沙门菌属和志贺菌属检验

肠杆菌科的鉴定1、标本要求：1.1 尽量用药前采集标本。

1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。

1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。

1.4 粪便：病人留取粪便5 10g，送检。

1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。

血标本不要冷冻。

1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。

2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂羊血平皿、麦康凯平皿、硝酸盐培养管、葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖酸盐培养管、苯丙氨酸脱氨培养管、氨基酸脱羧培养管、拘橼酸盐培养管、尿素培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人肠杆菌鉴定板。

4、试验方法及原理：4.1 硝酸盐还原试验：方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。

结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。

注意点：（1）．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。

（2）．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。

所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。

若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。

4.2 甲基红试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。

结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。

4.3 尿素培养基方法：将待检菌穿刺接种于尿素培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：培养基变红为尿素阳性，不变色为阴性。

4.4 拘橼酸盐试验(Simmons法)方法：将待检菌接种于拘橼酸盐培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。

4.5 氨基酸脱羧试验方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。

结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。

以呈现2+凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。

一般认为，伤寒沙门菌O抗体凝集价在1：80以上，H抗体在1：160以上，甲、乙、丙型副伤寒沙门菌凝集价在1：80以上才有诊断意义。

注意事项
1．加入诊断菌液时，由对照管开始往前，每管各加O．5ml。

2. 结果观察时不要振荡试管，先观察，必要时再轻摇试管使凝块从管底升起，最后按液体的清浊，凝块的大小进行记录，对照管(不凝集)与试验管同时对着光线往暗处看液体透明度和凝集块。

3.“H”凝集呈絮状，以疏松之大团铺于管底，轻摇试管即能荡起，而且极易散开。

4．“O”凝集呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底，轻摇试管不易荡起，且不易散开。

微生物检验实验室沙门菌属标准操作规程1.概述沙门菌属是一大群寄生于人和动物肠道中的形态、培养特性、生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌，其血清型别繁多、抗原复杂的肠道病原菌，分为6个亚属、2200种以上的血清型。

伤寒沙门菌属亚属I，多价O抗血清D群，是临床上最为重要的沙门菌。

2.标本类型粪便、血液等额标本。

3.鉴定3.1 形态与染色：革兰阴性杆菌，菌体细长，大小为（0.7~1.5um）×（2~5um）。

有周鞭毛，无芽胞，无荚膜。

3.2 培养特性：在麦康凯琼脂平板上形成无色、透明的菌落；SS琼脂平板上呈无色、透明，但大部分菌落中央呈黑色（产H2S）；在XLD琼脂平板上也产生中央黑色的菌落（产H2S）；HE琼脂平板上菌落呈蓝绿色。

CHROMagar显色培养基上呈紫色菌落。

半固体琼脂中均匀混浊生长，无穿刺线。

3.3 生化反应：氧化酶试验阴性，TSI为K/A；发酵葡萄糖，不发酵乳糖；IMViC-+--或-+-+，H2S试验阳性或阴性，动力、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验阳性，鸟氨酸脱羧酶、尿素酶试验阴性，氰化钾（KCN）培养基不生长。

3.4 鉴别要点：3.4.1 本菌特征：鉴别平板上无色透胆或半透明的菌落，TSI为K/A，H2S阳性或阴性，有动力，IMViC-+--或-+-+，尿素酶试验阴性。

符合上述特性者，可通过血清凝集试验）作出诊断。

3.4.2 与志贺菌属的鉴别：少数伤寒沙门菌在TSI上H2S阴性，动力不明显，易与志贺菌属混淆，可用血清凝集反应相鉴别。

3.5 操作步骤3.5.1 观察菌落特征，挑取可疑菌落，做TSI试验。

参见细菌鉴定标准操作构规程。

3.5.2 血清学鉴定参见沙门菌血清学检测标准操作规程。

3.5.3 鉴定从SS琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。

4. 药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。

5. 质量控制参见质量管理程序。

《医学微生物学》三大常规的微生物学检查从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。

因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。

1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。

病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。

对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。

2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。

若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。

3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。

另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。

4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。

如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。

【血液标本检查】正常人的血液是无菌的。

当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。

细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。

一、标本采集l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。

穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。

2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。

伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。

3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。

肠杆菌科及检验● 考点概述概念；命名与分类原则；共同特点；自然与人体内的分布；微生物学检查方法；临床意义。

埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属及其他肠杆菌科细菌。

生物学性状；微生物学检验；临床意义。

【内容讲解】一、概述（共性）肠杆菌科是由多个菌属组成，G-杆菌，生物学性状相似。

大多数肠道杆菌属于正常菌群。

当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时成为条件致病菌而引起疾病。

部分为致病性细菌。

（一）分类肠杆菌科细菌的种类繁多。

主要根据细菌的形态、生化反应、抗原性质以及核酸相关性进行分类。

根据《伯杰系统细菌学手册》（1984年）将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌属、耶尔森菌属等。

（二）生物学特性1.形态与染色G-，杆菌，大小为（1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。

多数有周鞭毛（除志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC），无芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。

