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酶促反应动力学

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酶促反应动力学

酶促反应动力学
的抑制剂(inhibitor)。 使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，
不属于抑制剂。
通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。
（一）不可逆性抑制作用(irreversible inhibition) 不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价 键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使 酶丧失活性。常见的不可逆抑制剂如下图所 示。按其作用特点，又分专一性及非专一性 两种。
3.4 酶促反应动力学 酶促反应动力学(kinetics of enzymecatalyzed reactions)是研究酶促反应速度及其 影响因素的科学。 酶促反应的影响因素主要包括
1. 2. 3. 4. 5. 6. 底物的浓度、 酶的浓度、 pH、 温度、 抑制剂 激活剂
一、 底物浓度对反应速度的影响
木瓜蛋白酶
胆碱脂酶
动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃
蛋白酶的最适pH约1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8(见下表)。
一些酶的最适pH
五. 激活剂对酶反应速度的影响
能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(activator)，其 中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg++是多种激酶和 合成酶的激活剂，动物唾液中的α-淀粉酶则受Cl-的激活。
3、反应系统处于稳态平衡状态，即„ES‟的形成速度等于„ES‟ 的分解速度：d„ES‟/dt＝－d„ES‟/dt
Briggs和Haldane“稳态平衡”理论
（1） （2）
稳态平衡理论：
反应进行一段时间后，系统的ES浓度，由零逐渐 增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和 产物浓度不断变化，复合物ES的浓度也在不断的 生成和分解，但当系统中ES的生成速率和ES的分 解速率相等时，ES的浓度不变。

第五节 酶促反应动力学

第五节 酶促反应动力学

第五节酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应速度的规律以及影响酶促反应速度的各种因素。

这些因素主要包括酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。

由于酶作为生物催化剂的特征就是加快化学反应的速度，因此，研究酶促反应的速度规律, 是酶学研究的重要内容之一；同时，在酶的结构与功能的关系以及酶作用机理的研究中，常需要动力学提供实验证据；在实际工作中为了使酶能最大限度地发挥其催化效率,亦需寻找酶作用的最佳条件；以及为了解酶在代谢中的作用或某些药物的作用机理时，需要研究酶促反应的速度规律。

因此对酶促反应动力学的研究，具有重要的理论和实际价值。

一、底物浓度对反应速度的影响（一）底物浓度对反应速度的关系在其他因素，如酶浓度、pH、温度等不变的情况下，底物浓度的变化与酶促反应速度之间呈矩形双曲线关系（图3-1）。

图3-1底物浓度对反应初速度的影响从图中可以看出：1．在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤上升，两者呈正比关系，表现为一级反应；2．随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度变缓，表现为混合级反应；3．如果继续增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。

此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加。

这说明酶已被底物所饱和。

所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需的底物浓度各不相同而已。

（二）米氏方程Michaelis 和Menten 在前人工作的基础上，经过大量的实验，1913年前后提出了反应速度和底物浓度关系的数学方程式，即著名的米曼氏方程(Michaelis-Menten equation)，简称米氏方程．max [S][S]=+m V v K式中V max 为最大反应速度（maximum velocity ），[S]为底物浓度，K m 为米氏常数（Michaelis constant ），ν是在不同[S]时的反应速度。

当底物浓度很低（[S]<<K m ）时，max[S]mV v K =，反应速度与底物浓度成正比。

酶促反应动力学米氏方程

酶促反应动力学米氏方程

酶促反应动力学米氏方程摘要：1.酶促反应动力学的基本概念2.米氏方程的推导过程3.米氏方程的应用4.酶促反应动力学的影响因素5.总结正文：一、酶促反应动力学的基本概念酶促反应动力学是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。

在酶促反应中，酶作为催化剂，可以降低反应所需的活化能，从而加速反应速率。

酶促反应动力学主要研究酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂等因素对反应速率的影响。

二、米氏方程的推导过程米氏方程是描述酶促反应速度与底物浓度之间关系的经典方程。

其推导过程如下：1.假设酶分子的数量为[E]，底物浓度为[S]，酶促反应速度为v。

2.酶在催化过程中会与底物结合形成酶- 底物复合物（ES），此过程为慢反应。

3.酶- 底物复合物在达到一定程度后会分解为酶和产物，此过程为快反应。

4.根据慢反应和快反应的速率常数，可以得到酶促反应速度的表达式。

5.将表达式中的慢反应和快反应速率常数用米氏常数（Km）表示，即可得到米氏方程：v = (Km * [S]) / (Km + [S])三、米氏方程的应用米氏方程可以用于分析酶促反应的动态过程，预测反应速度与底物浓度的关系，以及研究酶的结构与功能。

