小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察

? 巨噬细胞广泛分布于全身各处。当病原微生物或其他 异物进入机体时，能招引巨噬细胞向异物所在处移动， 伸出伪足将之包围并内吞入细胞形成吞噬体，继而和 溶酶体融合形成吞噬溶酶体，在其中将异物杀伤消除。
吞噬过程
? 大致分为四个阶段： ? 识别结合 ? 部分吞入 ? 形成内吞体（或称吞噬体） ? 形成吞噬溶酶体。
结果观察
? 用40倍镜或油镜观察巨噬细胞吞噬鸡红 细胞情况。画出不同吞噬阶段的图。
注意事项
? 1、粘附过程要防止液体干掉； ? 2、吞噬时间应掌握好，过短，鸡红细胞
尚未被吞入；过长，已吞噬消化。
? 4、制片。（ 1）直接观察：滴 1滴腹腔液，盖上 盖玻片直接观察；
（2）染色观察
? 加0.2ml-0.3ml腹腔液于盖玻片上，放湿 盒置37℃恒温培养箱30min使巨噬细胞粘 附；
? 用带针头的注射器吸取0.01M，PH7.2的 PBS 5ml冲洗掉未粘附的细胞及腹腔液；
? 将玻片浸入甲醇中固定3－5min，凉干； ? Giemsa染色30min； ? 流水冲去浮液，凉干观察。
实验操作
? 1、巨噬细胞诱导。实验前 1天，每只小鼠腹腔 注射1ml 4％淀粉肉汤。
? 2、体内吞噬。实验当天，先给每只小鼠腹腔注 射2ml 1%鸡红细胞生理盐水悬液，轻揉腹部， 使其在腹腔分布均匀。吞噬 45min。
? 3、处死小鼠，吸取巨噬细胞。脱颈处死小鼠， 随即向腹腔注入 1ml生理盐水，揉匀。然后剪开 腹部皮肤，暴露腹膜，用带针头的注射器插进 腹腔吸取腹腔液；
吞噬过程示意图
吞噬现象
试验材料、试剂及仪器用品
材料
? 1、6－8周龄健康雄性小鼠 ? 2、5％鸡红细胞。 ? 采血1ml，放入4ml阿氏液中，用PBS洗3

镜下可见巨噬细胞核呈蓝色被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形其胞浆呈红色而核核呈蓝色被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形其胞浆呈红色而核被染成蓝色
实验10 小鼠巨噬细胞功能测定
1.实验目的
了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理； 熟悉和掌握巨噬细胞吞噬试验的方法。
2.实验原理ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
巨噬细胞具有吞噬、分泌和参与免疫应答的各种 功能，是机体免疫水平和功能的重要指标，与抗肿瘤免 疫也有重要关系。本试验将鸡红细胞注入小鼠腹腔时， 会被腹腔中的巨噬细胞吞噬。取小鼠腹腔液涂片、染色 ，在显微镜下观察可见鸡红细胞被吞噬的现象。计算吞 噬百分率和吞噬指数，可判断巨噬细胞的吞噬功能，据 此可判断机体的非特异性免疫水平。
3.实验器材
（1） 器具：注射器、离心管、载玻片、平皿、烧 杯、橡皮乳头、解剖剪和镊子、解剖盘。 （2） 材料：Hank’s液、6%淀粉肉汤液、瑞氏染 色液、 1%鸡红细胞悬液、 小鼠。
4.实验方法（小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能体内测定法）
（1）实验前3d，给小鼠腹腔内注射无菌6%淀粉肉汤液1ml。 （2）实验当天，给小鼠腹腔注射1％的鸡红细胞悬液1ml ，轻 揉腹部使鸡细胞分散，令其活动20~30min。 （3）然后颈椎脱臼处死小鼠，仰卧固定。常规消毒腹部皮肤， 左手持镊提起腹中部皮肤。右手用剪子剪长5mm的小口， 从剪口处朝头、尾部用力，撕开皮肤，暴露腹壁。
未被吞噬的鸡红细胞
吞噬了鸡红细胞 的巨噬细胞
5.注意事项
（1）涂片的薄厚要适当，否则影响计数。 （2）小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。 （3）如小鼠腹腔液过少，可腹腔注入适量Hank’s液揉动 后再取。 （4）剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果。 （5）被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未 被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间。

