卡那霉素B工程菌的构建及其发酵特性研究
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摘 要 ： 研 究 高 产 卡 那 霉 素 Ｂ产 业 化 工 程 茵 的 构 建 ． 以 主 产 氨 甲 酰 卡 那 霉 素 Ｂ工 程 茵— — 黑 暗链 霉 菌 Ｓ ． ｔ ｅ ｎ ｅ ｂ ｒ ａ ｒ ｉ —
ｕ ｓ ３ １ ２为 出发 菌株 ， 进 一步敲除氨 甲酰磷 酸 转移酶 基 因 ｔ ｏ ｂ Ｚ， 获得 直接 产卡 那霉 素 Ｂ的工 程茵 Ｓ Ｔ３ １ ４ ． 对 工 程 茵 Ｓ Ｔ ３ １ ４的 生 物 合 成 潜 力进 行 研 究 ， 在 ２ ０ ０ Ｌ发 酵罐 上 进 行 放 大 实验 ， 测定各 参数 ， 并绘制发酵代谢 曲线． 结果表明 ， 该 茵株 遗 传 特 性 稳 定 ， 产抗能力得到 有效 恢复 ， 提 高 幅 度 接 近 ２倍 ； 该 工程 茵产卡 那霉素 Ｂ的能 力达到 ４ ５ ０ ０ Ｕ／ ｍＬ ． 黑 暗链 霉 菌 Ｓ Ｔ３ １ ４的研 究 可 以 向 产 业 化 生 产 转 移 ． 关键词 ： 黑暗链霉菌 ； 卡 那霉素 Ｂ ； ｔ ｏ ｂ Ｚ； 基 因敲 除 ； 发 酵特 性
表6发酵周期对发酵单位的影响发酵周期h发酵单位uml184198796203012037501324069144453515641901683798245发酵代谢曲线根据以上结果进一步扩大到在200l发酵罐进行培养控制温度为36罐压为004mpa转速为150rmin通风量为3m3h定时取样发酵144h测定ph菌丝质量分数效价溶解氧总糖还原糖和氨基氮等绘制发酵代谢曲线图612
第３ ８ 卷 第１ 期
Ｖ０ １ ． ３ ８ Ｎｏ ． １
宁夏 大 学 学报 （ 自然 科 学 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎｉ ｎ ｇ ｘ ｉ ａ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ （ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅ 氨 甲酰 卡 那 霉 素 Ｂ的黑 暗链
霉菌 Ｓ ． ｔ ｅ ｎ ｅ ｂ ｒ ａ ｒ ｉ ｕ ｓ ３ １ ２ （ Ａ ａ ｐ ｒ Ｄ３ 一 Ｄ４ ） ， 进 一 步 敲 除 氨 甲酰磷 酸转移 酶基 因 ｔ ｏ ｂ Ｚ， 阻 断 由 卡 那 霉 素 Ｂ 转
Ｃ ３ 位 为羟 基 ， 而妥 布 霉 素 上 为 氢． 妥 布 霉 素 的 主要
２ ０ １ ７ 年３ 月
Ｍａ ｒ ． ２Ｏ １７
文章编号 ： ０ ２ ５ ３ — ２ ３ ２ ８ （ ２ Ｏ １ ７ ） Ｏ １ — ０ ０ ８ ３ — ０ ７
卡 那 霉 素 Ｂ工 程 菌 的构 建 及 其 发 酵 特 性研 究
陈 晖 ， 温淑 平 ， 洪 文 荣
（ 福 州大学 生物科学与工程学 院， 福建 福 州 ３ ５ ０ １ １ ６ ）
