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酶促反应动力学

酶促反应动力学
的抑制剂(inhibitor)。 使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，
不属于抑制剂。
通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。
（一）不可逆性抑制作用(irreversible inhibition) 不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价 键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使 酶丧失活性。常见的不可逆抑制剂如下图所 示。按其作用特点，又分专一性及非专一性 两种。
3.4 酶促反应动力学 酶促反应动力学(kinetics of enzymecatalyzed reactions)是研究酶促反应速度及其 影响因素的科学。 酶促反应的影响因素主要包括
1. 2. 3. 4. 5. 6. 底物的浓度、 酶的浓度、 pH、 温度、 抑制剂 激活剂
一、 底物浓度对反应速度的影响
木瓜蛋白酶
胆碱脂酶
动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃
蛋白酶的最适pH约1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8(见下表)。
一些酶的最适pH
五. 激活剂对酶反应速度的影响
能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(activator)，其 中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg++是多种激酶和 合成酶的激活剂，动物唾液中的α-淀粉酶则受Cl-的激活。
3、反应系统处于稳态平衡状态，即„ES‟的形成速度等于„ES‟ 的分解速度：d„ES‟/dt＝－d„ES‟/dt
Briggs和Haldane“稳态平衡”理论
（1） （2）
稳态平衡理论：
反应进行一段时间后，系统的ES浓度，由零逐渐 增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和 产物浓度不断变化，复合物ES的浓度也在不断的 生成和分解，但当系统中ES的生成速率和ES的分 解速率相等时，ES的浓度不变。

酶促反应动力学

酶促反应动力学
第九章 酶促反应动力学
第一节 酶促反应的动力学方程
一、化学动力学基础
1、反应分子数和反应级数 1）反应分子数
指在反应中真正相互作用的分子数。
A
P
A+B
P+Q
2）反应级数
指实验测得的反应速率与反应物浓度之间的关系，符合 哪种速率方程，则这个反应就是几级反应。
蔗糖 + H2O 蔗糖酶 葡萄糖 + 果糖
1
3）零级反应的特征
反应速率与反应物浓度无关。初始浓度增加，反应速度不变， 要使反应物减少一半所需完成的反应量增加，因此最后表现为半 衰期与初始浓度成正比。
二、底物浓度对酶促反应的影响
1、酶促反应初速度与底物浓度之间的关系 1903年Henri以蔗糖酶水解蔗糖为例，研究底物浓度与酶促反
应速度之间关系时，发现两者的关系符合双曲线关系。
k2
Km= (k2+k3)/k1
Km是[ES]的分解常数与生成常数的比值。 Km的真正含义是， Km越大意为着[ES]越不稳定，越容易分解。但不能说明[ES]是容 易分解成底物还是产物。
kcat/Km可表示为 [k3/(k2 + k3)]k1， k3/(k2 + k3)代表[ES] 分解成产 物的分解常数占[ES] 总分解常数的比值。 k3/(k2 + k3)越大，说明 [ES]越容易分解成产物。 k1是[ES] 生成常数。因此， kcat/Km数 值大不仅表示[ES]容易生成，还表示[ES]易分解成产物。真正代 表酶对某一特定底物的催化效率。所以，也称为专一性常数。 极限值是k1 ，意为[ES]不会再分解为底物。
酶的化学本质是蛋白质，因此，酶 对温度具有高度的敏感性，随着温度 的升高，分子的构象会逐渐地被破 坏，失去催化活性。

【生物化学】第六章 酶促反应动力学

【生物化学】第六章 酶促反应动力学
2
本章纲要
一、化学动力学基础 二、底物浓度对酶反应速度的影响 三、抑制剂对酶反应速度的影响 四、激活剂对酶反应速度的影响 五、温度对酶反应速度的影响 六、pH对酶反应速度的影响
一、化学动力学基础
了解反应速率及其测定 反应分子数和反应级数
一、化学动力学基础
㈠ 反应速率及其测定
单位时间内反应物的减少量或生成物的增加量用瞬时速率表示, 单位: 浓度/时间,研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准。
第六章 酶促反应动力学
Enzyme kinetics
概述
研究酶促反应的速率以及影响此速率的各 种因素的科学,是酶工程中的重要内容
研究酶结构和功能的关系以及酶的作用机 制，需要动力学提供实验数据
发挥酶促反应的高效率，寻找最为有利的 反应条件
酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制 具有理论研究的意义和实践价值
C是反应物的浓度变化, K为速率常数，是时间的倒数 基元反应:反应物分子在碰撞中一步直接转化为生成物分子的反应。
一、化学动力学基础
2. 反应级数：实验测得的表示反应速率与反应浓度之间关系的概念。 对于基元反应
1.一级反应单分子反应符合V=KC的反应
蔗糖+水
葡萄糖+果糖 V=KC蔗糖C水
由于水的浓度变化影响可忽略（非限制性因素）则V=KC蔗糖
二、底物浓度对酶反应速度的影响
㈠ 中间络合物学说
L.米歇利斯和L.M.门腾(1913)基于酶被底 物饱和的现象，提出“中间产物”学说:
酶与底物反应时，通过特异识别作用，先 形成酶底物复合物，然后再形成产物和酶分 子，酶分子重新结合底物。
该学说已得到大量实验证实
012345678
80
60