此外，通过比较不同底物和酶的米氏方程，可以了解酶的专一性和底物选择性。

四、酶促反应动力学的影响因素酶促反应动力学受到多种因素的影响，主要包括：1.酶浓度：在一定范围内，酶浓度的增加会提高反应速率，但当酶浓度达到饱和时，反应速率不再随酶浓度增加而提高。

2.底物浓度：底物浓度的增加会提高反应速率，但当底物浓度达到一定程度时，反应速率不再随底物浓度增加而提高。

3.温度：温度的升高会加速反应速率，但过高的温度会导致酶失活，使反应速率降低。

4.pH：酶的活性受pH 值的影响，pH 值的改变会影响酶的催化效率。

5.抑制剂和激活剂：抑制剂会降低酶的催化效率，而激活剂会提高酶的催化效率。

五、总结酶促反应动力学是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。

酶促反应动力学

酶促反应动力学
第九章 酶促反应动力学
第一节 酶促反应的动力学方程
一、化学动力学基础
1、反应分子数和反应级数 1）反应分子数
指在反应中真正相互作用的分子数。
A
P
A+B
P+Q
2）反应级数
指实验测得的反应速率与反应物浓度之间的关系，符合 哪种速率方程，则这个反应就是几级反应。
蔗糖 + H2O 蔗糖酶 葡萄糖 + 果糖
1
3）零级反应的特征
反应速率与反应物浓度无关。初始浓度增加，反应速度不变， 要使反应物减少一半所需完成的反应量增加，因此最后表现为半 衰期与初始浓度成正比。
二、底物浓度对酶促反应的影响
1、酶促反应初速度与底物浓度之间的关系 1903年Henri以蔗糖酶水解蔗糖为例，研究底物浓度与酶促反
应速度之间关系时，发现两者的关系符合双曲线关系。
k2
Km= (k2+k3)/k1
Km是[ES]的分解常数与生成常数的比值。 Km的真正含义是， Km越大意为着[ES]越不稳定，越容易分解。但不能说明[ES]是容 易分解成底物还是产物。
kcat/Km可表示为 [k3/(k2 + k3)]k1， k3/(k2 + k3)代表[ES] 分解成产 物的分解常数占[ES] 总分解常数的比值。 k3/(k2 + k3)越大，说明 [ES]越容易分解成产物。 k1是[ES] 生成常数。因此， kcat/Km数 值大不仅表示[ES]容易生成，还表示[ES]易分解成产物。真正代 表酶对某一特定底物的催化效率。所以，也称为专一性常数。 极限值是k1 ，意为[ES]不会再分解为底物。
酶的化学本质是蛋白质，因此，酶 对温度具有高度的敏感性，随着温度 的升高，分子的构象会逐渐地被破 坏，失去催化活性。

酶促动力学

酶促动力学

H C
S CHCl E S As
H C
CHCl + 2HCl
巯基酶
S E S
路易士气
H2C SH
失活的酶
酸
H As C CHCl + HC SH H2C OH
H SH H2C S As C CHCl + HC S E SH H2C OH
失活的酶
BAL
巯基酶 BAL与砷剂结合物
三、酶的抑制作用
（五）一些重要的抑制剂
*竟争性抑制举例
1.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制
琥珀酸
琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2
延胡索酸
COOH CH2 C H2 COOH 琥珀酸
COOH CH2 COOH 丙二酸
•
磺胺类药物的抑菌机制
与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶
二氢蝶呤啶 ＋ 对氨基苯甲酸 ＋ 谷氨酸
二氢叶酸 合成酶 二氢叶酸
H2N
加入非竞争性抑制 剂后，Km 不变，而 Vmax减小。

非竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图 ：
加入非竞争性抑制剂 后，Km 不变，而 Vmax减小。
非竞争性抑制剂与酶活 性中心以外的基团结合。 这类抑制作用不会因提高 底物浓度而减弱
三、酶的抑制作用
(二) 抑制作用的类型
（3）反竞争性抑制

