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目的探讨兔软骨细胞培养方法。
方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。
每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。
并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。
结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右,传代培养约4~5天,细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。
甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖,异染反应主要集中在细胞集落样生长区,异染程度以原代培养最为显著。
结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。
软骨细胞是关节软骨破坏过程中的靶细胞,研究靶细胞的变化是探索关节软骨破坏、病理和治疗的重要方法,本实验的目的是建立体外软骨细胞培养体系,为进一步实验创造条件。
1材料与方法1·3动物: 4周龄健康新西兰兔。
1·4软骨细胞的分离和培养1·4·1软骨细胞的分离步骤:I)一只健康4周龄新西兰兔脱颈处死,备皮,用碘酊酒精背部皮肤消毒,无菌操作沿背部中线剪开并剥离皮肤,更换手术器械及手套,以防碘酊等有机物污染。
(30min) II)游离并用骨剪截取膝关节,置入无菌平皿,带入超净工作台III)在超净工作台作如下操作:1)先用双抗的pbs充分漂洗,直到没有碘伏的颜色(5min),离断髌韧带,内外侧副韧带以及前后交叉韧带,切开膝关节,刮除关节周围附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜, pbs液充分漂洗。
2)用尖刀片充分利用软骨的弹性,削下每个关节表面的软骨,不要误带软骨下骨和骨膜,一般以不渗血为度。
3)充分漂洗软骨小块,更换洗液3次(pbs液)。
4)用眼科小剪刀剪碎至1 mm3大小,用小刮匙把软骨小块转移至小锥形瓶中。
5)加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,置磁力搅拌器上37℃消化45 min,将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出, 120目尼龙网筛过滤。
6)所得滤液放入一无菌离心管内, 1200 r/min离心8 min,弃上清,加入5 ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化。
目的探讨兔软骨细胞培养方法。
方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。
每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。
并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。
结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右,传代培养约4~5天,细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。
甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖,异染反应主要集中在细胞集落样生长区,异染程度以原代培养最为显著。
结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。
软骨细胞是关节软骨破坏过程中的靶细胞,研究靶细胞的变化是探索关节软骨破坏、病理和治疗的重要方法,本实验的目的是建立体外软骨细胞培养体系,为进一步实验创造条件。
1材料与方法1·3动物: 4周龄健康新西兰兔。
1·4软骨细胞的分离和培养1·4·1软骨细胞的分离步骤:I)一只健康4周龄新西兰兔脱颈处死,备皮,用碘酊酒精背部皮肤消毒,无菌操作沿背部中线剪开并剥离皮肤,更换手术器械及手套,以防碘酊等有机物污染。
(30min) II)游离并用骨剪截取膝关节,置入无菌平皿,带入超净工作台III)在超净工作台作如下操作:1)先用双抗的pbs充分漂洗,直到没有碘伏的颜色(5min),离断髌韧带,内外侧副韧带以及前后交叉韧带,切开膝关节,刮除关节周围附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜, pbs液充分漂洗。
2)用尖刀片充分利用软骨的弹性,削下每个关节表面的软骨,不要误带软骨下骨和骨膜,一般以不渗血为度。
3)充分漂洗软骨小块,更换洗液3次(pbs液)。
4)用眼科小剪刀剪碎至1 mm3大小,用小刮匙把软骨小块转移至小锥形瓶中。
5)加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,置磁力搅拌器上37℃消化45 min,将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出, 120目尼龙网筛过滤。
6)所得滤液放入一无菌离心管内, 1200 r/min离心8 min,弃上清,加入5 ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化。
Ⅱ型胶原酶消化法可短时间获得大量纯化大鼠关节软骨细胞刘振峰;方锐;孟庆才【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)050【摘要】背景:建立一种经济、快捷、切实可行的软骨细胞分离培养体系对于软骨体外实验研究有着重要的意义.目的:探讨与改进大鼠关节软骨细胞的培养方法.方法:无菌条件下取新生1周龄SD雄性大鼠双侧髋及膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞并进行原代、传代培养及鉴定.结果与结论:倒置相差显微镜下见原代培养的软骨细胞12 h后开始贴壁,3 d左右可形成单层,4 d左右即可传代.传至第6代后,部分细胞变为梭形;第7代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状,增殖能力减弱.甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞核呈异染性,免疫荧光染色显示培养的软骨细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达.说明采用此方法可在短时间内获得大量纯化的大鼠软骨细胞.%BACKGROUND: To establish an economic, efficient, prjctical isolation and culture system of chondrocytes has importantsignificance to cartilage in witro experiments.OBJECTIVE: To investigate and improve the culture method of rat articutar chondrocytes.METHODS: Rat cartilage of bilateral hip and knee was resected from one week old male rate under aseptic condition.Chondrocytes were isolated by type 0 collagenase enzyme digestion method. The cells were cultured and passaged, thenRESULTS AND CONCLUSION: Inverted phase contrast microscope observation showed that the primary cultured chondrocytes adhcrcntcd at the 12h hour after cultivation. The