载体构建的基本步骤

载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。

过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。

Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。

载体构建基本步骤
载体构建基本步骤
1.选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增
2.对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%）,若检测结果正确，测
序结果之后进行胶回收目的片段
3.通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体（PMD-18T）
4.转化DH5α，根据载体抗性涂板37度过夜培养
5.挑取阳性克隆进行PCR验证，PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并
提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序
6.测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段
7.对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段
8.将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化DH5
α，涂板37度过夜
9.挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕。

本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==构建载体步骤篇一：载体构建的基本步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃， 12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的 AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

重组载体构建的方法和步骤
1. 选择载体，首先需要选择合适的载体，常用的载体包括质粒、病毒、人工染色体等。

选择载体时需要考虑载体大小、复制方式、
宿主范围等因素。

2. 线性化载体，将所选载体进行线性化处理，通常采用限制性
内切酶对载体进行切割，生成线性化的载体。

3. 外源基因插入，将待插入的外源基因与线性化载体进行连接。

这一步通常需要利用DNA连接酶或者DNA重组酶来实现。

4. 载体转化，将重组后的载体导入到宿主细胞中。

这一步通常
采用转化、转染或者电穿孔等方法。

5. 筛选正常重组子代，经过载体转化后，需要进行筛选以获得
正常重组的子代细胞。

通常采用抗生素筛选或者标记基因筛选的方式。

6. 鉴定重组子代，对筛选得到的细胞进行PCR、酶切、测序等
方法进行鉴定，确保重组载体的构建成功。

总的来说，重组载体构建的方法和步骤包括选择载体、线性化载体、外源基因插入、载体转化、筛选正常重组子代和鉴定重组子代。

这些步骤需要严格操作，并且需要根据具体实验情况进行调整和优化。

希望这些信息能够对你有所帮助。

载体构建技术基本流程
载体构建的基本流程：
1.载体质粒的选择；
2.引物设计；
3.PCR扩增；
4.载体和⽬标⽚段的限制性酶切；
5.连接转化；
6.挑取克隆提质粒验证。

重要的是，我们要为⼤家提供了⼀个载体构建流程模板，构建载体时希望⼤家可以创建⼀个word⽂档，按照我们提供的模板，将载体构建过程记录下来，便于后续优化。

后续⽂章中我们将举例告诉⼤家如何使⽤这个模板。

P.S. 构建表达载体时可以先连接T载体，可把步骤（12）酶切⽚段换成连接T载体后再对T载体进⾏酶切。

连接T载体会多花⼀天时间，但是可以使载体构建流程更顺利。

连接T载体与连接⽬的载体⽅法⼗分类似，本次举例不再涉及。

如果想要通过连接T载体过渡，可以⽹上搜索T载体相关产品说明书，了解T载体和连接T载体的⽅法。

引物设计的内容我们将放在接下来的⼀篇推送⾥，正在构建载体的⼤家，先尝试使⽤我们的载体构建流程模板吧。

载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。

本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。

质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。

在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。

2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。

在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。

3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。

常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。

PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。

在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。

常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。

连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。

2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。

3.连接酶在37℃下反应数小时。

4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。

转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。

转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。

常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。

构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的主要步骤包括：
1.目的基因的获得：即使用限制性核酸内切酶切割质粒，露出黏性末端，再用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。

2.载体和目的基因的限制性酶切：用相同的限制性酶酶切载体和目的基因，使它们产生相同的黏性末端。

3.连接转化：将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键。

4.加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。

构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。

常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。

2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。

可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。

3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。

这些序列将调控基因的表达方式和水平。

4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。

5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。

常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。

6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。

7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。

8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。

需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。

在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。

载体构建的基本流程载体构建的基本流程主要包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。

首先，设计方案确定是载体构建的第一步，也是最为关键的一步。

在这个阶段，我们需要明确载体的功能要求、外形尺寸、结构布局等设计参数，然后进行方案设计和优化，最终确定最佳的设计方案。

设计方案的确定需要充分考虑载体的使用环境、工作条件、使用寿命等因素，确保设计方案的科学合理性和可行性。

接下来是材料准备环节，这一步是实现设计方案的关键环节。

根据设计方案确定的材料要求，我们需要选择合适的材料，并进行采购和准备工作。

在材料选择方面，需要考虑材料的力学性能、耐磨性、耐腐蚀性、导热性、导电性等多个方面的要求，确保选择的材料符合设计要求。

在材料准备工作中，还需要对材料进行切割、成型、加工等工艺处理，以满足设计方案的要求。

随后是工艺加工环节，这一步是将设计方案和准备好的材料转化为具体载体的关键环节。

在这个阶段，我们需要进行组装、焊接、切割、打磨、涂装等一系列工艺加工工序，将材料加工成符合设计要求的零部件，并进行组装装配，最终形成完整的载体。

工艺加工环节需要严格按照设计要求和工艺规程进行操作，确保加工质量和工艺精度。

最后是性能测试环节，这一步是验证载体构建结果的关键环节。

在这个阶段，我们需要对构建好的载体进行功能测试、性能测试、可靠性测试等一系列测试工作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。

在测试过程中，需要对载体的各项性能指标进行全面检测和评估，发现问题及时进行调整和改进，最终确保构建的载体达到预期的使用效果。

总的来说，载体构建的基本流程包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。

在实际的载体构建过程中，需要严格按照这个基本流程进行操作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。

同时，也需要不断改进和优化载体构建的技术方法和工艺流程，提高构建质量和效率，推动载体构建技术的发展和应用。

rnai载体构建的基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!RNAi载体构建的基本流程详解RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种生物体内的基因沉默机制，通过特异性降解与之互补的mRNA，实现对目标基因表达的抑制。

载体构建流程(总17页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。

过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

酶切法构建载体的基本流程
设计引物：设计两个引物，分别匹配目标基因和载体的末端序列，引物中通常包含限制酶切割位点。

PCR扩增目标基因：使用设计好的引物对目标基因进行PCR扩增，得到足够的目标基因DNA。

限制酶切割：使用选择的限制酶对PCR扩增得到的目标基因和载体进行切割。

这一步骤是实验中的关键，确保酶切割的效果明确。

连接酶切末端：选择适当的连接酶，它可以将目标基因与载体的切割末端精确连接在一起。

进行连接酶反应，将目标基因与载体的切割末端连接。

此步骤是实现载体构建的关键环节。

转化：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程。

筛选：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。

载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。

超螺旋结构应至少占到90%。

测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。

2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。

以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。

根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。

3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。

1)称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。

2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。

此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。

3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。

滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。

5)重复操作步骤。

6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。

7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。

载体构建的基本步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1O 7H2将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。