影响因素包括有
底物浓度、pH、温度、 抑制剂、激活剂、酶浓度等。
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。

影响酶促反应速率的因素：
底物浓度[S] 酶浓度[E] 反应温度 pH 值 抑制剂I 激活剂A
二、底物浓度对酶反应速度的影响
355
当底物浓度达到一定值 反应速度达到最大值 （Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加

【生物化学】第六章 酶促反应动力学

【生物化学】第六章 酶促反应动力学
2
本章纲要
一、化学动力学基础 二、底物浓度对酶反应速度的影响 三、抑制剂对酶反应速度的影响 四、激活剂对酶反应速度的影响 五、温度对酶反应速度的影响 六、pH对酶反应速度的影响
一、化学动力学基础
了解反应速率及其测定 反应分子数和反应级数
一、化学动力学基础
㈠ 反应速率及其测定
单位时间内反应物的减少量或生成物的增加量用瞬时速率表示, 单位: 浓度/时间,研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准。
第六章 酶促反应动力学
Enzyme kinetics
概述
研究酶促反应的速率以及影响此速率的各 种因素的科学,是酶工程中的重要内容
研究酶结构和功能的关系以及酶的作用机 制，需要动力学提供实验数据
发挥酶促反应的高效率，寻找最为有利的 反应条件
酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制 具有理论研究的意义和实践价值
C是反应物的浓度变化, K为速率常数，是时间的倒数 基元反应:反应物分子在碰撞中一步直接转化为生成物分子的反应。
一、化学动力学基础
2. 反应级数：实验测得的表示反应速率与反应浓度之间关系的概念。 对于基元反应
1.一级反应单分子反应符合V=KC的反应
蔗糖+水
葡萄糖+果糖 V=KC蔗糖C水
由于水的浓度变化影响可忽略（非限制性因素）则V=KC蔗糖
二、底物浓度对酶反应速度的影响
㈠ 中间络合物学说
L.米歇利斯和L.M.门腾(1913)基于酶被底 物饱和的现象，提出“中间产物”学说:
酶与底物反应时，通过特异识别作用，先 形成酶底物复合物，然后再形成产物和酶分 子，酶分子重新结合底物。
该学说已得到大量实验证实
012345678
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5.3酶促反应动力学

5.3酶促反应动力学

5.3酶促反应动力学酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括低物浓度、酶浓度、pH 、温度、激活剂与抑制剂、等。

一、酶的量度酶的含量不能直接用重量和摩尔数表示（不纯、失活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示1、酶活力与酶促反应速度酶活力：用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。

反应速度快，活力就越高。

酶量—酶活力一反应速度酶促反应速度的表示方法：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。

单位：浓度/单位时间研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。

因为底物浓度降低、酶部分失活产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。

2、酶的活力单位（U ）国际酶学会标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1umol 底物的酶量，称一个国际单位（IU ）。

特定条件：25℃ pH 及底物浓度采用最适条件（有时底物分子量不确定时，可用转化底物中1umol 的有关基团的酶量表示）。

2、酶的比活力 Specific activity每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。

单位：U/mg 蛋白质。

有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位表示。

酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。

酶的纯化倍数：酶的回收率： ×100% 4、酶的转换数和催化周期分子活性定义：每mol 的 enzyme 在1秒内转化substrate 的 mol 数。

亚基或催化中心活性定义：每mol 的active subunit 或 active center 在一秒内转化的substrate 的mol 数，称为转换数Kcat转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。