monolayer formation occurred on the3rd day after cutivation. And cells were ready to be passaged on the 4h day after cultivation. After passaged for six generations, some cells represented a spindle-Ike appearance. In the 7h generation, most cells turned into a long and irregular appearance, and cell proliferation capacity diminished. Toluidine blue staining showed that the nuclets of cultured chondrocytes were metachromatic Immunofluorescent staining showed that cultured chondrocytes had a positive expression of collagen type 0. These findings illustute that a large number of purified rat chondrocytes can be gained by this method in a short time.【总页数】4页(P9323-9326)【作者】刘振峰;方锐;孟庆才【作者单位】新疆维吾尔自治区中医医院关节外科,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830000;新疆维吾尔自治区中医医院关节外科,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830000;新疆维吾尔自治区中医医院关节外科,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市,830000【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.低浓度Ⅱ、Ⅳ型胶原酶联合消化法分离幼年SD大鼠睾丸间质细胞 [J], 李阳;王宇;程康;刘春2.Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞 [J], 刘长剑;刘建国;于铁成;罗宗键3.Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞 [J], 闫虎;苏友新;林学义;陈宝军;周必洪;张庆4.II型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞 [J], 闫虎;苏友新;林学义;陈宝军;周必洪;张庆;5.Ⅱ型胶原酶/弹性蛋白酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞 [J], 涂永生;黄红林;朱炳阳;廖端芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Ⅱ型胶原酶消化分离法和组织块直接培养法体外培养人软骨细胞的效果蒋红;杨明辉;蔡燕;贾艾敏;邱亚;赵明才【期刊名称】《医疗装备》【年(卷),期】2017(030)007【摘要】目的比较Ⅱ型胶原酶消化分离法和组织块直接培养法体外培养人软骨细胞的效果.方法取人外伤性截肢及原发性骨关节炎患者的膝关节软骨,无菌条件下将软骨剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的碎块,分别采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块直接培养法分离培养人关节软骨细胞,进行原代及传代培养,观察软骨细胞的生长情况.结果采用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养可获得较多软骨细胞,细胞形态典型,增殖较快.组织块直接培养法获得的软骨细胞数量较少,增殖慢.结论两种不同方法培养后,均可获得人软骨细胞的生长,Ⅱ型胶原酶消化分离培养法明显优于组织块直接培养法.【总页数】4页(P31-34)【作者】蒋红;杨明辉;蔡燕;贾艾敏;邱亚;赵明才【作者单位】川北医学院附属医院风湿免疫研究所四川南充 637000;川北医学院附属医院医学研究中心四川南充 637000;川北医学院附属医院风湿免疫研究所四川南充 637000;川北医学院附属医院检验科四川南充 637000;川北医学院附属医院检验科四川南充 637000;川北医学院附属医院医学研究中心四川南充637000;川北医学院附属医院医学研究中心四川南充 637000;川北医学院附属医院风湿免疫研究所四川南充 637000;川北医学院附属医院医学研究中心四川南充 637000;川北医学院附属医院检验科四川南充 637000【正文语种】中文【中图分类】R684【相关文献】1.胶原酶I消化联合筛网过滤法用于人与小鼠着床窗口期子宫内膜原代培养的效果比较 [J], 王昕荣;张宁;郝翠芳2.人妊娠子宫平滑肌细胞培养消化法与组织块法效果比较 [J], 李夏;陈诚;常青3.Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞 [J], 李树文;武海军;银和平;白明;杜志才4.Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞 [J], 闫虎;苏友新;林学义;陈宝军;周必洪;张庆5.Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞 [J], 王凤明;胡涛;周学东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
两种方法分离培养类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的比较目的比较体外分离培养成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法。
方法滑膜组织来自关节镜清洗术的活动期类风湿关节炎患者，分别采用消化酶培养法、组织块培养法分离培养FLS。
采用倒置相差显微镜以及流式细胞术对第3～4代FLS 进行鉴定。
结果2种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。
传代可使FLS 达到形态学上的纯化要求，倒置相差显微镜观察均符合FLS的形态结构特征，流式细胞术检测示CD44以及CD90呈强阳性，CD55呈弱阳性。
组织块法培养法FLS成功率较高，细胞游出时间较早，细胞损伤小。
结论组织块培养法适合于FLS的培养，第3～4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。
[Abstract] Objective To compare the isolated methods for fibroblast-like synoviocytes (FLS). Methods Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by digestive enzyme culture and tissue culture. The 3～4 generation FLS were identified by morphology and flow cytometry. Results These two methods could culture FLS successfully, tissue culture method was better than the digestive enzyme culture method. FLS showed typical morphological characters under inverted phase contrast microscope. CD44 and CD90 were strong positive, and CD55 was weak positive in the FLS cell surface. Tissue culture method had higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue. Conclusion Tissue culture method is especially suitable for FLS culture in vitro from synovium tissue. And purity of FLS of the third or forth generation meet the requirement for molecular biology experiments.[Key words] Fibroblast-like synoviocyte; Cell culture; Separate training; Rheumatoid arthritis類风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病[1]。
