疟疾的实时荧光PCR快速检测方法
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疟疾的检查与诊断病原学检查确诊疟疾最可靠的依据是从受检者的外周血中检出疟原虫。
厚、薄血膜染色镜检是目前最常用的方法。
在高度怀疑疟疾时,如果血液涂片为阴性,应当重复涂片镜检。
血液涂片的染色常使用Giemsa染液、Field染液或其他Romanowsky染色劑。
镜检疟原虫时应当同时对厚血涂片和薄血涂片进行检查。
薄血涂片应迅速风干,用无水甲醇固定后染色,然后在油镜(放大1000倍)下检查膜尾红细胞,以每1000个红细胞的寄生红细胞个数表示。
厚血涂片很可能会不均匀,涂片时应充分干燥和染色,不得固定。
计数寄生虫和白细胞(至少200个),并根据总白细胞数目计算单位体积内的寄生虫数目。
在判断厚血涂片为阴性前,应在油镜下检查100~200个区域。
薄血涂片和厚血涂片有着各自的优点和缺点。
薄血涂片中疟原虫的形态完整而典型,容易识别和鉴别虫种,但疟原虫密度低时,容易漏检;厚血涂片制作过程中多层的红细胞相互重叠并且被溶解,因此可以使疟原虫集中(比薄血涂片集中40~100倍),提高检出灵敏度,但由于染色过程中红细胞溶解,疟原虫形态有所改变,虫种鉴别困难。
因此,最好在一张玻片上同时制作两种血涂片,如果在厚血涂片查到疟原虫而鉴别虫种困难时,可再检查薄血涂片。
恶性疟在发作开始时,间日疟在发作后数小时至10余小时采血能够提高检出率。
免疫学检查目前已经广泛使用的恶性疟原虫抗体诊断棒或诊断卡能够快速、简单、敏感和特异地对恶性疟原虫特异性、富含组氨酸的蛋白2(NHRP2)、乳酸脱氢酶或醛缩酶抗原进行检测,并借此将恶性疟和其他危险性较低的疟疾区分开来。
此外,常用的方法还有间接荧光抗体试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等。
由于抗体在患者治愈后仍能存在一段时间,且广泛存在个体差异,因此检测抗体主要用于疟疾的流行病学调查、防治效果评估及输血对象的筛选,在临床上仅作辅助诊断。
分子生物学技术聚合酶链式反应(PCR)和核酸探针已用于疟疾诊断。
分子生物学检测技术的最突出优点是对低疟原虫血症的检出率较高。
实时荧光pcr核酸检测方法
宝子们,今天咱们来唠唠实时荧光PCR核酸检测方法呀。
这个实时荧光PCR核酸检测呢,就像是一个超级侦探在找坏蛋(病毒核酸)。
它的原理有点像搭积木哦。
我们知道,核酸是由好多核苷酸组成的,就像小积木块。
检测的时候呢,先提取出咱们可能含有病毒的样本里的核酸。
这就好比从一个大杂烩里把关键的小零件挑出来。
然后呢,会有一些专门设计的小助手,也就是引物和探针。
引物就像两个小钩子,能准确地钩到病毒核酸特定的部位,然后在一种酶的帮助下,开始复制这个特定部位的核酸,让它的数量变多,这样就更容易被发现啦。
探针呢,就像一个带了小灯的小标记,当它和复制出来的核酸结合的时候,就会发出荧光信号。
仪器就像一个超级灵敏的眼睛,一直盯着这个反应过程呢。
如果样本里有病毒核酸,随着反应进行,荧光信号就会越来越强,就像小灯越来越亮。
如果没有病毒核酸呢,那基本上就没什么荧光信号啦。
这个检测方法可准了呢。
它能够快速地告诉我们,身体里是不是有病毒在悄悄捣乱。
而且呀,它的速度也比较快哦,就像一个短跑健将,在几个小时内就能出结果。
这对于及时发现病毒感染、控制疫情传播可太重要啦。
不过呢,这个检测也不是完美无缺的。
有时候可能会受到一些干扰,就像小侦探也会偶尔被假线索迷惑一下。
但是科学家们一直在努力改进,让这个检测方法越来越可靠。
疟疾诊断技术进展与应用疟疾是一种由寄生虫引起的传染病,主要通过蚊虫叮咬传播。
疟疾对全球范围内的许多国家和地区造成了严重的健康威胁,尤其是在非洲地区。
疟疾的及时诊断对于病患的治疗和预防具有至关重要的意义。
在过去的几十年里,疟疾诊断技术经历了许多进步和应用,使得疟疾的诊断变得更快捷、准确和便利。
本文将重点讨论疟疾诊断技术的进展与应用。
一、传统的疟疾诊断方法传统的疟疾诊断方法主要包括镜检和快速诊断试纸。
镜检是通过显微镜观察血液中的寄生虫来诊断疟疾,这种方法的优点在于可以确定寄生虫的种类和数量,但缺点是需要经过训练的医务人员进行操作,且需要较长的时间。
快速诊断试纸则是通过检测血液中的疟原虫特异性蛋白来进行诊断,操作简单,结果快速,但对于低感染量和混合感染的敏感度较差。
传统诊断方法存在的问题主要包括操作复杂、耗时长、准确性不高等,因此需要开发出更加快速、准确和便捷的疟疾诊断技术。
二、基因检测技术的应用随着基因技术的发展,基因检测技术逐渐应用于疟疾的诊断当中。
