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免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
![[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项](https://img.taocdn.com/s1/m/bfd95ed44128915f804d2b160b4e767f5acf80ab.png)
免疫荧光操作步骤及注意事项一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
免疫荧光原理
免疫荧光原理是一种基于抗体和抗原相互作用的检测方法。
其基本原理是利用特异性抗体与相应抗原结合并标记荧光物质，用荧光显微镜观察标记物的荧光强度和分布，从而确定样品中目标分子的存在和定量。
免疫荧光原理的具体步骤如下：
1. 样品处理：将待检测的样品（如血清、细胞等）进行预处理，如离心、洗涤等，以减少干扰物的存在。
2. 抗原固定：将待检测样品中的抗原分子固定在载玻片或孔板上。
固定方法可以是化学交联、热处理、共价结合等。
3. 抗体结合：将特异性抗体与已固定的抗原结合。
该抗体可以与目标分子特异性结合，并形成抗原-抗体复合物。
4. 清洗：通过洗涤步骤，将非特异性结合的抗体等杂质物质去除，以减少背景干扰。
5. 标记物添加：将荧光标记的二抗或其他具有荧光性质的物质加入样品中。
该标记物会与抗体结合在一起，从而使已结合的抗原-抗体复合物显示出荧光。
6. 清洗：再次进行洗涤步骤，以去除未结合的荧光标记物。
7. 荧光观察：使用荧光显微镜观察载玻片或孔板上的荧光信号。
荧光信号的强度和分布可以反映目标分子的存在和定量。
免疫荧光原理在生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域得到了广泛应用。
通过选择合适的抗体和标记物，免疫荧光可以同时检测多种目标分子，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，因此在生命科学研究中扮演着重要的角色。
1.用预温的PBS洗细胞两遍，可以不用摇；
2.加入4%多聚甲醛固定，1ML/well,10min,固定的时间也可以适当的增
长；在固定之前的步骤其实都要尽量轻而快，保证细胞固定之后不会缩太多，能够维持原有的细胞形态；
（4%多聚甲醛：现用现配。
0.4g多聚甲醛溶于9mlPBS中，加适量1M NaOH(~10微升)，可以在95°水浴中溶解，PH~7.2）
3.PBS洗至少4遍；
4.加入TBST，20min;这个过程是使得细胞膜变通透，可以使得抗体更
好的进入细胞；
（TBST配制：0.25% TritonX-100,150mM Nacl.50mM Tris-Hcl;）
例如：50ml TBST 配制方法：TritonX-100：125ul
5M Nacl:1.5ml
1M Tris-Hcl:2.5ml
PBS :45.875ml;
5.PBS洗4遍至少；
6.加入5% BSA封闭2小时；（5% BSA：0.5g BSA粉末，用9ml PBS 溶
解。
4℃存放。
）
7.加入一抗（用含4% BSA的TBST稀释溶解；）然后4℃过夜，不要摇，
放着就好；抗体在配制的时候不用太多，可以盖住底下的凹槽就可以了，体积大概200微升就够了；
8.次日，用PBS洗至少5遍；
9.加入二抗，配制方法和一抗相同，避光孵育1h;
10.避光洗至少4遍；然后加DAPI,2min后用荧光拍照；。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。
以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。
2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。
可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。
3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。
4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。
留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。
5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。
6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。
留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。
7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。
8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。
9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。
以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。
免疫荧光步骤
1.脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min； 2）无水乙醇中浸泡5min； 3）95%乙醇中浸泡5min； 4）70%乙醇中浸泡5min；（动作要快，减少暴露在空气中中的时间）
2.PBS洗两次各5min。
（整个过程中注意切片不能干）
3.抗原修复，用于多聚甲醛固定的石蜡包埋组织芯片。
煮沸热修复电炉或者水浴锅加热 0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
4.PBS洗3次每次5min。
5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。
6.滴加一抗（根据说明书的比例稀释，一般为1:100），室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。
7.PBS洗3次每次5min。
8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。
（注意抗体针对的种属，使用浓度，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。
）
9.PBS洗3次每次5min。
10. DAPI染色：把DAPI滴在片上，将切片覆盖，50ul/片，染色10min。
11. PBS洗3次每次2 min。
12.封片：抗荧光淬灭封片剂封片，再拍照。
免疫荧光技术原理与步骤免疫荧光技术（immunofluorescence）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，它通过利用抗体与特定抗原结合后对细胞或组织中的抗原进行标记，然后利用荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
本文将介绍免疫荧光技术的原理和步骤，帮助读者更好地了解和应用这一技术。
原理。
免疫荧光技术的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
当特异性抗体与其相应的抗原结合后，可以利用荧光染料标记抗体，使其在荧光显微镜下发出特定颜色的荧光信号。
这样就可以通过观察荧光信号的位置和强度来确定抗原在细胞或组织中的分布情况。
步骤。
免疫荧光技术的步骤通常包括样品处理、抗体标记、荧光染料标记和观察四个主要步骤。
1. 样品处理。
样品处理是免疫荧光技术的第一步，它包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定是为了保持细胞或组织的形态结构和抗原的稳定性，常用的固定剂包括乙醇、乙酸和乙醛等。
脱水和透明化则是为了使样品透明，便于观察。