二、底物浓度对酶促反应速度的影响单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合催化的反应。

1913 Michaelis 和Menten 提出米—曼方程。

酶促反应动力学

酶促反应动力学
金属酶：含紧密结合的金属离子，多属过渡金属 金属-激活酶：含松散结合的金属离子，为碱和碱土
金属离子
金属离子以3种途径参加催化过程
通过结合底物为反应定向 通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反
应 通过静电稳定或屏蔽负电荷
酶促反应动力学
影响酶促反应的因素 温度： pH： 酶的浓度： 底物浓度： 抑制剂与激活剂：
亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电 子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓 的亲核攻击。
亲电催化：是由亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的催 化反应,是亲核催化的反过程．
酶活性中心广义酸碱基团
广义酸基团 （质子供体）
COOH NH3+ NH NH2+
NH2 SH
OH
HN NH+
广义碱基团 （质子受体）
..COO .. NH2
NH NH
NH2 SH
O
HN N
pKa
3.96(Asp),4.32(Glu )
10.80
12.48
8.33 10.11
6.00
Glu35
(CH2)2
COO H
CH2OH
R2
O
R1
O OH O
O
R2 CO-2 CH2OH
CH2
Asp52
底物
肽链
活性中心外 必需基团
结合基团
活 性
中
心
必
催化基团
需 基
团
活性中心
诱导-契合模型
（1）当底物和活 力中心结合时，酶 蛋白的构象发生了 一定的变化；
（2）催化基团正 确地定向，才能使 底物发生转变；

07-酶促反应动力学

07-酶促反应动力学
抑制剂常常与底物分 子的化学结构完全不同 抑制作用不能通过增 加底物浓度来解除
17
(二)、可逆抑制和不可逆 抑制的动力学鉴别
加入一定量的抑制剂，以V～[E]作图
不可逆抑制剂：部分酶失活 原点右移， 斜率不变 当[E] > 不可逆抑制剂浓度 时能显现出酶的活性
可逆抑制剂：原点不变， 斜率下降
18
(三)、可逆抑制作用的动力学
1．竞争性抑制
底物、抑制剂和酶之间有如下平衡
S + E + I
ki2 ki1
k1 k2 k3
ES
P + E
k2 Km k1
ki 2 Ki ki1
EI Ki：抑制常数（inhibitor constant）
19
(三)、可逆抑制作用的动力学
溶液平衡时 [E] = [Ef ] + [ES] + [EI]
Arg127,Glu270,Tyr248,Zn2+
37
Ser48,His51,NAD+, Zn2+
4、活性中心位于酶表面的一个裂缝内
疏水微环境 使底物分子有效浓度很高 个别极性残基有利于催化作用
5、底物与酶通过弱相互作用结合
稳定酶与底物的结合
6、具有柔性
酶的活性中心易受影响
酶活性
一级序列决定三维结构 氨基酸残基提供了结构基础
Vmax [ S ] V Km [S ]
[S ] Km [S ] [S ] Km V Vmax Vmax Vmax Vmax
纵轴截距: Km/Vmax , 斜率: 1/ Vmax， 横轴截距: -Km
13
二、酶的抑制作用
能引起蛋白质失活的条件都影响酶的活力， 引致酶活性丧失的作用称为失活作用 抑制作用(inhibition)： 引起酶活力降低或丧失的现象 抑制剂(inhibitor)： 使酶发生抑制作用的物质

第二章-酶促反应动力学

第二章-酶促反应动力学
• 一个标准酶活单位定义为：每分钟使果胶裂解产生1μmol的不饱 和聚半乳糖醛酸所需的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的 摩尔吸光系数为4600Lmol-1cm-1[6]。
• U =（A/4600）×106×10-3×3×10×（1/10）×n
• = A×n×(30/46)
• 式中：U-----------酶液的酶活力， U/mL
KS CS
稳态法推导动力学方程：
几点假设：
（1）CS>>CE，中间复合物ES的形成不会降 低CS。
（2）不考虑这个可逆反应。
（3）CS>>CE中间复合物ES一经分解，产生 的游离酶立即与底物结合，使中间复合物 ES浓度保持衡定，即 。 dC ES 0
dt
根据以上假设，可建立如下方程组
rk2CES
（3）E S E为S 快速平衡，E S E P 为整个反应的限速阶段，因此ES分解 成产物不足以破坏这个平衡。
根据假设建立动力学方程
rk2CES
dCES dt
k1CECSk1CES0
C E0C EC ES
CECS CES
KS
k1 k1
解之，得
r k2CE0CS KS CS
令 rmaxk2CE0 则 r rmaxCS
• A —————OD值
• n ———— 酶液稀释倍数
2.1 酶促反应动力学的特点
2.1.1 酶的基本概念 2.1.2 酶的稳定性及应用特点
酶是以活力、而不是以质量购销的。 酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药 用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺 条件所需纯度更高的酶。
经典酶学研究中，酶反应速率的测定是在反应的 初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低， 且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机 制。

