实验一MS培养基的配制

ms培养基配方表ms培养基是一种常用的细胞培养基，用于无菌条件下培养哺乳动物细胞，特别是鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryo Fibroblast,MEF）。

它是由多种有机和无机化合物组成的复杂混合物，可以提供细胞生长所需的必需氨基酸、糖类、维生素和微量元素等营养物质。

同时，它还包含有机缓冲剂和盐类，可以调节培养品的 pH 值和离子浓度，保持培养条件的稳定性。

下面介绍 ms培养基的配方表：MS培养基水相1. 将1L 去离子水（DI水）加入1mol/L NaCl 至5mL2. 加入HEPES缓冲液（1mol/L）27.7g，调节至pH7.2-7.43. 加入葡萄糖25.0g，混合直至葡萄糖完全溶解4. 加入 L-谷氨酸1.42g，细胞培养I 类和 II 类所需濃度5. 加入 L-苏氨酸0.07g，细胞培养所需濃度6. 加入 L-半胱氨酸0.16g7. 加入 L-赖氨酸0.07g8. 加入 L-缬氨酸0.07g9. 加入L-异亮氨酸0.07g10. 加入L-亮氨酸0.14g11. 加入L-丙氨酸0.14g12. 加入L-天冬氨酸0.15g13. 加入L-芸香氨基酸0.42g14. 加入 L-色氨酸0.03g15. 加入 L-酪氨酸0.03g16. 加入 L-精氨酸0.17g17. 加入 L-组氨酸0.03g18. 加入 L-甘氨酸0.10gMS培养基固相1. 加入 NaHCO3（7.5%）4mL，细胞培养所需濃度2. 加入 4-(2-羟乙基)吡啶盐酸盐（HEP）2g，细胞培养所需濃度；过度使用可导致凝块形成3. 加入 MgSO4（7H2O）0.94g，细胞培养所需濃度4. 加入 KH2PO4 0.17g，细胞培养所需濃度5. 加入 NaH2PO4（H2O，2. H2O）0.19g，细胞培养所需濃度6. 加入 Na2HPO4（7H2O）3.05g，细胞培养所需濃度7. 加入次黄嘌呤（NEAA）1mL，必需的非必需氨基酸，促进细胞生长8. 加入乳酸钠2.72g，利用减少氧淤积，促进细胞生长9.加入硫酸铜子（10-5M)）1mL，为MEF的细胞类型提供最佳的增生所需注：以上配方根据MS原始文献略作调整，如果在实验中出现差异，请根据实际情况微调。

MS 培养基配方1、配置MS母液母液配置：加热都是用温水浴加热，全部都要避光保存，用装乙醇的棕色瓶来保存在4度即可表2.1大量元素母液药品20x g/L 500ml（20 x）KNO338g 19gNH4NO333 g 16.5gMgSO4•7H2O7.4 g 3.7gCaCl2 6.644g 3.322gKH2PO4 3.4g 1.7g溶于200ml蒸馏水,定容至500ml 需要加热才能完全溶解CaCL2.2H2O 4.4g/L表2.2微量元素母液药品100x g/L 500ml（100x g/L）KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OGuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 0.083g0.6222.3 g0.86 g0.025 g0.0025 g0.0025 g0.0415 g0.31 g1.115 g0.43 g0.0125 g0.00125 g0.00125 g溶于100ml蒸馏水,定容至500ml表2.3有机母液药品100x 1L500ml(100x)肌醇10g5g烟酸0.05g0.025gVB60.05g0.025gVB10.1g0.05g甘氨酸0.2g0.1g表2.4铁盐母液药品100x g/L500mlFeSO4•7H2O 2.78g 1.39gNa2-EDTA. 2H2O 3.73g 1.865g铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于100ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，加水定容至500ml，置于小口瓶中，贴上标签2、固体MS培养基材料•找到4种母液：大量元素，微量元素，有机微量元素，铁盐母液•蔗糖，琼脂锥形瓶MS培养基配方：母液都稀释至1xMS培养基配方（1L）母液体积或重量(1L) 200ml大量元素20x50mL 10ml铁盐100x 微量100x 10mL 2ml 10mL 2ml有机100x10mL 2ml 蔗糖15g（15g/L）3g琼脂8g（8g/L） 1.6gPH先调至 5.85-5.88，最终灭菌后pH接近5.81）。

