第40卷 第4期2008年4月哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报JOURNAL OF HARB I N I N STI T UTE OF TECHNOLOGYVol 140No 14Ap r .2008微生物荧光原位杂交(FI SH)实验技术陈 瑛1,2,任南琪1,李永峰1,程 瑶1(1.哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090;2.哈尔滨师范大学生物系,哈尔滨150080,E 2mail:chenyinglady@yahoo )摘 要:为更好地应用荧光原位杂交(F I S H )实验进行微生物群落生态研究工作,对F I SH 实验原理和影响F I SH 实验结果准确性的主要因素进行分析和讨论,包括寡核苷酸探针的选择与标记、样品的预处理、杂交液和杂交条件的选择等步骤.总结了一些实验心得,提出关键步骤的操作要点和注意事项,以及F I SH 技术与其他实验手段相结合的发展前景.建议根据不同检测对象和实验目的,对关键步骤进行改进可以提高实验准确性、简化操作和降低成本.关键词:微生物生态学;环境微生物;荧光原位杂交;寡核苷酸探针中图分类号:Q93文献标识码:A 文章编号:0367-6234(2008)04-0546-04M i crob i ology exper i m en t of fluorescence i n situ hybr i d i za ti on(F I SH)techn i queCHE N Ying 1,2,RE N Nan 2qi 1,L I Yong 2feng 1,CHENG Yao1(1.School of M unici pal and Envir on mental Engineering,Harbin I nstitute of Technol ogy,Harbin 150090,China;2.Dep t .of B i ol ogy,Harbin Nor mal University,Harbin 150080,China,E 2mail:chenyinglady@yahoo )Abstract:I n order t o study the ecol ogy of m icr obial communities by app lying Fluorescence in situ hybridiza 2ti on (F I SH )technique,this paper analyzed the p rinci p le of F I SH and the influencing fact ors of the experi m en 2tal accuracy .These fact ors include choosing and marking the oligonucleotide p r obes,p retreating the sa mp les,and choosing the hybridizing s oluti on and hybridizing conditi ons .The experi m ental results were su mmarized and the main operati on points of key p r ocedures were suggested .The future of F I SH combining with other techniques was expected .This paper suggests that the increase of the accuracy,the si m p lificati on of the p r oce 2dure and the decrease of the cost can be achieved by i m p r oving key p r ocedures according t o different sa mp les and researching goals .Key words:m icr obial ecol ogy;envir onmental m icr oorganis m;fluorescence in situ hybridizati on (F I SH );oli 2gonucleotied p r obe收稿日期:2006-03-17.基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(50125823);国家重点基础研究发展计划资助项目(G2000026402).作者简介:陈 瑛(1972—),女,博士;任南琪(1959—),男,教授,博士生导师,长江学者特聘教授. 