浙大生物化学课件15：DNA的生物合成

DNA聚合酶的活性

5′至3′的聚合活性

5′→ 3′方向

核酸外切酶活性

5′→ 3′外切酶活性

3′→ 5′外切酶活性
一、复制的化学反应

5′至3′的聚合活性（ 5′→ 3′ ）
N3 N1 N2 N3 OH 3′ OH ＋ PPi 3′ OH
N1 N2 5′
5′
p
p
＋
PPP
γ βα
5′
p
p
p
1、DNA拓扑异构酶



类型I拓扑异构酶：催化DNA双链中的一条链的断裂和 再连接，反应无需能量； 类型II拓扑异构酶：催化DNA双链的断裂和再连接，反 应需消耗ATP； 原核生物中拓扑异构酶只能消除负超螺旋，真核生物 中能消除正、负超螺旋。
2、解螺旋酶

领头链：rep蛋白沿模板链的3′→ 5′移动 随从链：解螺旋酶Ⅱ、Dna B沿模板链的5′→ 3′移动
3、复制的保真性

核酸外切酶活性和即时校读

pol I，pol II，pol III的ε亚基的3′→ 5′外切酶活性

复制的保真性和碱基选择

先形成氢键，再生成磷酸二酯键
遵守严格的碱基互补配对规律 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 复制中出错时有即时校读功能

依赖三种机理



三、DNA拓扑学变化中的酶

DNA聚合酶III（pol III）：真正起复制作用的酶



由10种亚基组成的不对称二聚体，α、ε、θ组成核心酶。 活性：聚合活性、3′→ 5′外切活性。 α + ε + θ → pol III（核心酶） pol III + τ → pol III′ pol III′ + γ + δ → pol III*（全酶） α具有聚合酶活力，ε具有校对功能，θ是组建核心酶因 子， τ是二聚化因子，γ和δ是延长因子，β识别引物并 引导聚合酶结合，复制起始时被释放。 pol III只作用于有缺口的双链DNA，pol III′可作用于 有引物的长单链DNA，pol III*是天然的聚合酶。

1、DNA链的游离3′-羟基对进入的dNTP磷原子发生亲 核攻击，形成3′,5′-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。
N3 N1 N2 N3 OH 3′ OH ＋ PPi
N1 N2 3′ OHLeabharlann 5′5′pp
＋
PPP
γ βα
5′
p
p
p



2、形成磷酸二酯键的能量来自 α-与β-磷酸基之间高能 键的裂解。 3、聚合反应可逆，但随焦磷酸的水解可推动反应的完 成。 4、DNA链由5′向3′方向延长。 5、需要有游离的3′-羟基，即需要引物链。
拓扑异构酶 单链结合蛋白 解链酶 、rep蛋白 引物酶及引发体 DNA 聚合酶 DNA 连接酶 引物
冈崎片段 领头链 3′ 5′
随从链
3′
5′
五、DNA连接酶（ligase）

催化两段DNA之间的连接
HO P 3′ 5′ + NAD AT P NMN +AMP AMP +P P i 5′ DNA 连接酶 ligase 3 ′ 3′ 5′


D- 环式：单向复制。在固定点解开后一条链 先复制，待复制到一定距离时，露出另一链 的复制起点，才开始另一链的复制； 滚动环式：单向复制。共价闭环双链分子的 正链由核酸内切酶在一特定位点切开，游离 出的 5′- 磷酸基末端固定在细胞膜上，然后以 环状负链为模板，从正链的3′-OH末端延长形 成正链。

核酸外切酶活性


3′→5′外切酶活性 5′→3′外切酶活性
3′ 5′
5′ 3′
3′→5′ 外 切 酶 活 性 5′→3′ 外 切 酶 活 性
聚合反应
在 DNA 聚合酶催化下，四种脱氧核糖核苷三磷酸 （ dATP 、 dGTP 、 dCTP 、 dTTP ）被加到 DNA 链 的3′末端，同时释放出无机焦磷酸。
第三节 DNA生物合成过程
一、复制的起始
1、DNA解成单链：原核生物从一个固定的起始点开始， 同时向两个方向进行的，称为双向复制——θ复制
起点
起点
起点
DNA复制叉的结构示意图