一、MS培养基母液的配制注意：1．除CaCl2·2H2O单独配制外，大量元素按照使用时高10倍的数值称取，将各种化合物称量后，分别用少量水在不同的容器内充分溶解，然后在500ml烧杯中按顺序加入各溶液，加适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2．微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。

3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。

4．有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。

5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。

A.制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。

B.称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。

二、培养基配制和灭菌一．养培养基配制程序(一).母液吸取量的计算配制培养基的升数母液吸取量= 母液体积（CC）×——————————母液浓缩倍数（二）各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2O；C.微量元素；D.铁盐；E.有机物；F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT 用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。

MS培养基的配制1、配制几种母液（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

分别称取名称重量名称重量NH4NO3165g KH2PO417gKNO3190g CaCl2·2H2O44gMgSO4·7H2O37g各自配成1L的母液。

各自倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取（注：溶好一个后，再加下一个）名称重量名称重量KI0.083g Na2MoO4·2H20.025gOH3BO3 0.62g CuSO4·5H2O0.0025gMnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O0.0025gZnSO4·7H2O0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

注：CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

分别称取CuSO4·5H2O 0.05g，CoCl2·6H2O 0.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

（3）配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液。

依次称取（注：溶好一个后，再加下一个）名称重量名称重量肌醇10g盐酸硫胺素（VB1）0.01g烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（4）配制MS铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。

依次称取EDTA二钠 3.73g，FeSO4·7H2O 2.78g（注：溶好一个后，再加下一个）配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。

（5）激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。

MS 培养基一、大量元素母液1：大量A母液2：大量B母液3：Fe盐注：配制顺序如下1. 称取3.73 g Na2-EDTA•2H2O溶解于200 ml去离子水中，并置于70℃预热(A)；2. 称取2.78 g FeSO4•7H2O溶解于200 ml去离子水中(B)；3. 将B缓慢倒入A中混合，边倒边搅动，置于70 ℃水浴锅中螯合2 h；4. 冷却后定容至1 L。

二、微量元素母液4：微量三、有机物质母液5：有机（不含肌醇）℃注：配固体培养基可在调pH后加适量Agar或Phytagel；肌醇也可加入有机母液。

四、抗生素和激素母液试剂名称配制方法母液浓度Amp（氨苄青霉素）双蒸水溶解，定容，过滤灭菌50 mg/ ml Km（卡那霉素）双蒸水溶解，定容，过滤灭菌50 mg/ ml Str（链霉素）双蒸水溶解，定容，过滤灭菌50 mg/ ml Cb（羧苄青霉素）双蒸水溶解，定容，过滤灭菌250 mg/ ml 6-BA (6-苄基嘌呤) 1M NaOH或盐酸溶解，双蒸水定容，高压灭菌 1 mg/ ml NAA（萘乙酸）1M NaOH溶解，双蒸水定容，高压灭菌 1 mg/ ml IAA 95% 乙醇溶解，双蒸水定容，过滤灭菌 1 mg/ ml五、乙酰丁香酮(Acetone-syringone, AS)称取196.2 mg AS用10 ml DMSO溶解，母液浓度100 mM，-20℃避光保存，工作浓度100 ~ 200 μM六、MS溶液的混合5种母液分别依次加入到800 ml蒸馏水中，混匀后加入肌醇、蔗糖和能高压灭菌的激素（6-BA和NAA），定溶至1000 ml，用1M NaOH调pH至5.8。

最后加Phytagel （Sigma）4.4g或Agar 10g。

灭菌完后，在培养基凝固前加入AS或抗生素及不能高压灭菌的激素（IAA）。

实验一MS培养基配制和灭菌一．目的和要求：1. 学会MS培养基的制作方法;2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。

二、仪器与试剂1. 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等2. 试剂：MS的Macro-e、Micro-e、有机母液、Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉，1N NaoH 和1N HCl三、方法步骤（一）配方设计: 以MS为基本培养基（mg/L）（二）配制培养基(1)溶化琼脂：量取300ml左右蒸馏水，加入4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全融化。

(2) 各种母液的吸取：Macro-e 50mlMicro-e 1ml有机成分1mlFe盐5ml肌醇10ml加在一起，倒入烧杯（1L)（3）加入糖:称取30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。

（4）根据实验设计，量取生长调节剂:加在一起，倒入烧杯。

（5）定容:加蒸馏水（用量杯）。

（6）调节pH至，用pH试纸进行测定，用1molHcl或1Mol NaoH调节。

（7）分装:30～40 ml/瓶6，培养基勿碰三角瓶口。

（8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。

（三）灭菌：用高压蒸汽消毒器灭菌，其压力为～,温度为120～126℃，保持15~20 min。

具体操作步骤：1. 加水；2. 把包扎好的培养基装入高压锅；3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀；4. 加热；5. 排除冷空气；6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在1Kg 压力(121℃)下灭菌15~20 分钟即可，但要注意保持稳定压力。

