小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013

小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。

实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。

注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。

（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。

（3）固定小鼠，暴露腹腔。

（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。

（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。

（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。

（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。

（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。

（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。

（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。

巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。

巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

步骤一、实验材料准备1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。

2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。

碘酒绵球和酒精绵球。

3. 器械：一次性注射器、手术器械。

二、实验方法如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。

不采用刺激物，直接开始下面的步骤。

1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。

用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。

2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。

3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。

台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。

4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。

三、结果巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。

临床医学八年制免疫学实验课程教学的思考和探索实践①李志清郭猛钱程刘书逊朱鲤烨薛逸荃②（中国人民解放军海军军医大学免疫学研究所暨医学免疫学国家重点实验室，上海200433）中图分类号G642文献标志码A文章编号1000-484X（2022）11-1383-05［摘要］目的：现有医学免疫学实验课程的教学内容比较陈旧，无法满足临床医学八年制培养高素质医学研究型人才的教学目标，需要对教学内容进行改革和探索。

方法：保留和优化部分经典免疫学实验的基础上，增加重要的免疫学标记技术。

结果：新的教学内容受到学生普遍欢迎，不仅帮助学生更好地理解免疫学理论知识，还激发了学生对新技术的渴望，有利于提高学生今后的临床科研工作能力。

结论：免疫标记技术的引入提高了八年制医学免疫学实验课程的质量。

［关键词］临床医学八年制；医学免疫学；实验课程；教学内容改革Exploration on innovation of experimental teaching of Medical Immunology in 8-year Medical Education ProgramLI Zhiqing，GUO Meng，QIAN Cheng，LIU Shuxun，ZHU Liye，XUE Yiquan.National Key Laboratory of Medical Immunology，Institute of Immunology，Navy Medical University，Shanghai200433，China［Abstract］Objective：In view of fact that many of current Medical Immunology experimental courses are out of touch with rea-lity and cannot meet teaching goals of8-year Medical Education Program，it is necessary to reform teaching content.Methods：Some classic immunological experiments were optimized and immunolabeling techniques were introduced.Results：New teaching content is generally welcomed by students，which not only helps students understand immunological theory knowledge better，but also stimulates students'desire for new technologies，which can improve students'future clinical research capabilities.Conclusion：Introduction of immunolabeling technology has improved quality of Medical Immunology experimental courses in8-year Medical Education Program.［Key words］8-year Medical Education Program；Medical Immunology；Experimental teaching；Teaching reform临床医学八年制（简称八年制）专业由协和医学院和北京大学医学部首先创立，2004年至今，开设该专业的院校陆续增至16所。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810952148.3(22)申请日 2018.08.21(71)申请人 华中科技大学同济医学院附属同济医院地址 430030 湖北省武汉市解放大道1095号(72)发明人 曾锐　徐虎子　邓旋　赵志　(74)专利代理机构 北京一格知识产权代理事务所(普通合伙) 11316代理人 赵永伟(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基(57)摘要本发明涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，该培养基由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham ´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。

本发明还提供了使用上述培养基提取及培养高纯度原代肾小管上皮细胞的方法。

有益效果为，采用本发明的高选择性的培养基，可提取及培养出纯度高达92%以上的小鼠原代肾小管上皮细胞，培养得到的高纯度原代肾小管上皮细胞是研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。

权利要求书1页 说明书3页 附图2页CN 109022350 A 2018.12.18C N 109022350A1.一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham ´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。

2.根据权利要求1所述的一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod -Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。

小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴定
张淑莉;张琪;景晓红
【期刊名称】《国际检验医学杂志》
【年(卷),期】2015(036)002
【摘要】目的探讨小鼠腹腔诱导和提取巨噬细胞的简便方法.方法以5％淀粉肉汤刺激诱导小鼠产生炎性腹腔巨噬细胞,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养,显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色鉴定细胞活力,体内吞噬鸡红细胞测定其吞噬率、吞噬指数,瑞氏染色、免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度.结果获得高纯度、高细胞活性的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征.结论该研究采用的方法简单实用,可提取大量巨噬细胞.
【总页数】3页(P174-175,178)
【作者】张淑莉;张琪;景晓红
【作者单位】西安医学院医学技术系检验中心,陕西西安710021;陕西省核工业417医院,陕西西安710600;西安医学院医学技术系检验中心,陕西西安710021【正文语种】中文
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1.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 [J], 张淑莉;李素芬
2.快速振荡法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞研究 [J], 徐尤年;刘桂林;蒙臣;张诗海
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5.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 [J], 尹美珍;李世普;袁琳;戴红莲
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近年来，细胞外泌体逐渐成为研究热点之一，因其在细胞间通信、致病微生物排斥、肿瘤发生等方面的重要作用而备受关注。