5.3酶促反应动力学

5.3酶促反应动力学

5.3酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括低物浓度、酶浓度、pH 、温度、激活剂与抑制剂、等。

一、酶的量度酶的含量不能直接用重量和摩尔数表示（不纯、失活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示1、酶活力与酶促反应速度酶活力：用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。

反应速度快，活力就越高。

酶量—酶活力一反应速度酶促反应速度的表示方法：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。

单位：浓度/单位时间研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。

因为底物浓度降低、酶部分失活产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。

2、酶的活力单位（U ）国际酶学会标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1umol 底物的酶量，称一个国际单位（IU ）。

特定条件：25℃ pH 及底物浓度采用最适条件（有时底物分子量不确定时，可用转化底物中1umol 的有关基团的酶量表示）。

2、酶的比活力 Specific activity每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。

单位：U/mg 蛋白质。

有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位表示。

酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。

酶的纯化倍数：酶的回收率： ×100% 4、酶的转换数和催化周期分子活性定义：每mol 的 enzyme 在1秒内转化substrate 的 mol 数。

亚基或催化中心活性定义：每mol 的active subunit 或 active center 在一秒内转化的substrate 的mol 数，称为转换数Kcat转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。

二、底物浓度对酶促反应速度的影响单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合催化的反应。

1913 Michaelis 和Menten 提出米—曼方程。

酶促反应动力学

酶促反应动力学
金属酶：含紧密结合的金属离子，多属过渡金属 金属-激活酶：含松散结合的金属离子，为碱和碱土
金属离子
金属离子以3种途径参加催化过程
通过结合底物为反应定向 通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反
应 通过静电稳定或屏蔽负电荷
酶促反应动力学
影响酶促反应的因素 温度： pH： 酶的浓度： 底物浓度： 抑制剂与激活剂：
亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电 子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓 的亲核攻击。
亲电催化：是由亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的催 化反应,是亲核催化的反过程．
酶活性中心广义酸碱基团
广义酸基团 （质子供体）
COOH NH3+ NH NH2+
NH2 SH
OH
HN NH+
广义碱基团 （质子受体）
..COO .. NH2
NH NH
NH2 SH
O
HN N
pKa
3.96(Asp),4.32(Glu )
10.80
12.48
8.33 10.11
6.00
Glu35
(CH2)2
COO H
CH2OH
R2
O
R1
O OH O
O
R2 CO-2 CH2OH
CH2
Asp52
底物
肽链
活性中心外 必需基团
结合基团
活 性
中
心
必
催化基团
需 基
团
活性中心
诱导-契合模型
（1）当底物和活 力中心结合时，酶 蛋白的构象发生了 一定的变化；
（2）催化基团正 确地定向，才能使 底物发生转变；