酶促反应动力学

酶促反应动力学

木瓜蛋白酶
胆碱脂酶
PH影响酶活力的原因可能有以下几个方面 ：
1、过酸过碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶 变性失活。 2、PH影响底物分子和酶分子的解离状态。最 适PH与酶活性中心结合底物的基团及参与催化的 基团PK值有关，往往只有一种解离状态最有利于 与底物结合，在此PH下酶活力最高；也可能影响 到中间产物ES的解离状态。总之，都影响到ES 的形成，从而降低酶活性。 3、PH可影响酶分子中另一些基团的解离，这 些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活 力中心的构象有关。
[ES]分解的速度为：v2+v3=[ES]（k2+k3）
根据恒态理论，ES形成的速度应等于分解的速度，所以： k1（[E]—[ES]）（[S]） = [ES]（k2+k3） 即：
（k2+k3）/k1=
（[E]—[ES]）（[S]） /[ES]
令Km= （k2+k3）/k1 ，则有 Km= （[E]—[ES]）（[S]） /[ES] 也就是 [ES]=[E][S]/（Km+[S]） 因为反应速度的大小与[ES]成正比，即v=k3[ES]，将 其带入上式则变换为： v=k3[E][S]/（Km+[S]） 而当底物浓度很高时，酶全部被底物所饱和，此时 [E]=[ES]，而反应速度达到最大反应速度，即： Vmax=k3[ES]=k3[E]，所以将其带入上式即可得到以下 表达式： v=Vmax[S]/（Km+[S]） 即米氏方程式。
三）酶浓度的影响 在酶促反应中，如果底物 浓度足够大，足以使酶饱和， 则反应速度与酶浓度成正比。 如右图。 这种正比关系可由下式表 示： V=K∙[E] 该式也可以由米氏方程推 导出来。式中的K表示K3[S]/ （Km+[S]）。 注意：使用的酶必须是纯酶制 剂或不含抑制物的粗酶制剂。

酶促反应动力学

酶促反应动力学

几种抑制剂
不可逆抑制剂 非专一性~：有机磷化合物（抑制蛋白酶和酯酶
活力）、有机汞、有机砷（与Cys的-SH）、重金属 盐、烷化试剂、氰化物、硫化物、CO（与酶中金 属结合）、青霉素（与糖肽转肽酶的Ser的-OH结合）
专一性~
Ks型~：亲和标记试剂 Kcat型~：自杀性底物
几种抑制剂
可逆抑制剂：（竞争性~）5‘-氟尿嘧啶、磺胺 药、过渡态底物类似物
活化能
酶反应与活化能
活化能是指一般分子成 为能参加化学反应的活 化分子所需要的能量；
要使反应进行迅速，途 径(1)外加能量；(2)降 低活化能；
中间络合物学说
1. 在酶催化反应S P时， 酶E先与底物S结合成中间 产物ES，ES转变为E和P， 表示为 E+S ES E+P
2. 实际的酶反应要复杂得多： 参加的底物不只一种；酶和 底物结合以及转化为底物和 酶的步骤有几步。
（5）Km=(k2+k3)/k1，若k3<<k2, 则Km近似于Ks； （6）Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径；
Vmax和k3
Vmax ：当反应物浓度增加时，酶催化反应的速 度趋于一个极限值；
k3 （kcat） ：当酶被底物饱和时每秒钟每个酶 分子转换底物的分子数，“转换数TN”
Vmax=[E]k3
锁-钥匙模型和诱导-契合模型
活性部位
只占相当小的部分（1~2%） 活性部位是一个三维实体 底物与酶相互作用的“诱导契合” 位于酶分子表面的一个裂缝内 底物通过次级键较弱的力结合到酶上 活性部位具有柔性或可运动性
酶分子中的其它部位为活性部位的形成提 供了结构的基础。
酶活性中心示意图
S-S
亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电 子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓 的亲核攻击。