传统的疟原虫检测方法需要经过繁琐的血样制备、DNA提取和PCR扩增等步骤,操作复杂且耗时较长。
近年来,一些基于基因检测技术的疟疾诊断产品逐渐问世,例如LAMP技术、PCR技术等。
LAMP技术是一种基于等温酶链反应的核酸检测技术,相比于传统PCR技术具有操作简便、时间短、准确性高等优点。
通过LAMP技术可以快速检测出疟原虫的DNA,对于疟疾的早期诊断和快速筛查具有重要意义。
目前已经有一些商业化的LAMP试剂盒用于疟疾的诊断,相比传统方法具有更高的敏感度和特异性,且不需要昂贵的实验室设备,可以在基层医疗单位和偏远地区使用。
PCR技术在疟疾诊断中也有着重要的应用。
传统PCR技术需要昂贵的实验室设备和专业技术人员进行操作,限制了它在基层医疗单位的应用。
但是随着PCR技术的不断改进和商业化产品的推出,一些快速PCR仪器和试剂盒已经可以实现短时间内进行疟疾的诊断,大大提高了诊断效率。
·论著·3种PCR方法检测低密度恶性疟原虫血症的比较研究*李轲,周水森**,黄芳,夏志贵,郑香(中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室,世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心,上海200025)【摘要】 目的 对多重PCR、巢式PCR、实时PCR检测结果进行比较,筛选适合低密度恶性疟原虫血症的检测方法。
方法 实验室培养恶性疟原虫,同步化处理至环状体期占99%以上时涂制薄血膜,计数其原始密度。
实验分3组,原虫血均按1︰40、1︰80、1︰160、......1︰40 960等11个梯度进行稀释,涂制厚血膜,并用显微镜检查确定低密度恶性疟原虫血症密度;再作倍比系列稀释,用3种PCR方法进行检测,确定各种检测方法的检测限,并进行比较。
结果经显微镜检查确定配制的待测血样恶性疟原虫密度为21.92个/μl,多重PCR检测限为0.171 3个疟原虫/μl血,实时PCR为0.171 3个疟原虫/μl血,巢式PCR为0.085 6个疟原虫/μl血。
检出率巢式PCR≥实时PCR>多重PCR。
结论 3种PCR方法均可用于检测低密度恶性疟原虫血症。
巢式PCR检出率和检测限均优于其他两种方法。
【关键词】 低密度;疟原虫,恶性;聚合酶链式反应【中图分类号】 R382.31 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-5234(2013)04-0331-05[Journal of Pathogen Biology.2013Apr;8(4):331-335.]Research on methods to test for submicroscopic Plasmodium falciparuminfectionLI Ke,ZHOU Shui-sen,HUANG Fang,XIA Zhi-gui,ZHENG Xiang (National Institute of ParasiticDiseases,Chinese Center for Disease Control and Prevention,WHO Collaborating Centre for Malaria,Schistosomiasisand Filariasis,Shanghai 200025,China)【Abstract】 Objective To explore suitable methods of testing for submicroscopic Plasmodium falciparuminfection bycomparing detection with multiple PCR,nested PCR,and real-time PCR. Methods P.falciparum(FCCI/HN)wascultured and synchronized to the ring stage(>99%)in vitro,and parasites in Giemsa-stained thin smears were counted.The parasites were divided into three groups and each was then diluted to 1﹕40,1﹕80,1﹕160,1﹕320......1﹕40 960.Giemsa-stained thick smears of all of the diluted samples were