07-酶促反应动力学

07-酶促反应动力学
抑制剂常常与底物分 子的化学结构完全不同 抑制作用不能通过增 加底物浓度来解除
17
(二)、可逆抑制和不可逆 抑制的动力学鉴别
加入一定量的抑制剂，以V～[E]作图
不可逆抑制剂：部分酶失活 原点右移， 斜率不变 当[E] > 不可逆抑制剂浓度 时能显现出酶的活性
可逆抑制剂：原点不变， 斜率下降
18
(三)、可逆抑制作用的动力学
1．竞争性抑制
底物、抑制剂和酶之间有如下平衡
S + E + I
ki2 ki1
k1 k2 k3
ES
P + E
k2 Km k1
ki 2 Ki ki1
EI Ki：抑制常数（inhibitor constant）
19
(三)、可逆抑制作用的动力学
溶液平衡时 [E] = [Ef ] + [ES] + [EI]
Arg127,Glu270,Tyr248,Zn2+
37
Ser48,His51,NAD+, Zn2+
4、活性中心位于酶表面的一个裂缝内
疏水微环境 使底物分子有效浓度很高 个别极性残基有利于催化作用
5、底物与酶通过弱相互作用结合
稳定酶与底物的结合
6、具有柔性
酶的活性中心易受影响
酶活性
一级序列决定三维结构 氨基酸残基提供了结构基础
Vmax [ S ] V Km [S ]
[S ] Km [S ] [S ] Km V Vmax Vmax Vmax Vmax
纵轴截距: Km/Vmax , 斜率: 1/ Vmax， 横轴截距: -Km
13
二、酶的抑制作用
能引起蛋白质失活的条件都影响酶的活力， 引致酶活性丧失的作用称为失活作用 抑制作用(inhibition)： 引起酶活力降低或丧失的现象 抑制剂(inhibitor)： 使酶发生抑制作用的物质

酶促反应动力学


几种抑制剂
不可逆抑制剂 非专一性~：有机磷化合物（抑制蛋白酶和酯酶
活力）、有机汞、有机砷（与Cys的-SH）、重金属 盐、烷化试剂、氰化物、硫化物、CO（与酶中金 属结合）、青霉素（与糖肽转肽酶的Ser的-OH结合）
专一性~
Ks型~：亲和标记试剂 Kcat型~：自杀性底物
几种抑制剂
可逆抑制剂：（竞争性~）5‘-氟尿嘧啶、磺胺 药、过渡态底物类似物
活化能
酶反应与活化能
活化能是指一般分子成 为能参加化学反应的活 化分子所需要的能量；
要使反应进行迅速，途 径(1)外加能量；(2)降 低活化能；
中间络合物学说
1. 在酶催化反应S P时， 酶E先与底物S结合成中间 产物ES，ES转变为E和P， 表示为 E+S ES E+P
2. 实际的酶反应要复杂得多： 参加的底物不只一种；酶和 底物结合以及转化为底物和 酶的步骤有几步。
（5）Km=(k2+k3)/k1，若k3<<k2, 则Km近似于Ks； （6）Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径；
Vmax和k3
Vmax ：当反应物浓度增加时，酶催化反应的速 度趋于一个极限值；
k3 （kcat） ：当酶被底物饱和时每秒钟每个酶 分子转换底物的分子数，“转换数TN”
Vmax=[E]k3
锁-钥匙模型和诱导-契合模型
活性部位
只占相当小的部分（1~2%） 活性部位是一个三维实体 底物与酶相互作用的“诱导契合” 位于酶分子表面的一个裂缝内 底物通过次级键较弱的力结合到酶上 活性部位具有柔性或可运动性
酶分子中的其它部位为活性部位的形成提 供了结构的基础。
酶活性中心示意图
S-S
亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电 子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓 的亲核攻击。

第一章酶促反应动力学

反应时间
time (h)
反应时间
A
35
动力学参数rmax和Km
VPmaxk2[E0]
全部酶呈复合物状态时的反应速率，即最大初
始反应速率。
催化活性中心速率常数kcat:酶的活性中心在单位时
间内能转化底物分子为产物的最大数量，即酶的最大转换
速率。
单底物酶催化： kcat=k+2
A
36
米氏常数Km的意义
反应速率与酶浓度成正比(底物过量) 底物浓度对反应速率的影响：
非线性。底物浓度较低，反应速率随底物浓度 提高而增加；底物浓度较高，反应速率随底物浓度 的提高而趋于稳定。
A
33
底物浓度与反应速率的关系
0.24
反应速率 v (mmol/L/h)
S
0.18
0.12
12vVS,mm 0.06
0.00
0.0
3. 忽略产物的抑制作用，不考虑P+E→ES这个可逆反应的 存在。
4. [ES]在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡, ES分解
生成产物的速度不足以破A 坏这个平衡。
23
E ＋S
k+1
k-1
ES k+2 E ＋ P
➢ 对于单底物的酶促反应:
dP
dS
dtt0 dtt0
由假设4可得到： k1[E]S []k1[E]S (1)
A
40
M-M方程动力学参数的确定
作图法(通过方程变换，将方程线性化)
✓L-B法 ✓H-W法 ✓E-H法 ✓积分法
非线性最小二乘法回归处理
✓信赖域法(Matlab的优化工具箱) ✓遗传算法(不依赖于初值，可并行计算)
A
41