第一章酶促反应动力学

第一章酶促反应动力学
反应时间
time (h)
反应时间
A
35
动力学参数rmax和Km
VPmaxk2[E0]
全部酶呈复合物状态时的反应速率，即最大初
始反应速率。
催化活性中心速率常数kcat:酶的活性中心在单位时
间内能转化底物分子为产物的最大数量，即酶的最大转换
速率。
单底物酶催化： kcat=k+2
A
36
米氏常数Km的意义
反应速率与酶浓度成正比(底物过量) 底物浓度对反应速率的影响：
非线性。底物浓度较低，反应速率随底物浓度 提高而增加；底物浓度较高，反应速率随底物浓度 的提高而趋于稳定。
A
33
底物浓度与反应速率的关系
0.24
反应速率 v (mmol/L/h)
S
0.18
0.12
12vVS,mm 0.06
0.00
0.0
3. 忽略产物的抑制作用，不考虑P+E→ES这个可逆反应的 存在。
4. [ES]在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡, ES分解
生成产物的速度不足以破A 坏这个平衡。
23
E ＋S
k+1
k-1
ES k+2 E ＋ P
➢ 对于单底物的酶促反应:
dP
dS
dtt0 dtt0
由假设4可得到： k1[E]S []k1[E]S (1)
A
40
M-M方程动力学参数的确定
作图法(通过方程变换，将方程线性化)
✓L-B法 ✓H-W法 ✓E-H法 ✓积分法
非线性最小二乘法回归处理
✓信赖域法(Matlab的优化工具箱) ✓遗传算法(不依赖于初值，可并行计算)
A
41

第7章 酶促反应动力学

第7章 酶促反应动力学

符合一级反应动力学，酶未被全部饱和，因此在[S]低时不能 正确测得酶活力； （2）当[S]>>Km时，v=Vmax，此条件下可正解测得酶活力 （3）当[S]=Km时，v=Vmax/2
Km的意义
1、Km是酶的特征物理常数 Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关，但与底物、 温度、pH及离子强度有关。 2、Km可判断酶的专一性和天然底物 Km最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。1/km近似 表示酶与底物的亲和力。 3、当k3<<k2时，Km=k2/k1，Km=Ks（解离常数），严格 地说是1/Ks表示酶与底物的亲和力，当k3极小时，1/Km才 表示酶与底物的亲和力。
二、酶的抑制作用
➢ 酶的失活与抑制的区别 ➢ 酶抑制程度的表示方法 ➢ 酶抑制作用的类型 ➢ 可逆与不可逆抑制作用的鉴别 ➢ 可逆抑制作用动力学 ➢ 一些重要的抑制剂
（一）酶的失活与抑制的区别
凡是使酶蛋白质变性而引起酶活力丧失的作用称为失 活作用；由于酶必需基团化学性质的改变，但酶未变 性，而引起酶活力的降低或丧失而称为抑制作用。 变性剂对酶的变性作用无选择性 抑制剂对酶的抑制作用有选择性
特点：
A.抑制剂结构与底物的分子结构不相似。 B.抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合。 C.抑制作用的强弱取决于[I]，不能通过增加[S]减弱或解 除抑制。 D.Vmax降低，Km不变。
酶的可逆抑制作用——反竞争性抑制
酶只有与底物结合后才能与抑制剂结 合。L-Phe，L-Arg等对碱性磷酸酶的 作用是反竞争性抑制，肼类化合物抑 制胃蛋白酶、氰化物抑制芳香硫酸酯 酶的作用也属此类。
抑制剂只与酶—底物复合物结合生成抑制 剂—酶—底物死端复合物（ESI），从而抑 制酶的活性。