巨噬细胞是人体免疫系统中的重要成分之一，在肿瘤免疫治疗和抗细菌感染等领域有着广泛的应用。

然而，如何高效、稳定的制备巨噬细胞外泌体，仍是目前研究的一个难点。

本文将分别介绍两种常见的制备巨噬细胞外泌体的方法，并进行对比研究。

一、超声法制备巨噬细胞外泌体巨噬细胞外泌体的制备涉及到很多技术难点，如巨噬细胞的培养、诱导和收集等。

超声法制备巨噬细胞外泌体可以较好地解决以上问题，该方法可促使巨噬细胞释放内含物，并使外泌体从细胞模型中脱落而得到。

具体操作流程如下：1、制备巨噬细胞：从小鼠腹腔或大鼠巨噬细胞系中提取未分化的原代细胞，或利用巨噬细胞系进行扩增；2、培养巨噬细胞：将提取的巨噬细胞置于含有10% FBS 的沙门氏培养基中，于37℃和5% CO2 孵育48~72 h，巨噬细胞数量增加至80% 以上；3、刺激巨噬细胞：将刺激剂加入巨噬细胞培养基中，如脂多糖( LPS)、干扰素(IFN) 和热休克蛋白等；4、超声处理：将已接受刺激的巨噬细胞通过超声器，进行60~70 s 的超声处理，以促进外泌体的脱落；5、去除巨噬细胞：超声处理后的巨噬细胞上浮至培养基表面，外泌体悬浮于上清液中，通过离心去除上清液中的巨噬细胞残留物；6、收集外泌体：将上清液收集下来，通过离心或超速离心制备，最终得到巨噬细胞外泌体。

二、乳化剂法制备巨噬细胞外泌体乳化剂法是一种新型、简便、高效的外泌体制备方法。

通过将乳化剂与细胞培养基中碳氧化物介质混合，在高剪切力下将其分散成固态、液态混合物，使得细胞膜碎片化并释放外泌体。

具体操作流程如下：1、制备巨噬细胞：提取小鼠或大鼠巨噬细胞原代细胞或巨噬细胞系；2、培养巨噬细胞：将巨噬细胞置于含有10% FBS 的沙门氏培养基中，于37℃和5% CO2 的条件下孵育至80% 以上，待细胞趋于平稳状态；3、添加乳化剂：将Tween-20 乳化剂加入碳氧化物介质中，避免其与细胞直接接触，从而避免乳化剂对细胞产生损伤；4、高速混合：将细胞培养基与碳氧化物介质与Tween-20 乳化剂混合后，在高速混合的条件下使其分散成固态、液态混合物；5、逐步降温：将混合物在5~10s 内从60℃迅速降温至室温，使细胞膜碎片化，外泌体释放；6、收集外泌体：将分散液通过过滤膜过滤，最终得到巨噬细胞外泌体。

小鼠腹腔巨噬细胞分离
小鼠腹腔巨噬细胞分离
1．取6周左右的小鼠，腹腔注射2ml 4％巯基乙酸肉汤或淀粉肉汤。

3～4天以后收集腹腔细胞。

2．颈椎脱臼法处死小鼠，消毒腹部，沿腹中线注入5mL冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）和2mL 空气。