tested microscopically and the threshold for submi-croscopic P.falciparumwas determined.Samples with submicroscopic parasites were then diluted 2-fold(1﹕2,1﹕22,1﹕23,1﹕24......).All of the samples were tested using multiple PCR,nested PCR,and real-time PCR and thelimit of each method was determined. Results The threshold for submicroscopic P.falciparumwas 21.92/μl.TheLOD was 0.171 3/μl for multiple PCR,0.171 3/μl for real-time PCR,and 0.085 6/μl for nested PCR.Nested PCR hadthe highest rate of detection,followed by real-time PCR and then multiple PCR. Conclusion All three methods aresuitable for detecting submicroscopic P.falciparum.Nested PCR had much better detection than the other two meth-ods.【Key words】 Submicroscopic;Plasmodium falciparum;PCR 我国已经进入疟疾消除阶段,疟疾流行程度较低,疟疾病例大幅减少。
疟疾的诊断和治疗一、疟疾概述疟疾是由疟原虫感染引起的一种寄生虫病。
该病主要通过蚊虫叮咬传播,全球范围内均有发生,尤其以亚非地区为高发区。
该病的主要症状包括高热、头痛、寒战、恶心、呕吐等,并可能导致严重并发症。
因此,疟疾的诊断和治疗至关重要。
二、疟疾的诊断常规的疟原虫诊断方法包括血液涂片法、血红蛋白盖屑法、引物扩增法等。
1.血液涂片法血液涂片法是一种直接检测疟原虫的方法,其操作简单、费用低廉,因此常被应用于基层医疗机构。
该方法仅适用于血液中疟疾特异性的镜检。
血液涂片法的敏感度与特异度较低,可能会出现假阴性或假阳性结果。
2.血红蛋白盖屑法血红蛋白盖屑法是通过制取患者血液中血红蛋白的盖屑,进行热凝集试验来检测疟原虫的方法。
该方法能够在比较短的时间内得出初步结果,但因为检测的是血红蛋白盖屑中的疟原虫结晶,因此也可能出现假阴性和假阳性。
3.引物扩增法引物扩增法是一种高度敏感和特异的疟原虫检测方法,能够检测低至 5 疟原虫/ml 的浓度。
该方法可通过多重引物扩增-实时荧光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)或寡核苷酸微芯片技术实现。
引物扩增法有较高的检测效率,但因为需要分离DNA,因此操作较为复杂。
三、疟疾的治疗疟疾的治疗依据疟疾的类型、患病程度以及病原菌的药物敏感性进行选择。
1. 氯喹和羟氯喹(4-氨基喹啉)氯喹和羟氯喹是目前治疗疟疾的主要药物,可用于治疗恶性疟和间日疟,并常与其他抗疟药物合用。
两种药物主要通过抑制疟原虫代谢途径的酵素活性,使其不能正常进行生存和分裂繁殖。
2. 阿莫洛芬阿莫洛芬是一种新型的抗疟药物,其抗疟作用主要是通过抑制疟原虫的代谢途径和蛋白质合成途径来发挥。
阿莫洛芬具有较高的安全性和良好的口服吸收性,适用于恶性疟和间日疟的治疗。
3. 青蒿素类药物青蒿素类药物是目前治疗疟疾的主要药物之一,其具有较快的抗疟效果和良好的耐药性。
青蒿素类药物主要通过氧化反应作用于疟原虫代谢途径,引起其死亡。
多重荧光定量PCR测定疟原虫方法建立目的建立可同时检测四种疟原虫的多重荧光定量PCR方法。
方法PCR 扩增四种疟原虫目的片段,克隆并构建标准质粒,进行梯度稀释。
体系按浓度加入五重引物探针,对临床四种疟原虫阳性血样及单一腺病毒和肺炎支原体阳性血样、人基因组进行特异性检测。
将本地区优势虫种恶性疟及间日疟阳性血样混合并检测。
每个反应做一式三份验证重复性。
检测标准品梯度浓度,获得体系最低检测限。
结果成功构建四种疟原虫标准质粒。
对20份样本进行检测,其中15份恶性疟,3份间日疟,1份三日疟,1份卵形疟,与原有确证结果一致。
对单一腺病毒及肺炎支原体阳性血样、人基因组检测结果均为阴性。