第二章 酶促反应动力学


1 (b0
c)
d (b0
c)
c 0
1 (a0
c)
d (a0
c)
k2
t 0
dt
1
(a0 b0 )
ln(a0 c) |c0 ln(b0 c) |c0
k2t |t0
(a0
1
b0
)
ln(a0
c)
ln
a0
ln(b0
c)
ln
b0
k2t
(a0
1
b0
)
ln
b0 (a0 a0 (b0
dc dt
k2[ A][B]
dc dt
k2 a0
cb0
c
式中：
K2—二级反应速率常数； a0—底物A的初始浓度； b0—底物B的初始浓度； c—t时产物c的浓度。
dc dt
k2 a0
cb0
c
第二章 酶促反应动力学
dc
a0 cb0 c k2dt
[(a0 c) (b0 c)]dc (a0 b0 )(a0 c)(b0 c)
b
Ce k2t
k1a0 k2 k1
ek1t
第二章 酶促反应动力学
t＝0时,b＝0，代入上式求得C
C
k1a0 k2 k1
b k1a0 ek1t ek2举例
葡萄糖G k1 葡萄糖内酯L k2 葡萄糖酸P
[L] k1[G0 ] ek1t ek2t k2 k1
k2dt
(a0
1
b0
)
•
(b0
1
c)
1 (a0
c)
dc
k2dt
c 0
(a0
1
b0

第二章酶促反应动力学


rmax/2
Km
CS
图2－1 酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影 响
对米氏方程 rmax C
反应。
Km r rmax
S
，属一级
• 当CS>>Km时，r rmax ，属零级反 2 应。
• 当CS＝Km时， 。Km在数 量上等于反应速度达到最大反应
双倒数法(Linewear Burk):
可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。 对酶促反应A B CD，有：
rrArPkA C C B
rA


dCA dt
式中，
rP

dC P dt
k：酶促反应速率常数；
r：酶促反应速率；
rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率；
rP：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率。
对连锁的酶促反应， A k1 M k2 P

dCA dt

k1CA
dCM dt
k1CAk2CM
dCP dt
k2CM
2.2.2 单底物酶促反应动力学
2.2.2.1 米氏方程
根据酶－底物中间复合物假说，
对单底物酶促反S应P ，其反应
机制可表示为：
k1
k2
ESESEP
k1
快速平衡法推导动力学方程：
几点假设：
（1）CS>>CE，中间复合物ES的形 成不会降低CS。
2.1.3 酶和细胞的固定化技术
一、固定化技术的基本概念 二、固定化酶的特性 三、固定化细胞的特性 四、酶和细胞的固定化技术
2.1.4 酶促反应的特征
一、优点： • 常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应； • 与一些化学反应相比，省能且效率较高； • 专一性好； • 反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制等。 二、不足， • 多限于一步或几步较简单的生化反应过程； • 一般周期较长。
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类及反应条件有关，与酶的浓度无关。所以可以用于鉴定酶。 对于专一性不强的酶来说对于每一个底物都有一个相应的Km
值.
②. 判断酶的专一性或最适底物（天然底物）
同一个酶催化不同底物时
Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物
蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),
也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),蔗糖为天然底物。
1903年Henri用蔗糖酶水解蔗糖实验
一 级 反 应
V Vmax
[S]
当底物浓度较低时：
反应速度与底物浓度成正比关系； 反应为一级反应。
混合级反应
V
Vmax
[S]
随着底物浓度的增高：
反应速度不再成正比例加速； 反应为混合级反应。
零级反应
V Vmax
[S]
当底物浓度高达一定程度：
反应速度不再增加，达最大速度； 反应为零级反应
酶促反应动力学
概念
研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加
以定量的阐述。 影响因素包括有
底物浓度：米氏方程 酶浓度：Vmax=K3 [E]
Ｖ＝
Vmax[S]
Km + [S]