1969年,Pardue [1]和John [2]两个研究小组建立了原位杂交技术(I SH ),这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下,检测出细胞内特定核酸序列,即采用DNA 或RNA 探针,通过原位杂交的方法,将特定的DNA 或RNA 序列在细胞或染色体上显示出来.最初是采用同位素标记的方法,通过放射自显影,将已结合在靶位上的探针显示出来.后来改进了标记的材料,用包括荧光酶、地高辛、生物素等荧光物质代替了同位素,从而形成了荧光原位杂交(F I SH )技术.荧光物质的使用提高了分辨率,简化了检测步骤,增强了安全性,为同时检测不同的探针提供了可能,从而发展出了多重原位杂交,并被广泛应用.1988年,Gi ovan 2noni 等[3]首次将F I SH 技术引入细菌学的研究.1989年,Del ong [4]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞.近几年,F I SH技术由于其灵敏、快速、使用安全、特异性好等特点,已经成为医学、生态学、遗传学、环境微生物学研究的有力工具.1 F I SH原理和实验步骤F I SH是将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合而形成的新技术.其原理是基于碱基互补的原则,用荧光素标记的已知外源DNA或RNA 作探针,与载玻片上的组织切片、细胞涂片、染色体制片等杂交,与待测核酸的靶序列专一性结合,通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位[5].目前,荧光原位杂交在微生物系统发育、微生物诊断和环境微生物生态学研究中应用较多.由于微生物的16S r DNA、23S r DNA以及它们的间隔区的核苷酸序列具有稳定的种属特异性,通常以它们特定的核苷酸序列为模板,设计互补的寡核苷酸探针,通过与微生物细胞杂交,鉴定微生物的种类、数目以及空间分布等.利用对r RNA(主要是16S和23S r RNA)序列专一的探针进行杂交已经成为微生物鉴定的标准方法.近几年,已对2500多种细菌的16S r RNA 进行了测序,在系统发育水平上得到了大量的有用信息[6].F I SH技术的基本操作过程对染色体、细胞和组织切片来说基本相同,主要包括4个步骤: 1)制备和标记探针;2)准备杂交样品;3)原位杂交;4)信号处理及观察记录.根据不同的实验目的和研究对象,每一步骤的要求和细节会有所变化.对于微生物F I SH实验而言,解决好如下关键步骤的技术问题是获得科学结果的保证.2 F I SH实验关键步骤和方法211 核酸探针的准备核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交,而后又能被特殊方法检测的被标记的已知核苷酸链.根据来源和性质可将核酸分子探针分为基因组DNA探针、c DNA探针、RNA探针以及人工合成的寡核苷酸探针几类.可以针对不同的研究目的选用不同的核酸探针,选择的基本原则是探针应具有高度特异性.核酸探针的制备是F I SH技术关键的一步,影响着该技术的应用与发展.近年来,随着DNA 合成技术的发展,可以根据需要随心所欲地合成相应的核酸序列,因此,人工合成寡核苷酸探针被广泛采用.这种探针与天然核酸探针相比具有特异性高、容易获得、杂交迅速、成本低廉等优点.寡核苷酸探针是根据已知靶序列设计的.一般应遵循如下的设计原则:1)探针长度: 10～50bp.越短则特异性越差,太长则延长杂交时间.2)G+C%应在40%～60%,否则降低特异性.3)探针不要有内部互补序列,以免形成“发夹”结构.4)避免同一碱基连续重复出现.5)与非靶序列区域同源性<70%[7].目前,已有大量寡核苷酸探针被设计合成,并且建立了有关探针的数据库,研究者可以很方便地通过互联网查询所需的探针或设计探针的资料和软件.例如,Loy A.,Horn M.,W angerM.等建立的p r obe Base寡核苷酸数据库,就可以提供以r RNA为目标的寡核苷酸探针的相关资料以及检验探针专一性的软件系统[8].常用于环境微生物检测的寡核苷酸探针见表1.表1 常用于环境微生物检测的寡核苷酸探针探针名称目标微生物E UB338most BacteriaUN I V1390all O rganis m sChis150most of the C lostrid ium h istoly ticum gr oup(C lostrid ium cluster I and II)Clit135s ome of the C lostrid ium litusebu rense gr oup(C lostrid ium cluster X I)LGC354F ir m icu tes(Gram-positive bacteriawith l ow G+C content)HGC A ctinobacteria(high G+C Gram-positive bacteria) ENT183En terobacteriaceaeMg1004M ethy lo m icrobiumMB311M ethanobacteria lesAmx368all ANAMMOX bacteriaN I T3N itrobacter sppNS O B etaproteobacteria l amm on ia-ox id izing bacteriaACA652A cinetobacter 设计或选定的寡核苷酸探针可以用DNA合成仪很方便地合成,然后用荧光素进行标记.