产生 菌黑 暗链 霉菌 ， 可 以产 安 普 霉 素 和 氨 甲酰 卡 那 霉素 Ｂ ． 研究 表 明 ， 黑 暗链 霉菌 中存 在 ２个 生 物合 成 基 因簇 ， 一 个为 安普 霉素 生物 合成 基 因簇 ］ ， 另一 个 为妥 布霉 素生 物合 成基 因簇 ］ ． ２ ０ ０ ７年 ， Ａｂ ｏ ｓ ｈ ａ ｎ ａ ｂ 通 过 对 安 普 霉 素 与 妥 布 霉 素 基 因 簇 进 行 比 较 分 析＿ ４ ］ ， 推测 安 普 霉 素 基 因簇 中 ａ ｐ ｒ Ｄ３与 ａ ｐ ｒ Ｄ４编 码 的 酶参 与 了妥 布霉 素合 成过 程 的 ３ 脱 羟基 反应 ． 此外 ， 他还 推测 在 氨 甲酰 妥 布 霉 素 与 氨 甲酰 卡 那 霉 素 Ｂ的生 物合成 过 程 中 ， 首先 合成 卡那 霉素 Ｂ， 然 后 通过 ３ ， ‘ 脱 羟基 酶催 化转 化为妥 布 霉素 ； 妥 布霉 素 与 卡 那霉 素 Ｂ最 后 通 过 氨 甲酰 化 反 应 分 别 形 成 氨 甲 酰 妥布 霉素 与氨 甲酰 卡那 霉 素 Ｂ ． ２ ０ １ ２年 ， Ｐ ａ ｒ ｔ ｈ ｉ ｅ ｒ 等 通 过体外 生 化 实验 对 ｔ ｏ ｂ Ｚ的 晶 体 结 构 及 其催 化
１ 材 料 与方 法
１ ． １ 材 料
１ ． １ ． １ 质 粒 与 菌 株 质 粒 ｐ ＭＥ １ ２ （ 含 红 霉 素 抗 性
基因 ｅ ｒ ｍＥ） 、 温敏 型穿 梭载 体 ｐ ＫＣ１ １ ３ ９ 、Ｅ ．ｃ ｏ ｌ ｉ Ｔｏ ｐ ｌ Ｏ 、 Ｅ ．ｃ ｏ ｌ ｉ Ｅ Ｔ１ ２ ５ ６ ７ （ ｐ ＵＺ ８ ０ ０ ２ ） ［ 保 存 于 本 实验 室． 出发 菌株黑 暗链 霉 菌 Ｓ Ｔ ３ １ ２由本 实 验室 选 育 和保 藏．
用 福 州 大 学 生 物 科 学 与 工 程 学 院微 生 物 制 药 实
化需 求 ， 从 而 大大 制 约 了 阿 贝卡 星 与地 贝 卡星 的开 发 与应用 ｎ ］ ． 卡 那霉 素 Ｂ的 结构 与 妥 布 霉 素极 其 相 似， 唯一 的不 同 在 于 Ｃ ３ 位 的基 团， 卡 那 霉 素 Ｂ 的
分 类 号 ：（ 中 图） Ｑ９ ３ 文献标志码 ： Ａ
卡 那霉 素 Ｂ是 重要 的氨基 糖 苷类 抗 生 素 ， 主要 用 于治疗 由葡 萄球 菌属 和结 核分 枝杆 菌等 引起 的严 重感 染 ． 卡 那霉 素 Ｂ还 是制 备 半合 成 抗生 素 阿 贝卡 星 和地 贝卡 星 的关 键 原 料．目前 ， 卡 那 霉 素 Ｂ 的主 要来 源是 从生 产 卡那霉 素 Ａ 的废液 中分 离得 到 ． 由
于分 离工 艺复 杂 ， 含 量少 ， 得来不易， 难 以 满 足 工 业
机制 进 行 了 深 入 研 究＿ ５ ］ ， 详 细 阐明 ｔ ｏ ｂ Ｚ 的 功 能． ２ ０ １ ３年 ， 李辉 采用 框架 内删 除 失活 方 法 ， 对 ｔ ｏ ｂ Ｚ基 因进 行 阻断 ， 发 现 阻断 变 株 不再 产 生 氨 甲酰妥 布 霉 素［ ６ ］ ， 主要 产 安 普 霉 素 与妥 布 霉 素 ， 证明了 ｔ ｏ ｂ Ｚ编 码 氨 甲酰磷 酸转 移酶 ．
化 为 氨 甲酰 卡那 霉 素 Ｂ的氨 甲酰作 用 ， 获 得直 接 产
卡那 霉 素 Ｂ 的工 程 菌．目前 ， 国 内外 未 见 采 用专 一 性 产生 卡那 霉 素 Ｂ的 工 程 菌或 自然 菌进 行 工 业 化 生产 ． 笔 者 围绕 专一 性产 生 卡那 霉素 Ｂ生 产菌 进 行
研 究 与开发 ， 取 得 了 良好 的效 果 ．