捉拿方法：
将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持 其尾巴向后拉，小鼠那么会尽力向前蹬。 用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤， 然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。
腹腔注射
给药方法：
小白鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静 脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们 常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如 前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用 酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下， 进针1～2mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹 腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿 左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的 液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。
『实验原理』 高等动物体内存在着具有防疫功能的吞
噬细胞系统，它由粒细胞和单核细胞等白细 胞构成，是机体免疫系统的重要组成局部。 巨噬细胞是体内的一种重要的免疫细胞，具 有非特异性吞噬功能，当机体受到细菌等病 原体及其它异物侵入时，巨噬细胞将向病原 体或异物游走，当接触异物时，伸出伪足将 其包围并进行内吞作用，将病原体或异物吞 入细胞，形成吞噬泡，进而初级溶酶体与吞 噬泡发生融合，将异物消化分解掉。本实验 将观察到小鼠巨噬细胞对进入其体内的鸡血 红细胞进行吞噬的情况。
单核巨噬细胞
『实验内容和方法』 (一)标本制备 1、在实验前一天，每只小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤(含4％
的台盼蓝)lml。 2、实验时每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1％的
鸡红细胞悬液lml。然后轻揉小鼠腹部，使鸡红细胞分 散。(腹腔注射时不要刺伤内脏) 3、20分钟后向腹腔注射0.5 ml生理盐水，轻揉小鼠腹部， 使其腹腔液稀释。3分钟后用用颈椎脱臼法处死小鼠。 4、将小鼠置于解剖盘中或卫生纸上，剪开腹腔，把内脏 推向一侧，用吸管或不装针头的注射器吸取腹腔液。 5、每人取一干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片， 标本便制备好了。 6、实验绘图。

小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。

实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。

注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。

（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。

（3）固定小鼠，暴露腹腔。

（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。

（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。

（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。

（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。

（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。

（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。

（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。

第1篇一、实验目的1. 了解巨噬细胞的基本形态和生物学特性。

2. 掌握巨噬细胞的分离和培养方法。

3. 观察巨噬细胞的吞噬功能，并分析其吞噬能力。

二、实验原理巨噬细胞是一种具有吞噬功能的免疫细胞，属于单核吞噬细胞系统。

在机体免疫应答中，巨噬细胞起着重要的作用。

本实验通过分离和培养小鼠腹腔巨噬细胞，观察其吞噬功能，以了解巨噬细胞在免疫应答中的作用。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 实验试剂：无菌生理盐水、台盼蓝染液、鸡红细胞悬液、小牛血清、RPMI-1640培养基等3. 实验设备：解剖显微镜、手术器械、细胞培养箱、细胞培养皿、离心机、显微镜等四、实验方法1. 巨噬细胞的分离和培养（1）无菌操作下，取小鼠腹腔液，加入等体积的生理盐水，混匀。

（2）将混合液以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。

（3）加入适量RPMI-1640培养基，轻轻吹打，使细胞悬浮。

（4）将细胞悬液接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养。

2. 巨噬细胞的吞噬功能观察（1）将培养好的巨噬细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。

（2）加入台盼蓝染液，染色5 min。

（3）用生理盐水冲洗3次，弃上清液。

（4）加入鸡红细胞悬液，混匀。

（5）将细胞悬液置于细胞培养箱中培养30 min。

（6）取出细胞，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。

（7）加入适量RPMI-1640培养基，轻轻吹打，使细胞悬浮。

（8）将细胞悬液滴于载玻片上，置于显微镜下观察。

五、实验结果与分析1. 巨噬细胞的分离和培养在实验过程中，成功分离和培养了小鼠腹腔巨噬细胞，细胞呈圆形或椭圆形，细胞核位于细胞中央，细胞质丰富。

2. 巨噬细胞的吞噬功能观察在显微镜下观察，发现巨噬细胞对鸡红细胞具有吞噬作用。

部分巨噬细胞吞噬了鸡红细胞，细胞质内出现红色颗粒。

3. 吞噬能力分析通过观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的数量，可以评估其吞噬能力。

实验结果显示，巨噬细胞的吞噬能力较强，吞噬鸡红细胞的数量较多。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离及其功能性观察小鼠腹腔巨噬细胞的分离及其功能性观察一、实验目的1. 学习小鼠腹腔巨噬细胞的制备技术；2. 通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬蟾蜍红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义；3.掌握小鼠腹腔注射给药及脊椎脱臼处死方法。

二、实验器材显微镜，注射器，盖玻片，载玻片，滴管，试管，烧杯，离心机，离心管三、试剂1. 任氏液：Nacl 6.5gKCl 0.14gCacl2 0.12gNaH2PO4 0.01gNaHCO3 0.20g蒸馏水 1000ml2. 阿氏液（红细胞保存液）：葡萄糖 2.05g柠檬酸钠 0.89g柠檬酸 0.05gNaCl0.42g蒸馏水 100ml调pH至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min,置4℃冰箱保存。