常用的荧光素有:异硫氰酸荧光素(F I TC)、羧基荧光素(F AM)、四氯荧光素(TET)、六氯荧光素(HEX)、四甲6羧罗丹明(T AMRA)、吲哚二羧菁(Cy3,Cy5)等[9].这些荧光素具有不同的激发和吸收波长,一般需要选择两种以上的探针同时杂交时,要给这几种探针分别标记不同的荧光素.标记的方法分为间接标记和直接标记.目前,有人在多彩色荧光原位杂交实验中,采用混合调色法和比例调色法,仅用2～3种荧光素就可以给4～7・745・第4期陈 瑛,等:微生物荧光原位杂交(F I S H)实验技术种探针标记上不同的颜色[10].探针的合成与标记可以根据条件自己进行或选择相应的生物技术公司来完成.标记好的探针通常放在-20℃、避光保存.使用前,将探针稀释到5ng/mL的质量浓度,分装备用.212 杂交样品的准备对于微生物原位杂交,首先涉及的是微生物样品的收集.既要求尽可能多地收集到样品中的微生物,又要尽量减少样品中杂质对杂交结果的影响.因此,无论是来自人工培养基的,或是自然环境的,还是污水处理设备的微生物样品,必须先经过打碎、离心、清洗等处理步骤.目的是使微生物细胞与杂质分离、除去杂质、收集细胞.可以用灭菌玻璃珠震荡将样品打碎,1000r/m in离心2m in,取上清液,将上清液5000～8000r/m in离心2m in,弃上清液,再用P BS将收集到的微生物冲洗一次.上述过程每一步可重复2～3次.然后,需要对收集的样品进行固定和预处理.这一步要求微生物细胞保持形态基本不变,同时要增大细胞壁的通透性,保证探针顺利进入与DNA或RNA杂交.一般先用4%多聚甲醛溶液固定,4℃过夜.如果不能马上进行杂交实验,可将固定好的样品暂时放在50%乙醇/P BS溶液中, -20℃保存.杂交实验前,用P BS液清洗,离心收集.用蛋白酶K,3730m in,减少蛋白质对杂交的影响.再用溶菌酶处理10m in,以增加细胞的通透性.最后用梯度酒精(50%,80%,95%, 100%)依次脱水.213 杂交这一步首先涉及配制杂交液.一般的荧光原位杂交液的组成成分有:氯化钠、Tris-cl缓冲液、S DS或Tri onx-100、甲酰胺以及硫酸葡聚糖.各种成分的浓度见表2.S DS和Trit onx-100的作用是去污,二者取一即可.硫酸葡聚糖的作用是增加探针的相对浓度.甲酰胺的浓度直接影响杂交的特异性,因此,需根据不同的探针和杂交温度加以选择.一般情况下,甲酰胺的浓度和杂交温度越高,探针的特异性越强,反之,探针的特异性降低.探针在杂交前加入杂交液中,使其终质量浓度为015ng/mL.表2 荧光原位杂交液的组成成分NaCl/ (mol・L-1)Tris-cl/(mmol・L-1)S DS/%甲酰胺/%01920011～15～55 杂交在载玻片上进行,取经过预处理的样品涂于载片,充分干燥后,加杂交液.在微生物F I SH 实验中,样品与杂交液的比例大约为1∶2,通常是10μL样品加20μL杂交液,置于46℃杂交炉中,避光杂交2～4h.由于杂交温度较高,杂交液又很少,容易蒸发干燥,因此,需使用密闭湿盒.杂交完成后,要用洗脱液将多余的探针除去.常用洗脱液为SET或SSC,洗脱温度低于50℃.洗脱是否充分会影响杂交结果的准确性,因此,常采用多梯度、多次的洗脱方法.如果检测同一样品中的多种微生物,往往需要使用二种以上的探针,只要在洗脱后,在新的杂交液中再加入其他16S r RNA探针溶液,按上述步骤杂交即可.214 结果观察和分析全部操作完成后,加少量对苯二胺-甘油溶液覆盖样品,防止荧光淬灭,再封片.结果用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜(CLS M)观察、照相并进行分析.共聚焦显微镜空间分辨力强、敏感性高、可屏蔽自发荧光的干扰.其与数字成像系统结合,可进行量化分析和自动化分析,已越来越多地应用于F I SH信号检测[6].另外利用流式细胞仪可以对于每一个靶细胞-探针杂交物的荧光强度进行定量测定.下列图片中显示了CLS M拍摄下的、用上述方法进行的F I SH实验结果.其中,图1是分别用红色ROX和黄色TET标记的两种探针双杂交实验结果,图2为分别用RDX、TET、绿色(F I TC)染料标记的探针的单杂交实验结果.检测的样品是活性污泥中收集来的混合细菌.