轻轻按摩腹部5分钟。

3．剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H 冲洗腹腔2～3次。

合并渗出液于离心管中，4℃离心400g 5分钟，去上清液。

4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞1次，4℃离心400g 5分钟，去上清液。

用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并检测细胞活力。

小鼠肾脏足细胞的原代培养和鉴定高霞;雷晓燕;刘姝娆;索艳红;曹晓锋;高明东【摘要】目的:建立可操作性好、简单易行且效率较高的小鼠肾脏足细胞分离及原代培养模式,为其进一步研究奠定基础.方法:取C57/BL6J小鼠肾脏,通过差异过筛法获取300目筛的肾小球,用制备好的KI-3T3培养基重悬肾小球后静置于铺被鼠尾胶原的培养皿中,4d后开始换液,7d后开始胰蛋白酶消化肾小球,并开始足细胞传代培养.5～7 d传代1次,传代2～3次后收集细胞鉴定.采用倒置扭转显微镜观察小鼠肾脏足细胞形态表现,采用PCR法检测小鼠肾脏足细胞中nephrin,podocin和P-cadherin的表达.结果:肾小球种植3d后可见足细胞从组织中爬出,足细胞传代培养7d后在倒置相差显微镜下可观察到细胞胞体有突起生长.PCR法检测,分离培养的足细胞表达nephrin、podocin和P-cadherin.结论:差异过筛结合消化酶技术能够成功分离培养C57/BL6J小鼠肾脏足细胞.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(043)001【总页数】5页(P186-189,后插4)【关键词】肾脏;足细胞;原代培养【作者】高霞;雷晓燕;刘姝娆;索艳红;曹晓锋;高明东【作者单位】甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省中医药大学研究生处,甘肃兰州730000;宁夏医科大学研究生学院,宁夏银川750000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000【正文语种】中文【中图分类】Q813.11研究[1-2]表明：足细胞损伤是导致大量蛋白尿发生的关键环节。

有关足细胞的研究是肾脏病领域的热点内容，但目前足细胞的原代技术仍十分有限，已有的报道主要局限在大鼠足细胞的分离及培养方法，有关小鼠足细胞原代培养技术少见报道。

C57/BL6J小鼠是建立基因敲除模型的主要模式动物[3]，是实现基因敲除或基因敲入动物成模的关键动物品系。

·６３８·现代生物医学进展删．ｂｉｏｍｅｄ．ｎｅｔ．ｃａＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＭｏｄｅｒｎＢｉｏｍｅｍｃｉＩＩｅ２００８Ｖ０１．８Ｎｏ．４小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养李海涛１肖丹２屈学民１刘渊声１马长升１杨继庆１（１第四军医大学生物医学工程系陕西西安７１００３２；２第四军医大学军事预防医学系陕西西安７１００３２）摘要目的：建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离的简便方法，为低强度激光照射对巨噬细胞功能的影响研究提供实验细胞。

方法：以无血清的ＲＰＭＩ．１６４０培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含１０％小牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０培养液中培养。

采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。

结果：获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。

结论：本法是一种简便实用的分离小鼠腹腔巨噬细胞的方法。

关键词：小鼠；巨噬细胞；分离中图分类号：Ｑ８１３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３—６２７３【２００８１０４—０６３８—０２ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＭｏｕｓｅＰｅｒｉｔｏｎｅａｌＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓＬＩＨａｉ－ｔａｏ，ＸＩＡＯＤａｎ，ＱＵＸｕｅ－ｍｉｎ，ＬＩＵＹｕａｎ－ｓｈｅｎｇ，ＭＡＣｈａｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＹＡＮＧＪｉ－ｑｉｎｇ（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｔｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ＇ａｎ７１００３２，Ｃｈｉｎａ；２ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＰｒｅｖｅｎｔｌ＂ｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，尉，翩７１００３２，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳｌｌＲＡＣＴＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｅｌｌｓｆｏｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｏｗ－ｅｎｅｒｇｙｌａｓｅｒｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｍｏｕｓｅ’ＳｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｃａｖｉｔｙｗａｓｄｏｕｃｈｅｄｂｙｕｓｉｎｇＲＰＭＩ一１６４０ｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｏｕｔＦＣＳ，ａｎｄｔｈｅｍｏｕｓｅ’Ｓｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｏｂｔａｉｎｅｄ，ｂｅｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＲＰＭＩ一１６４０ｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０％ＦＣＳ．ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓＷａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓＷａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎ．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＷｒｉｇｈｔ’Ｓｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｈｉｇｈｌｙｐｕｒｉｆｉｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｈａｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｅａｓｙｔｏａｐｐｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｕｓｅ；Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＣｈｉｎｅ∞ＬｉｂｒａｒｙＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｑ８１３Ｄｏｃｕｍｅｎｔｃｏｄｅ：ＡＡｒｔｉｃｌｅＩＤ：１６７３－６２７３（２００８）０４－０６３８－０２前言巨噬细胞是机体的重要防御细胞，在抗感染、抗肿瘤及免疫调节中起着非常重要的作用。