酶工程 第二章酶动力学 第一节酶促反应动力学

酶工程 第二章酶动力学 第一节酶促反应动力学

1913年前后，米彻利斯（Michaelis）和曼吞（Menten） 在前人工作的基础上，通过大量的定量研究，提出了酶促动力 学基本原理，并推导出了著名的米-曼氏方程，推导过程如下：
根据上述反应式，中间产物ES的生成速度(底物S的消失速度)
v1＝k1[S][E]－k2[ES]
（2-1）
而ES的消失速度(产物P的生成速度) v2＝k3 [ES]，当反应达到 平衡时，即v1＝v2时
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下， 反应速度（v）直接与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下， 速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速度与底物浓度[S]无关 （如图2-1）。
图2-1 单底物酶促反应的反应速度与底物浓度的关系
第一节 酶促反应动力学
图2-5 乒乓反应机理 实际上，多底物酶促反应动力学是非常复杂的，以上只是作以简要介绍， 有关详细内容，可查阅相关专著。
将米氏方程改写成以下形式
以 对作图，绘出曲线，横轴截距即为－值，纵轴截距则是 （图2-2）。
第一节 酶促反应动力学
图2-2 双倒数作图
第一节 酶促反应动力学
二、多底物动力学 通常情况下，酶催化反应涉及两个(少数情况下三个)底物。 现在我们考虑一个涉及两种底物和两种产物的酶促反应物反应。现在已知的生化反应 中有六成以上属于这一种反应。双底物反应的机理有下面三种 可能：
第一节 酶促反应动力学
1.有序反应机理(ordered reaction) 这种情况下，A和B分别可被说成是先导底物和后随底物，Q 是A的产物，最后被释放。A和Q竞争同游离酶E结合，但A和B则 不会（或者Q和B也不会）发生竞争（如图2-3）。依赖烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸（NAD＋或NADP＋）的脱氢酶的反应就属于这种类型。
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因、尼古丁
吗啡
海洛因
（2）非竞性（Non-competitive)抑制
无法形成产物
抑制物
Noncompetitive
inhibition
（3）反竞争性（Uncompetitive ）抑制
(三)可逆和不可逆抑制作用的鉴别
1：反应体系不加I
v
1
2
2： 体系中加入 一定量不可逆抑制剂 3：体系中加入 一定量可逆抑制剂
[E]
3
v
[I ]→
v
[I ]
[E]
[E]
不可逆抑制剂
可逆抑制剂
的作用
的作用
(四）可逆抑制作用动力学
1.竞争性抑制
斜率
斜率
Km 变大，Vmax不变
2.非竞争性抑制
截距
Km不变，Vmax变小
3. 反竞争性抑制作用
Km、Vmax都变小
四、温度对酶反应的影响
产 物 累 积 量
kcat/km的上限为k1,即生成ES的速率，即酶 的催化效率不超过E和S形成ES的结合速率
kcat/km的大小可以比较不同酶或同一种酶 催化不同底物的催化效率。
3、 Km与V的求取
（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法
蔗糖酶米氏常数（Km）的测定
1. 配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、0.00625、 0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、 0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保温； 2. 加入3U/ml已在35 ℃水浴保温的酶溶液，准确作用5分 钟，终止反应； 3. 各吸取0.5ml反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5分 钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值； 4. 作图
产 酶促反应速度逐渐降低 物
0
时
间
酶促反应的时间进展曲线
在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速 度的影响呈矩形双曲线关系。

V 反 应 初 速 度
0
底 物 浓 度 [S]
反应初速度随底物浓度变化曲线
V Vmax
[S]
当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反 应为一级反应。
V
Vmax
[S]
E的质量平衡方程 [E]=[Et] - [ES]
(Ⅰ)
(Ⅱ)
k1 E+S ES
k3 P+E
k2
稳态时ES浓度不变
反应速度
V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度
k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES]
E的质量平衡方程 [E]=[Et] - [ES]
米氏方程
V=
V[S] Km + [S]
0 Km （米氏常数） [S]
米氏曲线
Km=?
V=
V[S] Km + [S]
若 V＝V/2
Km
=
V V [S] 1 ＝ 2 Km + [S]
Km + [S] = 2[S]
[S]
2、动力学参数的意义
（1）米氏常数Km的意义
V Vmax Vmax/2
Vmax 2
Vmax[S] ＝ Km + [S]
Vmax[S]
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
k1 E+S k2 ES
k3 P+E
稳态时ES浓度不变
反应速度 V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度
(Ⅲ)
k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES]
V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et] k2 + k3 Km= k1 米氏常数
V 反 应 初 速 度
V=
V[S] Km + [S]
0
底 物 浓 度 [S]
反应初速度随底物浓度变化曲线
最 大 反 应 速 率
V
b.当[S]很大时 V=V[S]/[S]=V
0 级反应
V
混合级
V/2
a.当[S]很小时 V=V[S]/Km 一级反应
磷酰化酶(失活)
解毒 -- -- -- 解磷定(PAM)：
RO
P
O
N CH3
+
O -CHNO P
OR
+ + -CHNOH RO O—E N 磷酰化酶(失活) CH3 解磷定
OR +E—OH
④有机汞、有机砷化合物
——与酶分子中-SH作用；
可通过加入过量巯基化合物解除。
⑤氰化物、硫化物和CO ——与酶中金属离子形成稳定的络合物 如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合
抑制剂：能引起抑制作用的物质。
（一）抑制作用的分类
不可逆抑制与可逆抑制
依据： 能否用透析、超滤等物理方法 除去抑制剂，使酶复活。
1、不可逆抑制作用 ：
不 可 逆 抑 制
抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连 很多为剧毒物质
重金属、有机磷、有机汞、有机砷、
氰化物、青霉素、毒鼠强等。
不可逆抑制剂
非专一性不可逆抑制剂
•具有底物类似的结构 •本身是酶的底物 •还有一潜伏的反应基团 “自杀性底物”
2、可逆抑制作用：
抑制作用可通过透析等方法除去。