7. 灭菌时间达到20 分钟后，停止加热，待压力自动降到0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。

四.作业1. 总结配制培养基的注意事项。

2. 制作培养基前为何要提前配制母液实验二短柄五加无性系建立一．目的和要求：1.学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作;2. 掌握无菌操作技术。

一、MS培养基的配制1. 培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的10倍或100倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

2. 按配方表配制MS培养基母液：大量元素50×，微量元素配100×，铁盐、有机成分配制成100×，母液贮存于4℃的冰箱中。

激素配成浓度为0.1mg/mL.3. 配制各种母液是，成分顺序加入，上一成分溶解后再加下一成分。

钙液和铁盐都单独配制。

生长素配制时，先用微量1MNaOH溶解，再以蒸馏水定容；细胞分裂素配制时，先用微量0.1MHCl溶解，再以蒸馏水定容。

二、MS母液配制取作表序号药品名称MS量(mg/L）扩大倍数母液量(g)定容取作量(mg/L)甲液NH4NO3KNO3MgSO4.7H20KH2PO41650190037017050×41.2547.59.254.25500ml 20钙液无水CaCl2440 100×11 500ml 20乙液MnSO4.4H2O或MnSO4. H2OZnSO4.7H2OH3BO3KI22.316.98.66.20.83100× 1.120.850.430.310.0415500ml 10铁盐Na2.EDTA.2H2OFeSO4.7H2037.227.8100× 1.861.39500ml 10有机成分盐酸吡哆醇(VB6)烟酸甘氨酸0.50.52100×0.0050.0050.02100ml 10丙液ⅠNa2MoO4.2H2O.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O0.250.0250.025100×0.01250.001250.00125500ml 10丙液Ⅱ肌醇100 100× 2 200ml 10丙液Ⅲ盐酸硫胺素(VB1) 0.4 50×0.02 100ml 2附注琼脂5.5-6.5g/L 蔗糖30g/LpH5.8-6.2备注：1钙液的母液量由于易沉淀所以取11g2丙液Ⅰ由于取的量太少所以先去12.5mg,溶于10mL水，再取1mL溶液稀释三、注意事项1、药品的质量问题：为了避免杂质及有害物质对组织培养的影响，必须注意药品质量，国内药品采用国际上通用标准，分为：一级，即保证试剂、优质纯试剂Guaranteed Reagent, GR级；二级，即分析纯试剂，Analytical Reagent, AR级；三级，即化学纯试剂，Chemical Pure, CP级；四级，即实验试剂，Laboratory Reagent, LR级。

MS培养基的配置一、母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍。

优点：（1）保证各物质成分的准确性；（2）便于配置时快速移取；（3）便于低温保藏。

1、MS大量元素母液（50X）称10升量溶解在200 ml蒸馏水中。

配1升培养基取20 ml。

注：CaCl2·2H2O单独配置2、MS微量元素母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。

配1升培养基母液10ml。

注：CoCl2·6H2O和CuSO4·5H2O可按10倍量（0．25 mgX10=2．5 mg）或100倍量（25 mg）称取后，定容于100ml水中，每次取10ml或1ml，即含0．25 mg的量。

3、MS铁盐母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。

配1升培养基母液10ml。

注：配制时，两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。

混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。

4、MS有机物母液（200X）称10升量溶解在50ml蒸馏水中。

配1升培养基母液5ml。

二、MS固体培养基的配制1、将配制好的MS培养基母液从冰箱中取出，按顺序排列，并逐一检查是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。

2、取少量的蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入烧杯中。

注意：配500ml培养基用1000ml烧杯。

3、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。

每1000ml培养基，需要：MS大量元素母液 20mlMS微量元素母液 10mlMS铁盐母液 10mlMS有机物母液 5ml4、通过计算，用微量移液器取所需的各种生长调节剂母液。

5、加入蔗糖（30g/L），溶解。

6、定容：用容量瓶。

7、调pH值：用0.1 N 和0.5N 的NaOH，一般pH=5.8。

注意：①经高温高压灭菌后，培养基的pH值会下降0.2—0.8，故调整后的pH值应高于目标pH值0.5个单位。