不同方法体外培养软骨细胞的活力、功能及成软骨能力宋卫东;刘尚礼;李卫平;沈慧勇;黄东生;黄建荣【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2002(006)008【摘要】目的探讨不同体外培养方法所培养软骨细胞活力、表型及成软骨能力的差异.方法取股骨髁关节面软骨,经不完全酶消化法消化后,与未完全消化的软骨块置入预涂多聚赖氨酸的培养瓶中培养;以传统法对照,用倒置显微镜、免疫组化等方法进行观测;并将多次传代后的软骨细胞悬液注入裸鼠腋部皮下,观察其成软骨能力.结果改良法培养的细胞活性率可达100%;经多次传代的软骨细胞仍保持初代软骨细胞的表型特征,并可观察到软骨的特有的细胞-胶原纤维几何构象;移植到裸鼠皮下后可形成软骨样组织.结论改良法是一种较方便、有效的培养法.【总页数】2页(P1113-1114)【作者】宋卫东;刘尚礼;李卫平;沈慧勇;黄东生;黄建荣【作者单位】中山大学附属第二医院,广东,广州,510120;中山大学附属第二医院,广东,广州,510120;中山大学附属第二医院,广东,广州,510120;中山大学附属第二医院,广东,广州,510120;中山大学附属第二医院,广东,广州,510120;中山大学附属第二医院,广东,广州,510120【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.猪关节软骨细胞体外培养及其形成糖胺多糖能力的实验研究 [J], 许宏权;黄向莹;陈晓洁;王传家;纪影畅2.可注射性材料藻酸钠体外培养幼猪关节软骨细胞及形成组织工程化软骨的能力[J], 李卫平;韩运;黄建荣;马文谱;王志勇;代亮3.人耳软骨细胞冻存复苏后的体外成软骨能力及体内转归的研究 [J], 于瑶;殷宗琦;李丹;周广东;曹谊林;刘豫4.胰岛素样生长因子Ⅰ对软骨细胞复合物体外成软骨能力的影响 [J], 杨万波;顾洁夫;徐振华;张蔚英;刘军5.体外传代培养对关节软骨细胞成软骨能力的影响 [J], 张安美;邱玉金;张金兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养魏钰;魏民【摘要】背景:大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养.动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致.如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势,是模拟体内骨关节炎软骨退变过程的关键.目的:探讨人骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养方法,观察原代至第3代人骨关节软骨细胞的形态学特性和相关蛋白表达变化.方法:取6例因重度骨关节炎行关节置换术患者的废弃软骨组织(获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准,伦理批号为S2017-23-7),男2例,女4例;年龄62-72岁,平均(68.3±3.39)岁,采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)分离培养人骨关节炎软骨细胞,并进行传代培养,从而构建体外人骨关节炎软骨细胞培养体系.倒置相差显微镜观察各代细胞形态;苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定.采用Western blot法检测各代软骨细胞于70％融合率时Col2a、Aggrecan与MMP-13的表达.结果与结论:经过Ⅱ型胶原酶消化后,培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞,3周左右可传代进行下一步研究;形态学、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光染色证明培养出的细胞为人软骨细胞.第3代软骨细胞Col2a、Aggrecan的相对表达量与原代比较有明显降低(P<0.01),且随着培养代数增加表达逐渐降低;MMP-13随着培养代数的增加表达逐渐增强(P<0.01).结果表明,Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本中分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养.体外培养的骨关节炎软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强,功能性蛋白表达整体下降.3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现,可能是用于实验研究的最佳选择.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2019(023)025【总页数】6页(P4056-4061)【关键词】骨关节炎;关节置换;人软骨细胞;一步酶消化法;Ⅱ型胶原酶;Ⅱ型胶原;聚集蛋白聚糖;国家自然科学基金【作者】魏钰;魏民【作者单位】中国人民解放军总医院,北京市 100000;中国人民解放军总医院,北京市 100000【正文语种】中文【中图分类】R459.9;R394.20 引言 Introduction骨关节炎是最常见的老年退行性关节疾病，以软骨磨损和骨质增生为主要特征[1]。
乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察刘雷;韦庆军;陈管雄;谢伟;陈欢【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(31)3【摘要】目的:建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法:采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应(RT PCR)法观察其生物学特性.结果:通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h 后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论:本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.【总页数】5页(P364-368)【作者】刘雷;韦庆军;陈管雄;谢伟;陈欢【作者单位】广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R-33【相关文献】1.兔关节软骨细胞体外培养的生物学特性及中药黄芪对其的影响 [J], 张宇明;卫小春2.胶原酶消化分离兔关节软骨细胞及体外聚集培养的观察 [J], 马涛;杨晓宇;温鹏;万钧;罗小军3.兔关节软骨细胞在几丁糖中培养的生物学特性 [J], 郑卫平;张志光;郑有华4.日本大耳兔关节软骨细胞的分离培养及鉴定 [J], 耿书国;王丽丽;汪建样;施剑明;殷嫦嫦5.痛痹方血清对体外培养乳兔关节软骨细胞增殖和MMP-3与TIMP-1的影响 [J], 王新东;张前德;纪伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