图1 双色探针杂交实验(使用显微镜倍数×63oil)) 215 F I SH技术存在的问题和解决方案F I SH技术在某些方面也存在缺陷.例如,在营养饥饿状态下,细菌的染色体含量降低,因而细胞中的16S r RNA减少,会导致荧光杂交信号减弱形成假阴性结果.为了增强杂交信号,研究了一些荧光增强方法,如多重探测、生物素、亲合素标记等方法.Prescott和Fricker[11]利用核酸肽・845・哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 第40卷 (P NA )作为探针进行原位杂交,检测自来水中的E .coli,取得了与传统的平板计数法相一致的结果.P NA 探针具有稳定、不易降解和较高的杂交亲和力等特性,检测细菌细胞的r RNA 具有较高的灵敏性,即使是细菌死亡一段时间后也可能被检测到.而且,由于其主链骨架是中性的,并且通常比寡核苷酸探针短,能够通过疏水的细胞壁,具有较好的渗透性,因此,可以大大提高F I SH 实验的灵敏性[12].使用显微镜倍数为×63oil图2 单杂交实验 另外,细菌普遍存在的自发荧光现象及探针的特异性不足还可能导致假阳性结果.使用窄波段的滤镜和信号放大系统可能降低自身背景荧光,不同激发波长对自身背景荧光强度也有影响,因此,在检测未知混合微生物时,要进行相应处理.共聚焦显微成像系统(CLS M )可以较好地解决这一问题.探针的特异性需要通过严格的杂交条件控制和设置阳性对照来保证.在进行微生物生态学研究中应结合传统的培养、镜检等方法及现代分子生物学的多种方法,使得到的结果更加可信.3 F I SH 技术的发展F I SH 技术逐渐形成了从单色到多色、从中期染色体到粗线期染色体再向DNA 纤维的发展趋势,灵敏度和分辨率正在由mb 向kb 、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、大片段向小片段再向BAC /Y AC 等方向深入[13].F I SH 技术还与其他技术相结合,为环境微生物的研究提供更多信息.例如,O r phan [14]等人利用F I SH 与次级离子质谱(SI M S )结合对厌氧条件下的甲烷氧化菌进行了鉴定;Lee [15]等人采用F I SH 与显微放射自显影技术研究了生化物质在细胞内的合成、转移和转化等代谢过程;Sekigu 2chi [16]等人利用共聚焦激光扫描显微镜与F I SH 技术得到了不同菌种在颗粒污泥内部成层分布的高清晰照片[17].与生物传感器结合也是F I SH 技术在环境微生物研究中应用的新手段.随着技术的不断进步,F I 的准确性和灵敏度将进一步提高,必将在微生物生态学研究领域得到更加充分的应用.参考文献:[1]P ARDUE M L,G ALL J G .Molecular hybridizati on ofradi o active DNA t o the DNA of cyt ol ogical p reparati ons [J ].Pr oc Natl Acad Sci US A,1969,6464:600-604.[2]JOHN H,B I RNSTI E L M,JONES K .RNA:DNA hybridisatthe cyt ogenetical level[J ].Nature,1969,223:582-587.[3]GI O VANNON I S J,DE LONG E F,OLSE N G J,et a l .Phyl ogenetic gr oup s pecific oligodeocy nucleotide p r obes f or identificati on of single m icr obial cells[J ].J Bacteri 2ol,1988,170:720-726.[4]DE LONG E F,W I CKHAM G S,P ACE N R.Phyl onge 2netic stains:ribos omal RNA based p r obes for the identi 2ficati on of single m icr obial cells [J ].Science,1989,65:5554-5563.[5]逄兵,蒋学之,倪祖尧,等.荧光原位杂交原理及其在染色体畸变研究中的应用[J ].劳动医学,1997,14(1):52-56.[6]王建龙.荧光原位杂交(F I SH )技术检测水体中大肠菌群研究[J ].中国生物工程杂志,2004,24(2):70-73.[7]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M ].2版,北京:中国协和医科大学出版社,1999.[8]LOY A,HORN M ,WAG NER M.Pr 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