析。
结论在本实验中，所进行延迟固定的组织，在通过充分固定和进行选取抗原修复液a[高温高压edta（ph9.0）缓冲液修复）]、抗原修复液b[高温高压edta（ph8.0）缓冲液修复]、抗原修复液c[高温高压柠檬酸盐（ph6.0）缓冲液修复]和抗原修复液d[微波炉edta（ph9.0）缓冲液修复法]的前提下能够进行免疫组化检测，但需要注意的是尽量减少和避免延迟固定时间。
【关键词】抗原修复液；固定时间；免疫组化doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.089 文章编号：1004-7484（2012）-08-2487-02随着医学技术和相关领域的不断发展，免疫组织化学技术作为一门新兴的学科出现了。
它是一门基于免疫和分子生物学与病理形态学等学科综合的技术，主要是通过已知抗体或抗原进行对实验中的组织细胞中探测的抗原或抗体检测。
典型特征包括操作易于实现，准确性高和特异性强，并且能够将形态和机能相互整合。
该种技术已在实际中能够进行病理和鉴别诊断，组织胚胎和神经解剖等相关领域的实验研究[1]。
通常情况下，只有在正确及时的固定离体组织前提下，免疫组化技术才能得出精确度高的实验结果。
但是，由于实际操作中存在大量的影响因素造成不能正确及时的固定离体组织，特别是在进行尸检标本时，对实验的要求更高。
第３卷第２期唐山职业技术学院学报Ｖｏｌ．３Ｎｏ．２２００５年１２月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴａｎｇｓｈａｎＶｏｃａｔｉｏｎａｌ＆ＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＤｅｃ．２００５不同修复方法对免疫组化染色结果的影响崔永兴１涂静宜１李冬梅２李红民３（１－唐山职业技术学院，２－唐山开滦医院，３－唐山协和医院，河北唐山０６３００４）【摘要】目的：探讨不同抗原修复方法对免疫组化染色结果的影响。
方法：选取常用需要修复的抗体１６种，对每种抗体采用多种修复方法，比较免疫组织化学染色结果。
结果：１６种抗体经修复后，均有较好的阳性表达，其中热修复的高压锅方法背景清晰，阳性颗粒明确，效果最好；微波法次之；胃酶及胰酶修复法结果稍差。
结论：本文通过对临床几种常用抗体在不同抗原修复方法下的表达进行研究表明，抗原热修复法可替代酶消化法，热修复方法中以高压锅抗原修复法效果最好。
【关键词】抗原修复；抗体；免疫组化目前免疫组化技术已成为病理诊断必不可少的重要辅助手段，但常规石蜡切片标本，一般均用１０％中性甲醛固定，而使其抗原蛋白的氨基与固定液中的醛基交联形成醛键、羧甲键，从而封闭了部分抗原决定簇；或由于蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽，因此使其免疫组化标记的敏感性明显降低，甚至出现假阴性。
因此抗原决定簇的充分暴露是免疫组化染色成功的关键。
在免疫组化染色时，通常采用抗原修复方法使抗原决定簇充分暴露。
抗原修复方法主要有两种：一种为化学方法－－即酶消化法，是最早的抗原修复方法，另一种为物理方法－－即热修复法。
但在日常工作中，不同的抗体，试剂公司推荐的修复方法不尽相同，操作起来较繁琐，增加了工作量和成本，而且染色结果也不尽如人意。
为了解决这些问题，提高工作效率和节省试剂，我们对一种需要进行抗原修复的抗体采用高压加热法、微波加热法、胰酶消化、胃酶消化方法分别修复，探讨不同修复方法对染色结果的影响，旨在选取一种简洁、有效的修复方法。
１材料与方法１．１材料：收集唐山市协和医院手术切除的乳腺癌、淋巴瘤、大肠癌标本各１２例，待检组织均经１０％中性福尔马林液固定，常规脱水、透明、石蜡包埋。
免疫组化在临床诊断中的应用在临床病理诊断中，免疫组织化学（IHe）是一种很重要的技术和手段，从20世纪70年代开始，免疫组化技术就应用于病理诊断，对于诊断肿瘤、肿瘤分类、判断预后产生了巨大的影响，同时也扩展了人们对于各种疾病及肿瘤形成过程的认识，提高了病理诊断与研究水平。
但是，随着免疫组化的广泛应用，发现免疫组化技术存在一些局限性。
深入研究免疫组化原理和技术，必须熟悉各种抗体真阳性反应部位，实现实验室间免疫组化标准化，使免疫组化在病理诊断中发挥最大的辅助作用。
在病理诊断中，随着各种抗体新的用途不断被发现及越来越多的新型抗体的出现，免疫组化在肿瘤诊断及鉴别诊断、分类、预后判断等方面产生了重大的影响。
由于免疫组化技术也存在一些局限性，因此，深入研究免疫组化原理和技术，并努力实现规范化的操作，才能充分发挥免疫组化在病理的诊断及鉴别诊断、判断预后、指导临床治疗中的作用。
1.免疫组化技术观察组织切片中抗原的数量及其在组织中的分布情况，对抗原进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学，由于抗原与抗体特异性结合，因此通过免疫组化使标记抗体的显色剂（酶、荧光素、同位素、金属离子等等）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）。
IHC所用标本主要为两大类:组织标本和细胞标本，其中制作组织标本最常用、最基本的方法是石蜡切片。
石蜡切片对于组织形态保存好，有利于各种染色对照观察，而且能长期保存；石蜡切片中使用的甲醛固定剂对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
2.免疫组化技术在临床诊断中的作用目前免疫组化技术应用于临床主要有以下几个方面：2.1肿瘤良恶性的判断对于反应性增生还是肿瘤性增生，可用免疫球蛋白（Ig）的轻链抗体检测B淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来区别。