抑制剂：可逆抑制剂和不可逆抑制剂
激活剂： pH：最适PH 温度：最适温度
一. 化学动力学
（一）、反应速度及其测定：
（2）. Vmax与K3（Kcat）的意义
Vmax（不是酶的特征常数） maximum velocity
① 定义:是酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度成正比. ② 意义:Vmax=K3 [E] （k3是一级反应速率常数）
如果酶的总浓度已知,可从Vmax计算 酶的转换数即动力
学常数K3
Catalytic constant
理论基础：中间产物学说
假设：反义速率(v)和[ES]成正比 发展: (1) 最初.Michaelis和Menten 是根据“快速平衡 假说” 推出米式方程。 (2) 以后.Briggs和Haldane的“稳态平衡假说”及其对
米式
方程的发展：
（一） 中间复合物假说
中间产物学说认为：当酶催化某个反应时 , 酶和底 物先结合形成一个中间复合物 , 然后中间复合物再分解 , 生成产物并释放出酶。一般以产物的生成速度代表整个 酶催化反应速度，而产物的生成取决于中间物的浓度 . 因此, 整个酶促反应的速度取决于中间物的浓度.
产物形成趋势K3／K1有关）
★ 都是K3惹的祸
米氏常数（Km）的意义
④、如果Km知道，可以计算某一底物浓度时速度和最 高速度的比值。 ⑤、推导某一代谢的方向

正逆反应方向： 链式反应中的限速步骤： Km小的反应方向趋势强
多条反应途径的方向：
Km最大的步骤常是限速步骤
⑥：了解酶的底物在体内具有的浓度水平。
V
1/2Vmax Km [S]
③. 1/Km 近似表示酶与底物亲和力
K 1 K 3 E S ES P E K2
准确应用Ks表示 Ks =K2／K1
★ Ks是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力）， 1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。 ★ ★ 只有当K1 、 K2》K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近 底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与 似地表示底物亲和力的大小。
③ K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分
子数，称为转换数（或催化常数，Kcat）， 表明酶的最大
催化效率
反应速度，反而可能对细胞造成不良影响。
米氏常数（Km）的意义
⑦ 判断可逆抑制剂的抑制类型。 竞争性变大，非竞争性不变，反竞争性减小 ⑧ 在测定酶活性时，要使初速度V基本上接近于 Vmax，一般要[S]≥10～20Km。换言之，在测 定酶浓度（活性）时 ，至少应该在0.9Vmax 的[S]，使其酶促反应过程中S的消 耗量 ≤1%～5%。
V max [ S ] V max [ S ] V K’ [S ] 当[S]《 Km 时（一级反应） Km [ S ] Km V max [ S ] V max [ S ] V max 当[S] 》Km 时（零级反应） V Km [ S ] [S ]
当[S] = Km 时
（二）、反应分子数和反应级数
1. 反应分子数
单分子数 2分子数 3分子数ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ4分子数
2. 反应级数及特征
一级反应：反应速率与反应物的浓度的一次方成正比。 二级反应：反应速率与两种物质浓度的乘积成正比。 零级反应：反应速率与反应物浓度无关的反应。
混合级反应：
二、底物浓度对酶促反应速度的影响
酶促反应动力学方程式 米氏方程（Michaelis-Mentent equation）:表示一个酶促 反应的起始速度（υ）与底物浓度([s])关系的速度方程 条件：单底物，单产物的反应
中间产物假说证据：
（1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性 （3）结晶ES复合物的获得。(4)底物和酶共沉降 （5） ES复合物被电子显微镜或X-射线衍射法观 察到。
1、米式方程
[S]:底物浓度;
（二）. 酶促反应动力方程式
V:不同[S]时的反应速度; Vmax:最大反应速度(maximum velocity); Km:米氏常数(Michaelis constant)。 (不是反应平衡常数）
对活细胞的试验测定表明，酶的底物浓度通常就 在这种底物的Km 值附近，请解释其生理意义。为什 么底物浓度不是远远高于Km 或远远低于Km呢？
据 v-[S] 的米氏曲线，当底物浓度远远低于 Km 值时， 酶不能被底物饱和，从酶的利用角度而言，很不经济；当底 物浓度远远高于 Km 值时，酶趋于被饱和，随底物浓度改变， 反应速度变化不大，不利于反应速度的调节；当底物浓度在 Km 值附近时，反应速度对底物浓度的变化较为敏感，有利 于反应速度的调节。另外，过高的底物浓度并不能明显提高
V max [ S ] V max V Km [ S ] 2
2. 动力学参数的意义
（1）. 米氏常数（Km）的意义
物理意义: 当反应速度达到最大反应速度（Vmax)的一
半时的底物浓度. 单位：mol· L-1或mmol· L-1
Km与酶的浓度无关
① Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种