2. 抗体标记。
抗体标记是免疫荧光技术的关键步骤，它需要选择特异性较好的一抗和二抗。
一抗是直接与抗原结合的抗体，而二抗是与一抗结合的抗体。
在这一步骤中，需要将一抗和二抗分别标记上荧光染料。
3. 荧光染料标记。
荧光染料标记是将标记好荧光的抗体与样品中的抗原结合，形成荧光信号。
这一步骤需要在暗处进行，以避免荧光信号受到光照的干扰。
4. 观察。
观察是免疫荧光技术的最后一步，通过荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
在观察过程中，需要根据实验设计选择合适的荧光滤光片，以获得清晰的荧光图像。
总结。
免疫荧光技术是一种重要的生物医学研究和临床诊断技术，它通过标记抗体和抗原来观察细胞或组织中特定蛋白的位置和分布情况。
掌握免疫荧光技术的原理和步骤，可以帮助科研工作者和临床医生更好地开展相关工作，为生物医学领域的发展做出贡献。
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免疫组织荧光步骤免疫组织荧光是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定抗原在细胞或组织中的分布情况。
该技术利用荧光标记的抗体与目标抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而获得关于抗原分布的信息。
下面将介绍免疫组织荧光的步骤。
第一步：固定和切片在进行免疫组织荧光实验之前，首先需要将待检测的组织固定并制备成切片。
固定可以保持组织结构的完整性，并固定其中的蛋白质，以便后续的抗体结合。
切片是将组织切割成非常薄的片段，以便于抗体的渗透和荧光信号的观察。
第二步：抗原解表为了提高抗体的结合效率和信号强度，需要对组织切片进行抗原解表处理。
抗原解表通过一系列化学或物理方法，使组织中的蛋白质结构发生变化，使得抗体能够更容易地与目标抗原结合。
第三步：抗体孵育在进行免疫组织荧光实验时，需要选择与目标抗原特异性结合的抗体，并将其与组织切片一起孵育。
抗体可以是来自动物（如兔子、小鼠）的多克隆抗体或来自细胞培养的单克隆抗体。
在孵育过程中，抗体会与目标抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
第四步：洗涤为了去除无效的抗体和非特异性结合物，需要对组织切片进行洗涤。
洗涤过程中使用缓冲液，可以有效地去除孵育过程中产生的杂质和未结合的抗体。
第五步：二抗孵育为了增强信号的强度，需要使用荧光标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。
二抗是针对来自第一步孵育的抗体的抗体，可以与其特异性结合。
二抗通常标记有荧光物质，如荧光素、荧光蛋白等，通过观察荧光信号可以确定抗原在组织中的分布情况。
第六步：洗涤与第四步类似，需要对组织切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和杂质。
第七步：荧光显微镜观察在洗涤完毕后，将组织切片放置在荧光显微镜下观察。
荧光显微镜可以通过激发荧光标记的抗体产生荧光信号，并将其放大和记录下来。
通过观察荧光信号的强度和位置可以确定抗原在组织中的分布情况。
免疫组织荧光技术广泛应用于生命科学研究领域，可以用于检测疾病标志物、研究细胞功能以及探索生物过程的机制。
Immunocytochemistry and immunofluorescence protocolProcedure for staining of cell cultures using immunofluorescenceICC and IF protocol Preparing the slide1.Coat coverslips with polyethylineimine or poly-L-lysine for 1 h at room temperature.2.Rinse coverslips well with sterile H2O (three times 1 h each).3.Allow coverslips to dry completely and sterilize them under UV light for at least 4 h.4.Grow cells on glass coverslips or prepare cytospin or smear preparation.5.Rinse briefly in phosphate-buffered saline (PBS).For wash buffer we recommend 1x PBS 0.1% Tween 20.FixationThe cells may be fixed using one of two methods:1.Incubating the cells in 100% methanol (chilled at -20°C) at room temperature for 5mining 4% paraformaldehyde in PBS pH 7.4 for 10 min at room temperatureThe cells should be washed three times with ice-cold PBS.Antigen retrieval (optional step)Certain antibodies work best when cells are heated in antigen retrieval buffer. Checkthe product information for recommendations for each primary antibody being used.1.Preheat the antigen retrieval buffer (100 mM Tris, 5% [w/v] urea, pH 9.5) to 95°C.This can be done by heating the buffer in a coverglass staining jar which is placedin a water bath at 95°C.ing a small pair of broad-tipped forceps, place the coverslips carefully in theantigen retrieval buffer in the cover glass staining jar, making note of which side ofthe coverslips the cells are on.3.Heat the coverslips at 95°C for 10 min.24.Remove the coverslips from the antigen retrieval buffer and immerse them, withthe side containing the cells facing up, in PBS, in the 6-well tissue culture plates.5.Wash cells in PBS three times for 5 min.PermeabilizationIf the target protein is intracellular, it is very important to permeabilize the cells.Acetone fixed samples do not require permeabilization.1.Incubate the samples for 10 min with PBS containing either 0.1–0.25% Triton X-100(or 100 μM digitonin or 0.5% s aponin). Triton X-100 is the most popular detergent forimproving the penetration of the antibody. However, it is not appropriate