真核细胞染色体比较复杂，可能有多个复制 起点，同时形成多个复制单位。 复制叉：复制开始后由于 DNA 双链解开，在 两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看 到的叉状结构，称为复制叉。 E. coli复制起始点oriC跨度为245 bp，包含有 三组串联重复序列和两对反向重复序列。
5′ 3′
NAD: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NMN: 烟酰胺单核苷酸
3′ OH
O
′ 3
OH
DNA
ligase 聚合酶
O
3′ O
′
5 P
+ 5′ P
γ
β
P
O
P O α O-
5 P PPi
′
O P O-
OH
DNA连接酶
催化双链 DNA切口处的 5′- 磷酸基和 3′- 羟基生成磷酸二酯键。 1）形成酶-AMP复合物 NAD+ + 连接酶 → 连接酶-AMP + NMN（细菌中） ATP + 连接酶 → 连接酶-AMP + PPi（动物中） 2）形成A-P-P-DNA 连接酶-AMP + 5′-P-DNA → A-P-P-DNA + 连接酶 形成了焦磷酸键 3）生成3′,5′-磷酸二酯键 DNA-OH-3′ + A-P-P-DNA → DNA-O-P-DNA + AMP 相邻链3′-OH对活化的磷原子发生亲核攻击。
pol C, hol E, dna N, dna X, dna Z, dna Q, hol A ≥10 830,000 + +
5′→3′外切酶
聚合速度（核苷 酸/min） 持续合成能力 功能
+
1,000 3~200 切除引物，修复
2,400 1,500 修复
≥15,000 ≥500,000 复制
2、真核生物
pol I 切除冈崎片段 5′ 端 RNA引物


5′→3′核酸外切酶活力 DNA聚合酶活力
pol I的结构
单链多肽，用枯草杆菌蛋白酶进行有限水解，可得两个 大小不同的片段。 小片段：5′→3′核酸外切酶活性； 大片段（ Klenow 片段）：聚合活性、 3′→5′ 外 切活性（常用工具酶）
复制的起点


单个固定的起点：原核生物的染色体和质粒、 真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，具 有单个固定的起点； 多个起点：真核生物染色体是线性双链分子， 含有许多起点多复制子。
复制方向


直线双向式：单起点，双方向，有对称的和 不对称的； 多起点双向式：真核生物染色体 DNA的复制； θ 型双、单向式：环状 DNA 的复制。有双向 和单向（单向的形成一个复制叉，双向的形 成两个复制叉），有对称和不对称（一个叉 完成1/5，其余4/5由另一个叉完成）；
生物化学
浙江大学 生命科学学院 江 辉
第十五章 DNA的生物合成
第一节 半保留复制
第二节 DNA复制的酶学
第三节 DNA生物合成过程
第四节 DNA的损伤修复
第五节 逆转录现象和逆转录酶
有关DNA的两个问题


为什么大肠杆菌20分钟就可以繁殖一代，而生 长最快的动物小母家鼠生长40天才成熟？ 为什么可通过DNA测序进行亲子鉴定？
3、半保留复制意义

DNA在代谢上的稳定保证了遗传信息的稳定性。
第二节 DNA复制的酶学



底物：dNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTP） 聚 合 酶 ： DNA 依 赖 的 DNA 聚 合 酶 （ DNApolymerase） 模板：单链的DNA母链 引物：寡核苷酸引物（RNA） 其他酶和蛋白质因子：拓扑异构酶、解螺旋酶、 单链结合蛋白、DNA连接酶




DNA 聚合酶 α ：与随从链的合成有关。需要以缺口双 链或带引物的单链DNA为模板，引物是DNA或RNA短 链，RNA引物由引物合成酶合成 DNA聚合酶β：核酸外切酶活性，与修复有关 DNA 聚合 酶 γ ：存在于线粒体 。 以 RNA 为模板 ，以 DNA短链为引物 DNA聚合酶δ：与领头链的合成有关。具有3′→ 5′外切 酶活力 DNA聚合酶ε：与校读、修复和填补缺口有关
DNA聚合酶II（pol II）：可能在DNA修复中起作用

以带有缺口的双链DNA为模板和引物，从5′→3′方 向合成DNA，同时具有3′→5′外切酶活力。
多亚基聚合酶 含有DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性 不具有5′ → 3′核酸外切酶活性 反应需要NH4+ 激活 是一种主要起修复作用的酶。
中心法则
基因：是为生物活性产物编码的DNA功能片段， 这些产物主要是蛋白质或是各种RNA。
RNA复 制
复制
转录
DNA
逆转录
RNA
翻译
蛋白质
DNA的生物合成（复制）
复制的要点

半保留复制


有起始点、终止点和方向
半不连续复制
第一节 半保留复制

当细胞分裂，DNA进行复制时，双螺旋结构解 开而成为单链，用于合成新的互补链。子代细 胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代 完整地接受过来的旧链；另一股单链是完全重 新合成的新链，且按碱基配对原则与旧链互补。
领头链