教案课程名称细胞生物学实验授课题目（章、节）实验七：巨噬细胞的原代培养与活性鉴定授课老师刘庆平授课对象2002级生物工程授课时间第十一、二周教学方法实验教学选用教具实验实验内容提要：巨噬细胞的原代培养与活性鉴定（8学时）第一节第一节实验介绍20分钟（一）、实验原理；（二）、实验目的；（三）、实验用品；（四）、实验方法和过程；（五）、实验结果分析；（六）、显微摄影；第二节．实验操作160分钟教学重点、难点及基本要求：重点及难点：巨噬细胞培养获得成功的基本要素。

基本要求：体外巨噬细胞株的培养的目的是使学生了解组织培养技术包括组织培养基本概念和发展简史、组织培养细胞生物学、培养细胞生存环境、条件和代谢以及体外培养细胞成功率的分析等基本的理论知识，学习和掌握细胞培养的基本技术包括培养用液的配制及其酸碱度的调节、清洗与消毒、细胞消化、计数及组织培养技术的基本操作和培养技术。

教研室主任意见：单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等）本教案以讲授一个单元（2-4学时）一次实验（实习）为单位填写。

填写要用钢笔。

字迹要清晰、工整。

按表项目逐一填写。

实验二巨噬细胞的原代培养与活性鉴定（综合性实验8学时）一、原代培养：实验目的：细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断的生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。

因而细胞培养是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。

细胞培养技术目前已广泛的被应用于生物学的各个领域，如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。

巨噬细胞原代培养1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。

2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。

3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。

7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。

8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。

9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养.小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.71.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。

我们的经验是，以0.25%胰酶+0.02%的EDTA作为消化液。

使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 min后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。

值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。

该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。

看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。

2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。

小鼠腹腔巨噬细胞的获取1材料准备好血清56℃灭活1h，完全冷却后1000rpm/5min，然后0.22μm滤膜过滤，配含10%不含双抗的灭活FBS血清的1640培养基，另外再配含有双抗的完全培养基。

泡沫板，小注射器6个，10mL注射器几个，无菌剪刀、镊子。

提前预冷的未加双抗的1640培养基。

加了双抗的完全培养基37℃预热。

50mL管几个。

无菌PBS，台盼兰，75%酒精。

C57BL/6小鼠8-12周。

Corning极低吸附培养板，细胞不能黏附，或者用0.25%胰酶+0.02%EDTA。

用Hanks液终止胰酶和EDTA消化。

2实验步骤1）拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2min，移入超净台，把小鼠放到泡沫板上，用枕头固定四肢，用镊子和剪刀剪开皮肤，露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

注意：在处死老鼠时，如果腹腔内有血，则这只老鼠不能用，容易有血细胞污染。

2）用10mL注射器吸取提前预冷的无双抗的164010mL，换小针头注射到腹腔中，同时从两侧用手指按压腹膜壁2-5min，使液体在腹腔内充分流动。

然后放置20-25min。

提前预冷离心机到4℃。

3）轻轻拔出针头，然后从侧壁吸出培养基，注意不要吸到体内器官。

然后再注射5mL的培养基，按压1min，停滞5min，吸出到提前预冷的50mL的离心管中。

4）500g/8min，然后用无双抗的培养基洗一次，500g/8min，弃去上清液，然后用预热的完全培养基重悬。

5）台盼兰计数，很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。

如果是96孔板，一般是2X10^5个/mL，如果温箱孵育2-4h，用提前预热的是6孔板，200w个/mL，5%CO21640洗1-2次，然后换液，洗去未贴壁细胞，贴壁细胞则为单层的巨噬细胞。

3实验结果巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。

4注意事项1)巨噬细胞使终末分化细胞，不会增殖。

在条件适宜下可存活2-3周，多用原代培养。

巨噬细胞与肾小管细胞共培养说到“巨噬细胞”和“肾小管细胞”这种生物学名词，很多人一听就觉得头大。

就像是突然跳出来的两个陌生人，让你摸不着头脑。

其实啊，巨噬细胞和肾小管细胞也没那么复杂，它们各自都有自己的“工作”在身体里，虽然一个负责清理“垃圾”，一个则是“过滤水源”，但如果它们有机会“合作”，那可就有大事发生了！今天咱们就来聊聊这两位生物体内的“明星”们怎么联手干活的。