在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达细胞凋亡蛋白（bc1-2）,be1-2阴性；而在滤泡性淋巴瘤中，由于90%以上肿瘤性滤泡细胞有bc1-2的高表达，bc1-2阳性。
实验研究 不同抗原修复法对视网膜石蜡切片相关功能蛋白表达检测的影响李 颖 胡运韬 马 汀 马志中The effects of varied antigen retrieval m ethods on i m m unohistoche m istry of functional protei ns in reti nal paraffi n sectionL i Ying,H u Yuntao,M a T ing,M a Zh izhong.P ek ing Un i v ersit y Thir d H osp ital,P eking University Eye Center,B eijing100191,ChinaA bstrac t Background A nti gen retr i eva l m ethod i s the key o f i m prov i ng t he successf u l rate of i m m unoh istoche m i ca lassay i n para ffi n secti ons.T o study an ava ilab l e m et hod o f anti g en retr i eva l is a go al to ach ieve bo t h good i m m unoche m istry result and preserv ing re ti na l protei ns. O b jective The a i m o f present st udy is to i nvesti gate tyrosi n d i gesti on,h i gh temperature heat pressure,w ater ba t h hea ti ng and m icro w ave repa i r i n anti gen re trieval f o r re ti na l tissues. M e thods Re ti nal tissue was i so lated and obta i ned from clean Ch i nch ill a rabb its.F our hundreds re ti na l pa raffi n sections were prepared.Four kinds o f anti gen retr i eva l m ethods for reti na l ti ssue i nc l udi ng ty rosin d i gesti on,hi gh te mperature heat pressure,w ate r bath heati ng and m i crowave repa ir w ere used respec ti ve l y.The dep i g m entated reti nal para ffi n secti on w it hout an tigen retrieva lw as used as contro.l T he po siti ve rates o f express i on o f CRALBP,Rhodopsi n and ops i n prote i ns w ere eva l uated and compared among f our ki nds o f anti gen retr i eva l m ethods by i m muno che m i stry. Resu lts CRALBP,R hodops i n and opsi n pro tein was positi ve l y expressed i n cy top las m of reti na l p i gment epithelial ce lls and the outer segm en t o f photo receptor respecti ve ly.N o si gn ificant d ifference w as f ound in t he positi v e expressi on rates of t hese t h ree pro te i ns a m ong four k i nds o f anti gen retr i eva l me t hods(P>0 05),but t he d ifferences i n ti ssue integ rity and backg round sta i n i ng w ere stati stica lly sign ificant(P<0 01).T he structura l damage of re ti na inc l uded loss and pucke r o f sca lera,crack of nuc leus and abnor m a l background sta i n i n high te m pe rature hea t press u re m ethod,w ate r bath hea ti ng m ethod and m icro w ave retr i eva l m ethod.H o w ever,stable CRALBP,R