3. 4%台盼蓝染液：台盼蓝 4gNaCl 0.9g蒸馏水 100ml4．6%淀粉肉汤：牛肉膏 0.3g蛋白胨 1.0gNaCl0.5g蒸馏水 100ml加入可溶性淀粉6.0g，加热促使溶解，再煮沸灭菌，置4℃冰箱保存，使用时以水浴融化，加入适量4%台盼蓝染液混匀。

5. PBS溶液6. 3%NaHCO3溶液四、生物材料1．小鼠（体重20g左右）；2．1%蟾蜍红细胞悬液：采用穿刺法处死蟾蜍后，迅速从心脏采血1ml,放入盛有4ml 阿氏液的瓶中，混匀置4℃冰箱保存备用，使用前加入任氏液离心（1500rpm,10min）洗涤两次，再用任氏液配成浓度为1%的细胞悬液。

五、实验步骤1. 先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台上（或放在篮子里，方便固定），用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置于左手手心中，把后肢拉直，用左手的无名指和小指按住尾巴和后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部1/2处的一侧注射。

2. 实验时，取一只小鼠，腹腔注射1%蟾蜍红细胞悬液1ml。

（一定要刺破腹腔，不能注射到皮下）另一只小鼠，先腹腔注射1ml淀粉台盼蓝溶液，再腹腔注射1%蟾蜍红细胞悬液1ml。

小鼠腹腔吞噬实验报告小鼠腹腔吞噬实验报告一、引言吞噬作为一种重要的细胞功能，在免疫系统中起着重要的作用。

腹腔巨噬细胞是一类在腹腔内胚胎发育过程中产生的巨噬细胞，它们能够吞噬和消化异物、细菌和坏死细胞等。

本实验旨在观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。

二、材料与方法1. 材料：BALB/c小鼠（8周龄，雄性和雌性各5只）、PBS、0.1%苏木精溶液、0.1%酚溶液、尼龙网、离心管、移液管、顶针、显微镜和实验台。

2. 方法：（1）将BALB/c小鼠以适当的麻醉方式麻醉后置于实验台上；（2）在小鼠腹部剃毛，用70%酒精消毒；（3）用显微镊子将小鼠腹部皮肤拉开，插入15号顶针穿透腹腔；（4）慢慢抽取腹腔中积聚的液体；（5）将抽取的液体均匀滴在一块尼龙网上，用PBS洗涤；（6）将尼龙网取出，放入一滴0.1%苏木精溶液中染色10分钟，洗净；（7）将尼龙网摆到显微镜下，观察包括吞噬细胞数量和吞噬效果等。

三、结果与分析经过腹腔巨噬细胞吞噬实验后，我们观察了吞噬细胞的数量和吞噬效果。

在5只雌性小鼠中，吞噬细胞的数量平均为10个，吞噬效果良好，吞噬颗粒清晰可见。

在5只雄性小鼠中，吞噬细胞的数量平均为12个，吞噬效果也良好，吞噬颗粒清晰可见。

通过统计分析发现，雄性小鼠相较于雌性小鼠具有更高的吞噬细胞数量，但两者之间差异不显著。

四、讨论1. 从实验结果来看，小鼠腹腔巨噬细胞具有较好的吞噬能力，能够有效地清除异物和消化坏死细胞等。

2. 在我们的实验中，我们观察到雄性小鼠的吞噬细胞数量略高于雌性小鼠，这可能与性别激素的差异有关，但仅仅依靠本实验无法确定性别激素对吞噬能力的具体影响，需要进一步的研究来证实。

3. 本实验中使用的苏木精和酚溶液可以染色吞噬细胞，便于观察。

但这种方法相对于其他荧光染色方法来说更为繁琐，同时也可能对细胞造成一定的伤害。

4. 本实验中只是通过观察吞噬细胞数量和吞噬效果来判断腹腔巨噬细胞的吞噬能力，后续的实验可以考虑使用其他细胞学和分子生物学技术来进一步验证腹腔巨噬细胞的功能和机制。

肠道巨噬细胞的提取肠道巨噬细胞的提取是一个复杂的过程，下面将尽量清晰地为您分点阐述：一、实验准备实验动物：选择6-8周龄，体重在18-22克之间的健康小鼠，如昆明小鼠或SPF级小鼠。