你别看巨噬细胞平时总是默默无闻，其实它可是身体里的“大扫除”专家。

这玩意儿就像是街头巷尾的清道夫，什么细菌、病毒，甚至一些老化的细胞，它们都不放过，通通都给清理干净。

就像打扫卫生一样，巨噬细胞可以“吞噬”掉这些“垃圾”，把它们处理掉，不然细胞垃圾堆积了，身体就容易生病。

可是，光靠巨噬细胞单打独斗，难免也会有些力不从心，毕竟它一个人可扫不完所有的卫生。

这个时候，肾小管细胞就派上了用场。

肾小管细胞，说白了就是肾脏里的“水管工”，它们负责过滤血液中的废物和多余的水分。

可以说，肾小管细胞就是咱们身体里的“水处理厂”，把那些多余的水分和毒素处理掉，剩下的营养和水分再回到血液里去。

每时每刻，肾脏都在辛苦工作，就像是一个不停加班的“超人”，不能停。

你能想象吗？就像一个过度繁忙的清洁工，要么处理垃圾，要么修理管道，工作量可是相当庞大的。

巨噬细胞和肾小管细胞有什么关系呢？这两位合作起来，简直是强强联手，默契十足！想象一下，巨噬细胞清理掉了血液中的那些垃圾和病菌，它们就把“清理过”的区域交给肾小管细胞去处理，把这些垃圾通过尿液排出去。

你看，垃圾不再在体内堆积，肾脏工作也就轻松了许多。

所以说，这俩“神仙”如果一块儿工作，那简直是势如破竹，效率高得惊人。

有意思的是，巨噬细胞不仅仅是干活的，它还是个“大侦探”。

它能够感知到体内是否有不正常的信号。

如果哪里出了问题，巨噬细胞立马就会响应，去“清除”那些不速之客，比如病菌或者过多的炎症因子。

当巨噬细胞发现自己清理的区域有点问题，它会通知肾小管细胞：“嘿，快点准备好，你那边有毒素要处理了。

乳鼠肾细胞的原代培养生05 边晔 2010030026周二班同组同学：解智博实验时间 2012年11月12日一、实验背景1.细胞分离技术根据所取组织可分为：离心分离法（细胞外液环境）；机械分离法（如切割，挤压等）；化学分散法（如酶）；细胞表面抗原等。

2.培养细胞的纯化自然纯化；人工纯化。

人工纯化又包括酶消化法，反复贴壁法，机械刮除法，克隆法，培养基限定法，流式细胞仪等。

3.细胞冻存与复苏基本原则：慢冻快融。

二、实验步骤1.取出肾脏1)将乳鼠（3天左右）用剪刀断头放血致死。

2)进入无菌间，用70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。

3)在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。

4)用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有 PBS溶液的平皿中。

（由于肾太小不易操作，故未除去肾膜与脂肪等）5)纵向将肾脏剪开（除去肾盂）。

将肾脏剪成数块，用PBS溶液再洗涤一次。

6)吸弃PBS溶液，将肾脏剪碎（小而均匀，肉泥状）。

2.消化法原代培养1)加入0.5mL 胰酶—EDTA溶液，于37℃消化15分钟，直至组织块变白、呈疏松状（镜检可见分散细胞）。

2)加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化，将枪头顶住皿底反复“吹打”分散细胞。

3)实际试验中并没有出去任何大块组织（结果证明得到很多细胞，应该是损失较少）。

1000rpm离心10min；弃上清。

4)加入PBS溶液重复洗涤、离心一次。

5)加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞；取20μl细胞悬液进行细胞计数（由于细胞太多，故放弃计数）。

6)将剩余980μl细胞悬液加入到10mL培养瓶中，补加血清DMEM培养基到终体积为1.5ml。

37℃、5% CO2培养。

7)第三天（周四）上午，更换全部培养液。

8)下个周一，进行传代培养。

3.整理：1)取肾后，将鼠尸体置于专门的垃圾袋中。

2)蜡盘、大头针用洗干净后，浸泡于酒精中。