hodops i n and opsi n pro tein expression and straine ffectiveness,clear background w ithout unspecific staini ng and i ntegrated ti ssue w ere seen i n t y rosin d i gesti on m ethod.Conc l u sion D uring t he c linical pa t ho l ogy ana lysis of re tina l tissue,t he app lica ti on o f ty rosin d i gesti on in anti gen retr i eva l could obta i n a be tter e ffecti veness.K ey word s antigen retriev a;l i m m unoh istochem istry;CRALBP;Rhodopsi n;opsin;re ti na摘要 目的 比较4种抗原修复法对视网膜组织抗原修复的效果。
免疫组化实验中的抗原修复来源：网络抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。
免疫组化实验中的抗原修复：1、酶消化：如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶。
2、抗原热修复：高压法、微波法、水煮法。
众所周知，免疫组化染色中最关键的莫过于抗原修复，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，热抗原修复优于酶消化，更有效，染色结果更易一致，操作单一。
3、修复时间：既要获得最强的染色结果，又要保持组织形态的完整性。
许多抗原修复存在的问题是组织固定时间过短时，强烈的抗原修复可引起形态破坏、脱片及组织完全消化，解决的方法可采用较短时间的热修复或减少酶的消化时间。
4、抗原修复缓冲液：有柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）、Tris （pH7-8）、EDTA（pH8.0～9.0）、 EGTA（pH9.0）等。
柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体，Tris和 EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。
目前还没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和EGTA缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择高pH值的修复液。
例如：ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。
5、抗原热修复注意事项：无论哪一步都不要让切片干凅，加热后需要冷却15－30分钟。
充分的抗原修复是影响染色结果的唯一重要因素，加热的温度和时间可导致修复不足或过度修复。
6、抗原热修复对组织中内源性生物素的影响：抗原热修复在增强抗原决定簇表达的同时，也增强了组织中内源性生物素的反应。
采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）检测系统，组织中内源性生物素容易出现人为假象，在加热抗原处理条件完全相同的阴性对照片中可以观察到较强的内源性生物素的反应，没有经过热抗原处理的切片中没有出现类似的情况。
抗原修复方法及注意事项一、抗原修复的原理在组织样本的处理过程中，如固定、脱水和包埋等，抗原的表位可能会被遮蔽或改变，导致抗体无法有效地与之结合，从而影响检测结果的准确性。
抗原修复的目的就是通过一系列的处理方法，恢复抗原的天然构象和表位，使其能够被抗体识别。
二、常见的抗原修复方法1、热诱导抗原修复（HeatInduced Antigen Retrieval，HIAR）水浴加热法：将切片放入装有修复液的容器中，在水浴锅中加热至一定温度并保持一定时间。
高压锅加热法：在高压锅中加入适量的修复液和切片，加热至喷气后维持一定时间。
微波加热法：将切片置于装有修复液的容器中，在微波炉中进行加热。
2、酶消化抗原修复蛋白酶 K：常用于消化细胞和组织中的蛋白质，暴露抗原表位。
胰蛋白酶：对某些抗原具有较好的修复效果。
3、非热诱导抗原修复酸处理：如使用柠檬酸等酸性溶液进行处理。
碱处理：如使用氢氧化钠等碱性溶液进行处理。
三、不同方法的优缺点1、热诱导抗原修复优点：操作相对简单，效果较为稳定，适用于大多数抗原。
缺点：可能会导致组织形态的一定改变，需要严格控制加热时间和温度。
2、酶消化抗原修复优点：对于某些特定的抗原修复效果较好。
缺点：酶的浓度和作用时间较难掌握，容易造成过度消化或消化不足。
3、非热诱导抗原修复优点：对组织形态的影响较小。
缺点：效果可能不如热诱导修复方法显著，适用范围相对较窄。
四、抗原修复的注意事项1、修复液的选择根据抗原的性质和实验要求选择合适的修复液。
常见的修复液有柠檬酸盐缓冲液、EDTA 缓冲液等。
不同的修复液可能对不同的抗原具有不同的修复效果，需要进行预实验摸索。
2、温度和时间的控制热诱导抗原修复时，温度过高或时间过长可能会导致组织过度损伤，影响形态和抗原性；温度过低或时间过短则可能修复效果不佳。
一般来说，水浴加热法的温度通常在 95-100℃，时间 10-20 分钟；高压锅加热法喷气后 1-3 分钟；微波加热法根据微波炉的功率和样本数量而定，通常为 5-15 分钟。