实验材料：准备必要的实验器材，如注射器、细胞培养板、离心管等，以及实验试剂，如PBS缓冲液、RPMI-1640培养液、胎牛血清等。

二、提取步骤注射刺激物：向小鼠腹腔内注射3%巯基乙醇酸钠或其他刺激物，以积聚巨噬细胞。

注射量为每只小鼠2ml，注射后等待3天。

处死小鼠并消毒：采用脱颈方式处死小鼠，将小鼠置于无菌操作台上，用75%乙醇浸湿小鼠腹部皮肤3分钟进行消毒。

收集腹腔液：用无菌剪刀剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹膜。

然后用无菌巴氏吸管从腹腔开口深入腹腔，反复冲洗腹膜腔，灌洗液可回收约8ml。

离心与清洗：将收集到的灌洗液在常温条件下以1000r/min离心10分钟，弃去上清液，用PBS液洗涤细胞沉淀。

细胞培养：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞，然后将细胞接种到培养板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养3小时。

之后洗去未贴壁的细胞，剩下的贴壁细胞即为巨噬细胞。

巨噬细胞观察与计数：培养24小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态。

使用0.5%胰酶消化细胞，离心并重悬细胞悬液，使用细胞计数板计数每个灌洗液中分离的巨噬细胞数量。

三、活性检测（可选）通过台盼蓝染色法检测巨噬细胞的活性。

将巨噬细胞与台盼蓝染液混合后静置一段时间，然后滴在载玻片上观察。

活细胞不会被染色，而死细胞则会被染成蓝色，从而区分活细胞和死细胞，并计算细胞活性。

请注意，以上步骤仅供参考，具体操作可能因实验条件和需求而有所不同。

在实际操作中，应严格遵循实验室安全规范和操作指南以确保实验的成功和安全。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
目的:建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离的简便方法,为低强度激光照*对巨噬细胞功能的影响研究提供实验细胞.方法:以无血清的RPMI-1640培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养.采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染*计算存活率,瑞氏染*计算纯度.结果:获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征.结论:本法是一种简便实用的分离小鼠腹腔巨噬细胞的方法.
肖丹,XIAODan(第四*医大学*事预防医学系,陕西,西安,710032)。

吞噬速率测定
通过定量分析，计算出巨噬细胞的吞 噬速率，结果表明吞噬速率与细胞活 性呈正相关。
结果分析
吞噬机制探讨
根据实验结果，分析巨噬细胞吞 噬作用的机制，包括细胞膜的运 动、细胞骨架的调节以及与吞噬
相关的酶类作用等。
吞噬与免疫关系
探讨巨噬细胞吞噬作用与免疫系统 的关系，分析其在机体防御和炎症 反应中的作用。
利用荧光物质标记细胞或 外来物质，以便在显微镜 下观察和追踪。
细胞培养技术
在体外培养巨噬细胞，以 便观察其吞噬行为。
显微观察技术
通过显微镜观察巨噬细胞 吞噬现象，记录并分析实 验结果。
03
实验步骤
准备实验材料和试剂
实验材料
小鼠巨噬细胞、细菌悬液
试剂
生理盐水、培养基、染色剂
器材
显微镜、培养皿、移液管、离心机
1. 用染色剂对细胞进 行染色。
步骤三：染色与观察
实验操作流程
01 2. 在显微镜下观察并记录吞噬现象，如吞 噬数量、吞噬程度等。
02
步骤四：数据记录与处理
03
1. 详细记录实验数据，包括吞噬数量、吞 噬程度等。
04
2. 对实验数据进行统计分析，得出结论。
数据记录和处理
01
使用表格或电子表格记录每组实验数据。
学习并掌握相关实验技术和方法
通过本实验，学生将学习并掌握相关的实验技术和方法，如细胞培养、显微镜观 察、染色等技术。这些技术是生物学和医学领域中常用的基本技能，对于学生未 来的学习和工作具有重要意义。
通过实践操作，学生可以加深对相关理论知识的理解，提高实验操作能力和科学 探究能力。此外，本实验还可以为学生提供实践经验，为后续的课程和科研工作 打下基础。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养一、引言巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，可以通过吞噬微生物、吸收细胞碎片等功能来保护机体免受外来侵害。

近年来越来越多的研究者将目光投向了巨噬细胞的研究领域，例如探究其功能调控、对特定疾病的影响等。

因此，了解如何分离和培养小鼠腹腔巨噬细胞是非常重要的。

二、实验材料1.小鼠（BALB/c或C57BL/6等品系）2.70%乙醇3.磷酸盐缓冲液（PBS）4.腺苷酸二钠（ADT）5.玻璃钝刀6.吹瓶（20ml）7.离心管（50ml）8.腹腔灌注针头9.离心机10.培养皿11.消化液（十氟化十六烷、胰酶混合液等）12.FBS（fetal bovine serum）13.RPMI-1640培养基14.静菌枪、离心管、显微镜等三、实验步骤1.准备工作选用2~3个月龄（约20g体重），性别未限制的小鼠，放至3-4人一笼中，在恒定温度（22-24℃）、湿度（40-60%）下，24小时自由进食饮水，减轻其压力。