恶性疟及间日疟阳性血样混合检测显示3条特异性扩增曲线。
三个复孔的变异系数在0.17~4.96之间。
恶性疟可检测到102 copies/mL,间日疟、三日疟、卵形疟可检测到103 copies/mL。
结论建立五重荧光定量PCR检测四种疟原虫特异性及重复性均较好,灵敏度高,可用于疟原虫快速筛选及分型鉴定。
[Abstract] Objective To establish the multiple fluorescence quantitative PCR measure to detect four types of plasmodium at the same time. Methods Target fragments of four types of plasmodium were extended by PCR,the standard plasmid was cloned,constructed and diluted by gradient. Five primers and probes were added into the system according to the concentration and the clinical four plasmodium positive blood sample,single adenovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample as well as human gene was detected specifically. The falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample caused by the local superior plasmodium were mixed and detected. Each experiment was performed for three times to validate the repetitiveness. The gradient concentration of the sample was detected and the lowest detection limitation was achieved. Results The standard plasmids of four plasmodiums were successfully constructed and 20 samples were detected. 15 samples were falciparum malaria and 3 samples were tertian malaria,1 sample was quartan malaria and 1 sample was ovale malaria,which was in accordance with the original validated results. The results of detection of single adnovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample and human gene were negative. 3 specifically extended curves were presented by the mixed detection of falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample. The variable coefficients of the three duplication holes were within 0.17-4.96. Falciparum malaria was detected to be 102 copies/mL and tertian malaria,quartan malaria as well as ovale malaria was detected to be 103 copies/mL. Conclusion The established five fluorescence quantitative-PCR in the detection of four types of plasmodium has good specificity and repetitiveness as well as high sensitivity,which can be used in the quick screening and type identification of plasmodium.[Key words] Multiple fluorescence quantitative-PCR;Plasmodium;Mosquito-borne diseases;Malaria疟疾是由蚊子传播的一种寄生虫病,由带有疟原虫的雌性按蚊叮咬人体而传染,其已经成为全球热带、亚热带最严重的公共卫生问题之一[1]。