formembrane-associated antigens since it destroys membranes.2.The optimal percentage of Triton X-100 should be determined for each protein ofinterest.3.Wash cells in PBS three times for 5 min.Blocking and immunostaining1.Incubate cells with 1% BSA, 22.52 mg/mL glycine in PBST (PBS+ 0.1% Tween 20) for30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutionsare 1% gelatin or 10% serum from the species the secondary antibody was raisedin: see antibody datasheet for recommendations).2.Incubate cells in the diluted antibody in 1% BSA in PBST in a humidified chamberfor 1 h at room temperature or overnight at 4°C.3.Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash.4.Incubate cells with the secondary antibody in 1% BSA for 1 h at room temperaturein the dark.5.Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 mineach in the dark.3ICC and IF protocol Multicolor immunostaining(optional step)To examine the co-distribution of two (or more) different antigens in the same sample,use a double immunofluorescence procedure. This can be performed eithersimultaneously (in a mixture) or sequentially (one antigen after another).Ensure you have antibodies for different species and their corresponding secondaryantibodies. For example, rabbit antibody against antigen A, mouse antibody againstantigen B. Alternatively, you can use directly conjugated primary antibodiesconjugated to different fluorophores.Simultaneous incubation1.Incubate cells with blocking solution for 30 min.2.Incubate cells with both primary antibodies in 1% BSA in PBST in a humidifiedchamber for 1 h at room temperature or overnight at 4°C.3.Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash.4.Incubate cells with both secondary antibodies in 1% BSA for 1 h at roomtemperature in the dark.5.Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 minseach in the dark.Sequential incubation1.First blocking step: incubate cells with the first blocking solution (10% serum fromthe species that the secondary antibody was raised in) for 30 min at roomtemperature.2.Incubate cells with the first primary antibody in 1% BSA or 1% serum in PBST in ahumidified chamber for 1 h at room temperature or overnight at 4°C, 1% gelatinor 1% BSA.3.Decant the first primary antibody solution and wash the cells three times in PBS, 5min each wash.4.Incubate cells with first secondary antibody in 1% BSA in PBST for 1 h at roomtemperature in the dark.5.Decant the first secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5min each in the dark.6.Second blocking step: incubate cells with the second serum, (10% serum from thespecies that the secondary antibody was raised in) for 30 min at roomtemperature in the dark.47.Incubate cells with the second primary antibody in 1% BSA or 1% serum in PBST in ahumidified chamber in the dark for 1 h at room temperature, or overnight at 4°C.8.Decant the second primary antibody solution and wash the cells three times inPBS, 5 min each wash in the dark.9.Incubate cells with second secondary antibody in 1% BSA for 1 h at roomtemperature in the dark.10.Decant the second secondary antibody solution and wash three times with PBSfor 5 min each in the dark.If you have to detect more than two antigens, continue following steps 1–5 for therest of the antibodies.Counter staining1.Incubate cells with 0.1–1 μg/mL Hoechst stain or DAPI (DNA stain) for 1 min.2.Rinse with PBS.Mounting1.Mount coverslip with a drop of mounting medium.2.Seal coverslip with nail polish to prevent drying and movement under microscope.3.Store in dark at -20°C or +4°C.5。