实验前，将所需物品全部准备好，消毒好所需器材。

消毒方式可以选择用70%的乙醇喷震或者紫外线照射15min等方式进行消毒，确保实验平凡洁净。

2.腹腔巨噬细胞的分离（1）小鼠腹腔巨噬细胞的处理将麻醉过的小鼠放于消毒好的操作台上，用70%乙醇消毒好腹部，剖开腹腔，将肝、脾、小肠等剔除，留下含有腹腔巨噬细胞（PC）的腹腔。

用离心管接住腹腔内的生理盐水，加1mM ADT处理吸入至腹腔中，轻摇腹腔5分钟，将其取出至消化液中，消化液中加入0.2%的凯西酶和50ug/mL的DNA酶，然后用13g钩头灌注针将其搅拌并吸入管内灌注30分钟，在摇床上50转/分钟恒温摇晃1h。

将腹腔液收集到离心管内离心，离心350g 20分钟，去除上清流体，重悬沉淀细胞于PBS液中。

（2）巨噬细胞的筛选将离心沉淀细胞的上清液放在吹瓶中，吹出细胞液，离心25min后，去掉上清，用PBS液中悬浮细胞过滤到细胞培养皿70%PMI-1640中化为单细胞。

（3）将腹腔细胞悬液滴于干净玻片上，置 37 ℃ 湿盒内。 1～2h后倾去玻片上的液体。并用腹腔冲洗液轻洗玻片， 即可见玻片上有毛玻璃样的单层核巨噬细胞粘附，巨噬 细胞含量可达9ห้องสมุดไป่ตู้%。
（4）在显微镜下计算巨噬细胞的百分比，以检测分离结果。
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五 注意事项
（1）皮肤和腹膜要分别剪开，并确保皮肤血液 不流入腹腔。
（2）腹腔内的冲洗液要全部吸干。 （3）腹腔冲洗液洗玻片时要适量，既要保证将
盐分清洗干净，又不将细胞洗脱。
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六 思考题
绘图并描述观察到的各种细胞的形态特征 计算腹腔巨噬细胞的百分比。
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MΦ分布：单核细胞主要于血液中，巨噬细胞几乎存在 于所有表皮和黏膜下组织。
MΦ形态：有伪足，马蹄状单核，细胞形体大。
MΦ分离纯化：小鼠和大鼠腹腔内有丰富的巨噬细胞， 可用腹腔清洗的方法获得较多细胞悬液。正常小鼠每 只可收集腹腔渗出细胞106，其中30%为巨噬细胞，如 果给小鼠腹腔注射某中刺激物，可使巨噬细胞渗出增 加，易于分离更多的巨噬细胞。
纯化：巨噬细胞易于沉降和贴壁，对X射线不敏感，而 淋巴细胞和成纤维细胞对X射线敏感。
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三 材料与器材（略）
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四 操作步骤
（1）将小鼠以颈椎脱臼法处死，仰卧，固定四肢。
（2）依次用碘酒及酒棉球消毒腹部，以镊子提取腹壁，剪 去一小块皮肤，继以镊子提取腹腔。剪一小口。以注射 器注入少量冲洗液。用滴管吸出，再注入冲洗液并吸出， 滴管在腹腔内各个位置吸取液体，冲洗每只小鼠腹腔约 共 5 mL
实验5 小鼠腹腔巨噬细胞收集 及形态观察

剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪
开一小口(注意避开血管)，用1640灌注腹腔，收集腹
腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，
去上清，沉积细胞用1640离洗一次。最后沉积细胞
用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1-2×106
／ml)。
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（2）白色念珠菌制备 将白色念珠菌接种于沙氏平 皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理 盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去 掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗 涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃ 冰箱保存备用。
四角的大方格，又分为16个中方格，适用于 白细胞计数。中央大方格以双线等分为25个中方格。 每个中方格又分16个小方格，通常我们取四角的4个 中方格和中间的1个中方格来计数红细胞。
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首先用吸管吸取少许稀释后的单细胞悬液，从 盖片端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入， 静置数分钟后，再放在微镜下观察计数。
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3、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使 用的吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入 的细胞数就相应的少一点。
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血球计数板计数法
血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中 央有两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见 下图），每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为 0.1mm。因此，每大方格容积为0.1mm3。
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感谢您的观看！
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（3）吞噬细胞与菌混合培养 取巨噬细胞0.5ml加白色念珠菌悬液0.5ml，置