疟原虫检测标准操作程序疟原虫检测操作程序1.目的与原理1.1 目的:检查血液中是否有疟原虫。
1.2 原理:瑞氏染色原理。
瑞氏染料中含有美蓝和XXX两种染料,前者为碱性,后者为酸性。
它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力,使其显现出不同的色调,以便于辨认。
根据瑞氏染色的酸碱物质染色性不同,可将疟原虫各期的形态进行清楚染色,便于观察。
高倍镜下一般可以观察到各种类型的疟原虫(如间日疟、三日疟、恶性疟),以及疟原虫的各期,如环状体(早期滋养体)、晚期滋养体、裂殖体、配子体等。
2.样本收集和贮存2.1 原始样本:全血。
2.2 标本类型:EDTA抗凝血2ml。
标本的采集应使用标准一次性采血管,充分混匀,勿震荡。
2.3 保存条件:EDTA抗凝血尽快即时检测。
2.4 病人要求:必须在发烧时采血。
3.试剂3.1 瑞氏染液:3.1.1 试剂成分:瑞氏染料1.0g、无水甲醇500ml、甘油10ml。
3.1.2 配制方法:将瑞氏染料称量好后,放在乳钵中加少量无水甲醇匀速研磨至溶解。
将研磨好的染液倾倒入试剂储存瓶中,倒入无水甲醇继续研磨,反复多次,直至乳钵中无瑞氏染料沉淀为止。
配制好的染液放在37℃24小时后方可使用,放在阴凉干燥处,避光保存。
3.2 磷酸盐缓冲液PH6.4:3.2.1 脱水Na2HPO4 1份:处理方法将Na2HPO4于蒸发皿上干燥(火燃烘烤)成粉末称量。
3.2.2 无水KH2PO4 2.6份:将脱水Na2HPO4 1份和无水KH2PO4 2.6份充分混合,边研磨边混匀。
3.2.3 将上述粉末1g加溶解于500ml去离子水中,混合均匀,方可使用。
3.3 器材:载玻片、加样枪、吸头、推片器。
4.仪器显微镜OLYMPUS型号:CX21.4.1 开机前检查4.1.1 OLYMPUS显微镜:检查显微镜光路系统,目镜、物镜镜头正常,聚光器、光圈、螺旋、微螺旋调节正常。
4.2 日常维护:每日清理纤维镜表面,保持显微镜光圈、聚光器干净整洁。
疟疾实验室检查方法疟疾是一种由疟原虫引起的传染病,该病在全球范围内广泛分布,并造成了大量的疾病和死亡。
为了及时准确地诊断和治疗疟疾,实验室检查方法起着至关重要的作用。
本文将介绍疟疾实验室检查的常见方法。
1. 血涂片检查血涂片检查是最常用的疟疾实验室检查方法之一。
该方法通过在玻片上涂抹患者的血液样本,并使用特殊的染色剂染色,然后在显微镜下观察。
疟原虫在血液中的形态特征使其能够与其他细胞区分开来,从而能够准确地诊断疟疾。
血涂片检查的优点是简单易行,结果迅速可靠。
然而,该方法需要经过专业人员的训练和经验,以确保结果的准确性。
2. 快速诊断试纸检测快速诊断试纸检测是一种简便快速的疟疾实验室检查方法。
该方法基于抗原-抗体反应原理,通过在试纸上加入患者血液样本,检测疟原虫抗原或抗体的存在与否。
试纸通常具有几个测试线,每个测试线代表一种疟原虫类型。
根据试纸上测试线的出现情况,可以快速诊断疟疾的类型。
快速诊断试纸检测的优点是操作简单,结果迅速,适用于一线医疗机构和偏远地区的疟疾筛查。
3. 分子生物学检测分子生物学检测是一种高灵敏度和高特异性的疟疾实验室检查方法。
该方法通过提取患者血液中的疟原虫DNA或RNA,然后使用特定的引物和荧光探针进行PCR扩增和实时荧光检测。
分子生物学检测能够检测到非常低浓度的疟原虫,具有高度的准确性和敏感性。
然而,该方法需要复杂的实验室设备和专业人员的操作技术,限制了其在资源匮乏地区的应用。
4. 免疫荧光检测免疫荧光检测是一种基于抗原-抗体反应的疟疾实验室检查方法。
该方法通过在患者血液样本中加入特定的荧光标记抗体,与疟原虫抗原结合形成复合物,然后在荧光显微镜下观察。
免疫荧光检测可以同时检测多种疟原虫类型,并具有高度的特异性和敏感性。
然而,该方法需要昂贵的设备和专业人员的操作技术,限制了其在一线医疗机构和偏远地区的广泛应用。
总结起来,疟疾实验室检查方法包括血涂片检查、快速诊断试纸检测、分子生物学检测和免疫荧光检测。