2.培养需氧或兼性厌氧；营养要求不高；普皿和麦康凯培养基：中等大小、表面光滑的菌落；液体培养基：混浊生长。

3.生化反应发酵葡萄糖产酸、或产酸产气；乳糖发酵试验：非致病菌 +，致病菌 -（除外变形杆菌）。

触酶阳性；氧化酶阴性；硝酸盐还原为亚硝酸盐。

4.抗原构造表面抗原（如Vi抗原、K抗原）：包绕在O抗原外的不耐热的多糖抗原，可阻断O抗原与相应抗体之间的反应，加热处理能破坏其阻断作用。

5.变异菌落S～R变异鞭毛H～O变异耐药性变异生化反应性质的改变6.抵抗力不强。

加热60℃，30分钟即被杀死。

不耐干燥，对一般化学消毒剂敏感。

对低温有耐受力，能耐胆盐。

7.肠杆菌科的初步分类（三）致病性1.致病性肠道杆菌：以肠内感染为主，腹泻为共显症状，引起急慢性肠道感染、食物中毒、旅游者腹泻及肠热症等。

2.条件致病菌：为医院感染主要病原菌，出现移位感染。

大便培养操作规程目的：检查大便是为了检查从业人员是否携带致痢疾或者伤寒疾病的志贺氏菌和沙门氏菌，从而证明受检者具备做从业规定的健康素质，更为了保护从业人员和服务对象的健康。

一、接种1、准备好干净无菌的大便管，无菌采样器（去掉一头棉签的棉签），酒精灯，接种环，SS培养基平板，370C恒温培养箱2、用刚取出的竹签挑取少许大便置于大便管中，点燃酒精灯，在无菌条件下采用无菌操作用接种环在SS培养基平板中两区划线，后置于370C恒温培养箱中培养24h（±2h）。

二、观察1、做形态学检查，观察平板中是否存在所要检测菌属沙门菌：革兰阴性细长杆菌，菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色，有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。

志贺菌：革兰阴性短小杆菌，直径2mm左右的中等大小、半透明的光滑型菌落；宋内志贺菌可形成扁平、粗糙的菌落。

2、如不存在这些类似菌属则按正常处理；如存在疑是沙门菌或者志贺菌属，则做下一步鉴定。

三、凝集鉴定1、沙门菌属鉴定试剂：沙门氏菌诊断学清原理：本品系用沙门氏菌属的代表菌株制成灭火菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收除去非特异性凝集素后制成，通过玻片凝集试验原理供沙门氏菌属常见菌型定型。

方法：于洁净玻片一端滴1~2滴血清，取少量被检菌苔与血清混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照，轻轻摇动玻片，1分钟内肉眼观察结果。

结果判读：对照呈均匀混浊；于1分钟内明显凝集者为阳性，呈均匀混合者为阴性。

2、志贺菌属鉴定试剂：志贺菌属诊断血清原理：本品系用志贺菌属的代表菌株制成灭活菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收除去属内非特异性凝集素后制成，通过凝集实验原理诊断各型志贺氏菌。

方法：于洁净玻片一端滴1~2滴血清，然后取少量被检菌苔于血清混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照，轻轻摇动玻片，1分钟内肉眼判断结果。

结果判读：对照呈均匀混浊；于1分钟内明显凝集者为阳性，呈均匀混合者为阴性。

肠杆菌科【器材】一、SS平板培养基：选择性培养基，有促进目的菌生长的物质和鉴别用指示剂.1、煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等能抑制G+菌及大多数大肠生长，胆盐促进伤寒生长。

2、大肠分解乳糖产酸：中性红（6.8红－8.0黄）变红，与胆盐结合合成胆酸，因而形成中心混浊的深红色菌落，病原菌不分解乳糖，故菌落呈透明微黄色。

3、枸橼酸铁能指示硫化氢产生，硫化铁呈黑色4、硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺、沙门菌的毒害作用，并中和煌绿、中性红染料的毒性，使大肠红色鲜明二、KIA斜面培养基：用酚红作指示剂（6.8黄－8.4红）。

上层为固体琼脂斜面，含乳糖。

下层为半固体琼脂，含葡萄糖，含硫酸亚铁。

1、细菌如能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则斜面及底层均呈黄色，且有气泡。

非致病菌（如大肠埃希菌）一般既可利用乳糖也可利用葡萄糖，但肺克也是如此。

2、如细菌只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因葡:乳为1:10，斜面所产生的少量的酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层则是在相对缺氧的状态下，所生成的酸不被氧化挥发而保持黄色。

致病菌一般不能利用乳糖，可用于区别致病/非致病菌。

3、如细菌分解蛋白质产生硫化氢，则与硫酸亚铁反应生成硫化亚铁（黑色沉淀物），使培养基变黑。

左：不发酵乳糖，强产硫化氢。

中：不发酵乳糖，不产硫化氢。

右：发酵乳糖，不产硫化氢4、接种方法：先穿刺到底，再在斜面划线。

【实验内容】一、氧化酶试验原理：见奈瑟菌属部分操作：取氧化酶纸片，刮去KIA或普通平板或普通平板上的较大菌落，观察纸片颜色的变化，呈蓝紫色为阳性，不变为阴性（如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，阳性者则为红色）。

肠杆菌科多为阳性（但变形杆菌为阴性）。

注意事项：因SS培养基中的化学成分和生化反应复杂，其菌落可使滤纸变为紫红色，故对肠道杆菌进行触酶和氧化酶试验时，宜从普通平板或KIA斜面上取菌，以保证试验结果正确。

二、动力试验：原理：有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长。