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。

方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。

采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。

结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。

结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。

【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定0.引言巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。

有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。

本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。

1.材料与方法1.1实验对象清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。

1.2实验方法1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。

轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。

再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。

用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。

倒置显微镜观察细胞形态。

1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定（1）台盼蓝染色计算存活率。

4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。

一、实验目的1. 了解小鼠腹腔注射免疫荧光染色技术的基本原理和操作步骤。

2. 观察小鼠腹腔巨噬细胞在免疫荧光染色下的形态和分布。

3. 掌握免疫荧光染色的实验操作技巧。

二、实验原理免疫荧光染色是一种以荧光物质标记抗体，用于检测和定位特定抗原的技术。

在实验中，将荧光素标记的抗体与小鼠腹腔巨噬细胞结合，通过荧光显微镜观察，可以直观地看到巨噬细胞的形态和分布。

三、实验材料1. 实验动物：昆明种小鼠，体重20-25g。

2. 试剂：荧光素标记的抗体（抗小鼠巨噬细胞抗体）、FITC标记的抗体（抗小鼠IgG抗体）、细胞培养液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、无菌注射器、无菌针头、荧光显微镜等。

四、实验方法1. 小鼠腹腔注射：取昆明种小鼠，用无菌注射器抽取荧光素标记的抗体（抗小鼠巨噬细胞抗体）0.2ml，进行腹腔注射。

2. 细胞收集：注射后24小时，取小鼠腹腔液，加入细胞培养液，离心洗涤后收集细胞。

3. 胶体金标记：将收集到的细胞悬液与FITC标记的抗体（抗小鼠IgG抗体）混合，室温孵育30分钟。

4. 荧光显微镜观察：将孵育好的细胞悬液滴加到载玻片上，用荧光显微镜观察小鼠腹腔巨噬细胞的形态和分布。

五、实验结果通过荧光显微镜观察，可见小鼠腹腔巨噬细胞被荧光物质标记，呈球形或椭圆形，大小不一。

荧光主要分布在细胞膜和细胞质中，部分细胞核也被荧光物质标记。

细胞之间相互连接，形成一定的组织结构。

六、实验讨论1. 免疫荧光染色技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，广泛应用于免疫学、病理学等领域。

2. 在本实验中，小鼠腹腔巨噬细胞被荧光物质标记，通过荧光显微镜可以直观地观察到巨噬细胞的形态和分布。

3. 实验过程中，应严格控制操作条件，如温度、时间等，以保证实验结果的准确性。

七、实验结论本次实验成功观察到了小鼠腹腔巨噬细胞在免疫荧光染色下的形态和分布，验证了免疫荧光染色技术在免疫学领域的应用价值。

八、实验注意事项1. 实验操作过程中，注意无菌操作，避免污染。

巨噬细胞吞噬作用的观察实验报告一．实验目的1.通过小鼠腹腔巨噬细胞对异物吞噬作用的观察，了解巨噬细胞在非特异性免疫中的功能。

2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。

3.学习小鼠腹腔注射的操作方法和步骤。

二．实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。

连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。

2.台盼蓝是一种生物染料，专一染色死细胞。

活细胞的细胞质膜对台盼蓝有不透过性。

巨噬细胞吞噬含有台盼蓝的淀粉肉汤后，可以消化其中的淀粉和蛋白质，但是不能消化其中的台盼蓝，因此台盼蓝会聚集在溶酶体中。

是一种溶酶体染色的方法。

3.当向小鼠腹腔中注射鸡红细胞时，鸡红细胞作为外源物质，会被小鼠细胞识别并吞噬，在适当的的时机，我们就有可以在显微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程三．实验材料及设备1.实验材料：a)连续2~3天向腹腔中注射含台盼蓝的淀粉肉汤的小鼠一只b)鸡红细胞悬液c)生理盐水2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片、盖玻片若干c)注射器d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤1.小鼠处理与巨噬细胞采集a)连续2-3天（每天一次）向小鼠腹腔中注射含台盼蓝的淀粉肉汤。

b)选择已注射淀粉肉汤3小时以上的小鼠一只。

c)一人控制住小鼠，露出腹部，另一人用注射器向小鼠腹腔中注射1ml鸡红细胞悬液。

按摩小鼠腹部。

d)20-30分钟后，再注射1-1.5ml生理盐水（0.9%NaCl）按摩小鼠腹部。

e)3分钟后，引颈法处死小鼠f)迅速在腹腔剪开一个不大的开口（注意要剪开腹部的肌肉层），用无针头的注射器吸取腹腔液。

g)在载玻片上滴2-3滴腹腔液，加上盖玻片，在显微镜下观察。

2.观察在不同倍数下观察样本，找到正在消化或者吞噬鸡红细胞的巨噬细胞。

注意避免玻片液体干涸。

五．实验结果小鼠红细胞巨噬细胞鸡红细胞已吞噬鸡红细胞的巨噬细胞图1小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞装片（100X物镜不染色）左上角示未知种类细胞100x物镜放大倍数，光镜下可见随机分布的不同种类的细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养范仕郡,刘㊀鑫,黄㊀敏,王㊀宁,郑㊀江㊀(第三军医大学西南医院中心实验室,重庆400038)㊀㊀[摘㊀要]㊀目的㊀建立一种小鼠腹腔巨噬细胞快速提取的方法,为细胞实验提供便捷㊂方法㊀用生理盐水灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,转入高糖DMEM 培养液中培养㊂采用台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度,倒置显微镜观察细胞形态㊂结果㊀获得较高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征㊂结论㊀本方法是一种简便实用的提取小鼠腹腔巨噬细胞的方法㊂㊀㊀[关键词]BALB /c 小鼠;巨噬细胞;提取;培养;鉴定㊀㊀[中图分类号]Q813.1㊀[文献标识码]A㊀[文章编号]1672-5042(2015)02-0130-02㊀doi:10.11659/jjssx.11E014005㊀[基金项目]国家自然科学基金项目(81171781)㊀[收稿日期]2014-11-12㊀㊀[修回日期]2014-12-20Establishment of a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophagesFAN Shi-jun,LIU Xin,HUANG Min,WANG Ning,ZHENG Jiang㊀(Central Laboratory,Southwest Hospital,Third Military Medi-cal University,Chongqing 400038,China)㊀㊀Abstract :Objective ㊀To establish a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophages.Methods ㊀Abdominal lavagewas performed with NS and the peritoneal macrophages was purified from the lavage,which was later transferred into high glucose DMEM cul-ture medium.Cell viability was measured via the typan blue staining.Purity was observed via Wright's stain.Results ㊀High purity macropha-ges with typical morphology were obtained.Conclusion ㊀A simple and realistic method was set up for the isolation of murine peritoneal mac-rophages.㊀㊀Keywords :BALB /c mice;macrophage;extraction;culture;identification㊀㊀巨噬细胞是一类重要的天然免疫细胞,来源于外周血中的单核细胞,具有吞噬降解细菌㊁释放炎症介质㊁介导炎性细胞趋化㊁抗原提呈等活性,在抗感染㊁抗肿瘤免疫中发挥着非常重要的作用[1-2]㊂因此研究巨噬细胞的功能,对于深入理解机体免疫防御和免疫调节机制具有重要意义㊂获取原代细胞是体外研究巨噬细胞功能的重要方法㊂巨噬细胞在肺㊁肝㊁脑等实质器官以及腹腔等空腔部位以不同的形式分布㊂国内外已有不少文献报道从多种组织器官中成功分离和纯化巨噬细胞[3-5]㊂然而在实质脏器中的巨噬细胞,往往受到环境介质中各种理化和生物刺激因素的影响,已发生炎性活化或产生了定向分化,为其体外研究造成了干扰㊂而腹腔中存在大量静息状态的巨噬细胞,且腹腔中细胞种类较少简单,易于分离,是获取巨噬细胞的常用部位[6-9]㊂目前有关腹腔巨噬细胞的分离方法较为复杂,且操作耗时较长㊂本方法在既往文献报道基础上,对小鼠腹腔巨噬细胞提取方法加以改良,建立了一种更为简便实用的小鼠腹腔巨噬细胞的提取方法㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料及实验设备㊀㊀实验用材料及试验设备有:8周龄BALB /c 雌性小鼠(由北京华阜康生物科技股份有限公司提供)㊁生理盐水㊁胶头滴管㊁75%乙醇㊁眼科剪㊁眼科镊㊁10mL 一次性注射器㊁50mL 离心管㊁台盼蓝㊁瑞氏染液㊁奥林巴斯IX71倒置显微镜㊁奥林巴斯E400显微镜㊁细胞培养箱等㊂1.2㊀实验方法1.2.1㊀实验准备㊀㊀将眼科剪㊁眼科镊㊁胶头滴管高压灭菌;离心管辐照消毒;BALB /c 小鼠3只禁食8h;实验前将超净台紫外线消毒30min㊂1.2.2㊀细胞提取㊀㊀将小鼠脱颈椎处死,并浸入75%乙醇中10s㊂然后取出小鼠,沥干,将其仰卧于不锈钢方盘上㊂用注射器吸6mL 生理盐水液注入腹腔中,轻揉小鼠腹部2min,使液体在腹腔内充分流动㊂用眼科镊提起下腹皮肤,使动物微倾向一侧㊂剪开腹部皮肤后在肌肉层剪1个小口,用胶头滴管将腹腔液吸出转入离心管中㊂每只吸出量约为4~5mL㊂1.2.3㊀细胞培养㊀㊀在4ħ条件下,将收集的腹腔灌洗液在1000r /min 条件下离心10min,去上清,加入高糖DMEM 细胞培养液用细胞计数板计数㊂显微镜下(10ˑ100倍)计数巨噬细胞㊂调整细胞浓度至所需,接种至细胞培养瓶,37ħ培养箱孵育4h,充分贴壁后,弃上清,除去非粘附细胞再加入高糖DMEM 细胞培养液,放回培养箱中培养备用㊂2㊀结果2.1㊀台盼蓝染色㊁瑞氏染色结果㊀㊀分别用台盼蓝染色计数(图1a)㊁瑞氏染色计算纯度(图1b)㊂台盼蓝染色后,3min 内,镜下分别计数活细胞和死细胞㊂死细胞被染成蓝色,而活细胞呈无色透明状㊂细胞活力(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)ˑ100%>95%㊂瑞氏染色后,在镜下通过细胞形态计数巨噬细胞和细胞总数㊂巨噬细胞获得率(%)=巨噬细胞细胞总数/细胞总数ˑ100%>90%㊂a:台盼蓝染色;b:巨噬细胞瑞氏染色,箭头指示为瑞氏染色后巨噬细胞图1㊀提取细胞台盼蓝染色㊁瑞氏染色(ˑ1000)2.2㊀细胞形态观察㊀㊀培养12h 后,在倒置显微镜下可观察到细胞呈椭圆形㊁多角形或不规则形,部分贴壁(图2a)㊂培养24h 后观察可以观察到细胞贴满培养瓶,大部分出现伪足㊂部分细胞伸展开并牢固粘附在培养瓶表面(图2b)㊂a:培养12h 后细胞形态;b:培养24h 后细胞形态图2㊀培养后细胞形态3㊀讨论㊀㊀在鉴定细胞方面,采用台盼蓝染色其原理是活细胞的胞膜结构完整,台盼蓝不能够进入胞内,不能着色㊂反之死细胞的细胞膜通透性增加,台盼蓝进入后被染成蓝色㊂因此,采用台盼蓝染色计数死细胞和活细胞非常简便快捷,是组织和细胞培养中经典的鉴定染色方法㊂瑞氏染液为中性染料,它使细胞核及胞浆着色㊂染液中含有缓冲液来调节酸碱度,因此细胞染色后,蓝色和红色都比较适中,细胞核㊁胞浆显色都非常清楚,是目前在细胞染色中最简单和常用的方法㊂在细胞的提取过程中要注意无菌操作,注意器械和实验环境的消毒㊂选用雌性小鼠是因其肠壁脂肪较少,方便腹腔液的收集㊂周龄较大的小鼠腹腔巨噬细胞数量较少,最好选用6~8周龄小鼠㊂㊀㊀巨噬细胞广泛分布于体内,它不仅在非特异性免疫反应中发挥重要作用,而且也是机体特异性免疫中的一类关键细胞[10-11]㊂由于腹腔巨噬细胞多游离存在,易于获得,因此,许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系㊁或筛检免疫增强药物和探讨其作用机制时,往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象[12-13]㊂本方法在提取时,和其他方法一样,均是灌洗腹腔后,吸出含有巨噬细胞的灌洗液,然后离心培养㊂但传统方法中均采用淀粉肉汤㊁无菌液体石蜡等腹腔注射预刺激几天,以提高其获得率㊂预刺激处理一方面增加了操作的复杂程度,另一方面可影响分离巨噬细胞的静息特征㊂本方法实验前不需预刺激,减少了污染概率,大大缩短了细胞获取的准备时间,所得的巨噬细胞活力和获得率均大于90%㊂因此,此方法是一种简便实用的小鼠腹腔巨噬细胞的提取方法,为巨噬细胞的相关实验研究奠定了基础㊂[参考文献][1]Classen A,Lloberas J,Celada A.Macrophage activation:classical versus alternative[J].Methods Mol Biol,2009,531(6):29-43.[2]Bayne LJ,Beatty GL,Jhala N,et al.Tumor-derived granulocyte-macro-phage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and Tcellimmunity in pancreatic cancer[J].Cancer 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