原因：非共价键结合
可 逆 抑 制
竞争性抑制(competitive inhibition) 非竞争性抑制(non-competitive I.） 反竞争性抑制(uncompetitive I.)
H2N-CH-COOH 碘乙酸 + CH2 ICH2COOH SH H2N-CH-COOH
+ CH2 S-CH2COOH HI
③有机磷化合物（敌百虫、敌敌畏）
胆碱 酯酶 OH
P
OC2H5 OC2H5
S
有机磷农药部分
(CH 3)3N CH2CH2OH
胆碱
+
+ CH3COOH
O C
Km(mmol/L) 25 0.006 0.058 2.5
胰凝乳蛋白酶
甲酰酪氨酰胺
乙酰酪氨酰胺
12.0
32.0
②可以判断酶的专一性和天然底物
Km值最小的底物——最适底物/天然底物
Km近似表示酶对底物的亲和力： Km越大、亲和力越小
k2>>k3时
k2 + k3 Km= k1
Km≈k2（分离能力）/k1（亲合能力）
v
Vmax
Vmax=v+
v Km [S]
－3Km－2Km－Km
[S]
（三）多底物的酶促反应动力学
1.酶促反应按底物分子数分类：
分为单底物、双底物和三底物反应
2.多底物反应按动力学机制分类：
（1）顺序反应或单－置换反应
①有序反应（ordered reactions）
领先底物
释放
释放
A和Q竞争地与自由酶结合
相 对 酶 活 ％
最适温度 动物酶 35~40℃ 植物酶 45~50℃ 微生物 大部分 40~50℃ 个别高温菌 90℃以上
上图反映出温度如何影响酶活力？
最适温度
温度越高，活化分子越多，反应速度快； 酶变性时间越短，反应速度下降也迅速。
五、pH 对酶反应的影响

最适pH时的酶 活力最大
•最适pH因酶而异，多数 酶在5.0-8.0左右
（3）P→0 忽略 E + P
k4
ES 这步反应
E+S
ES
E+P
（二）酶促反应的动力学方程式
1、米氏方程的推导

1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程 式，简称米氏方程(Michaelis equation)。
Ｖ ──[S] K +
＝
m
乳酸脱氢酶
（1.7×10-5）
乳酸
丙酮酸
丙酮酸脱羧酶
（1.0×10-3）
乙醛
丙酮酸脱氢酶
（1.3×10-3）
乙酰CoA
丙酮酸浓度较低时：
代谢哪条途径决定于Km最小的酶
（2）Vmax和k3（kcat)的意义
一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一 个常数。 [S]很大时， Vmax＝ k3[E] 。 k3表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子 转换底物的分子数， ——又称为转换数、催化常数kcat kcat越大，酶的催化效率越高
k1 E+S k2 ES k3 P+E
Km越小，亲和力越强。
[S]很小时，反应速度就能达到很大。
性能优，代谢中这类酶更为重要
③根据Km：
判断某[s]时v与Vmax的关系
判断抑制剂的类型 ④ Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径 催化可逆反应的酶对正/逆两向底物Km不同 —— Km较小者为主要底物
一底物多酶反应
（3） kcat/km的意义：
V= Vmax[S] Km + [S] ∵Vmax=kcat[Et] ∴ kcat[Et][S] Km + [S] 当[S] <<Km时， [E]＝[Et]
V=
是E和S反应形成产物的表观二级速率常数。 其大小可用于比较酶的催化效率。
k3k1 kcat/km＝ k2+k3
胆碱乙酰化酶
胆碱酯酶
(CH 3)3N CH2CH2O
乙酰胆碱
+
CH3
+ H2O
积累导致神经中毒症状
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ N