SOP-QC-023-01检定菌传代与接种标准操作规程

检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程一、前言简要介绍微生物检定的重要性以及制定标准操作规程的目的。

二、适用范围明确本规程适用的微生物种类和使用场景。

三、术语和定义列出本规程中使用的专业术语及其定义，如菌种、传代、检定等。

四、菌种的检定4.1 检定目的确保菌种的纯度和特性4.2 检定方法形态学检定生化特性检定分子生物学检定4.3 检定记录记录检定结果和相关数据五、菌种的保存5.1 保存条件温度控制湿度控制光照控制5.2 保存方法冷冻干燥保存低温保存液体培养基保存5.3 保存记录记录保存条件和时间六、菌种的传代6.1 传代目的维持菌种活性和特性6.2 传代方法液体培养基传代固体培养基传代6.3 传代周期规定传代的时间间隔6.4 传代记录记录传代过程和结果七、菌种的使用7.1 使用前的准备环境消毒个人防护7.2 使用方法接种培养观察和记录7.3 使用记录记录使用过程和结果八、菌种的销毁8.1 销毁条件菌种不再需要菌种污染或变异8.2 销毁方法高温灭菌化学消毒8.3 销毁记录记录销毁过程和结果九、安全和生物防护9.1 安全操作规程实验室安全个人防护装备使用9.2 生物防护级别根据菌种危险性确定防护级别9.3 应急预案制定微生物事故应急预案十、质量控制10.1 质量控制标准制定菌种质量控制标准10.2 质量控制检查定期进行质量控制检查10.3 质量控制记录记录质量控制结果十一、附录包括菌种检定记录表、保存记录表、传代记录表、使用记录表、销毁记录表等。

十二、参考文献列出编写本规程时参考的文献或标准。

检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程1．目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

2．依据：ChP2010版（一部）、《中国药品检验标准操作规范》（2010年版）。

3．范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。

4．责任：4.1.QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发。

4.2.微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5.相关文件及术语：5.1．术语标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。

传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

6.标准：6.1．检定菌的申购QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。

6.2．检定菌的接收菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。

6.3．检定菌的保存6.3.1．工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。

检定菌传的传代、贮存、接 种及销毁操作规程。 二、人员范围：质控部微生物限度检验员、 无菌检验员。
三、标准：熟练掌握检定菌传代、贮存、 接种及销毁的规范操作。


操作(包括流程、程序及节点等)： 1. 来源：检定菌种由药检部门提供已接种的菌种 斜面。 2. 保存： 2.1将购来的试管菌种放入冰箱中冷藏保存。 2.2将传代并经过培养后的菌种放入冰箱中保存。 2.3每只保存菌种需标明菌名、统一编号、接种 日期。

3.8 操作过程中，如因不慎使硅胶塞触及火焰 而着火，切勿用口吹，须在刚刚着火时迅速塞 入试管，因管内氧气不足会很快熄灭。若硅胶 塞外端着火，可用手捏熄。若硅胶塞烧坏不宜 再用，可另取末接种斜面培养基上的灭菌硅胶 塞，代替塞上。 3.9 传代和接种使用后，应记好记录。


4. 菌种销毁： 实验结束后，所有废菌液、 菌种均应经过温度121℃、时间60min、压 力0.10Mpa-0.15Mpa高压蒸汽灭菌后，再进 行处理，不得直接倒掉。

3. 传代和接种： 3.1 试验用菌种每1～2月传代一次，在菌种接 种室内进行传代和接种。 3.2 先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作。 烧灼接种环。 3.3 再将原有的菌种斜面培养基（简称菌种管） 与待种的新鲜斜面培养基（简称接种管），持 在左手拇指、食指及中指之间，要注意能清楚 地观察到斜面，菌种管在前，接种管在后。应 斜持试管呈45°角，使试管内斜面向上，两试 管口平齐，注意不要持成水平，以免管底凝集 水浸湿培养基表面。

3.6 先将烧灼过的接种环插入菌种管内，先接 触无菌苔生长的培养基上，如有熔印则表明接 种环未冷却，能烫死细菌。一定待冷后，再从 斜面上挑取菌苔少许。取出时接种环不能通过 火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上 轻轻划线接种。划线时一般先由下而上划一直 线后，再由下而上划曲线。操作过程应迅速， 勿使菌苔沾至管壁或管口。 3.7 当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌， 右手放到火焰旁塞上硅胶塞，不要将管口离开 火焰旁去迎接右手的硅胶塞。最后将接种环烧 灼灭菌放置原处，再把可能未塞紧的硅胶塞塞 紧，即可进行培养。

无菌检验、微生物限度检查检验用菌株。 3 内容 3.1 传代前将购进菌种及灭菌后的营养琼脂小斜面置于室温放置 30分钟，待温度平衡后再移入阳性操作室内。 3.2 换好衣服，戴好口罩、手套，用消毒水将手清洗干净。 3.3第二、三代工作菌种的制备： 从超低温冰箱中取出所需的菌种冷冻管，置于35～40℃的水浴中进 行解冻1分钟。 解冻后，放入生物安全柜内，用冷却后的灭菌接种 环从冷冻管中取一环菌液接种于10ml灭菌营养肉汤培养基中，置于 30～35℃的培养箱内18～24小时，进行增菌培养。〔第二 代〕培养后，用冷却的灭菌接种环从增菌液中沾取一环接种于相应 的培养基斜面上贴上菌种标签，置于30～35℃的培养箱内18～24小 时，进行培养。确认符合后置于5℃的冰箱内保存。使用时将培养 出的斜面用5ml的灭菌生理盐水将斜面上的菌落洗下制成菌悬液使 用。〔第三代〕在第三代菌种有效期内进行第四代的接种传代。 3.4 第四、五代工作菌种的制备：
从5℃的冰箱内取出第三代工作菌种，用冷却的灭菌接种环挑取1个 菌落接种于相应的琼脂斜面培养基中，置于30～35℃的培养箱内培 养18～24小时后，确认符合后置于5℃的冰箱内作为第四代工作菌 种保存，备用。 3.5 接种操作规范 3.5.1点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手 拿接种棒后端，将接种环烧红30秒钟，随后将全部接种棒金属部分 在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住硅 胶塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开硅胶塞，将 接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔 上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。 塞上硅胶塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂小斜面一支，右手用 无名指、小指及掌部夹住硅胶塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼， 右手再轻轻拨开硅胶塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由 低向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使菌划在斜面的表面 上。 3.5.2 取出接种环，在火焰旁将培养基管硅胶塞堵上，然后将接 种过菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。 3.5.3 将已接种好的细菌管置30—35℃细菌培养箱培养18—24小 时，霉菌管置23—28℃霉菌培养箱培养5-7日。取出后放入冰箱保 存并上锁。 3.6 菌种的传代次数不得超过5代，每一菌株每次传代不超过15 支；1支作为下次传代用，其余作为检验用，每月传代一次。 3.7 传代完毕后，在每支试管上标明菌株名称、代数、序号、传 代日期、有效期。 3.8 实验用菌株均来自于上海市食品药品检验所。