江苏省260株结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型研究

1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。

1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。

目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。

1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。

扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。

目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。

目前在国内区县级应用评估。

1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。

直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。

夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。

夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。

1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。

同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。

2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。

虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。

2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。

基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值杨璟1 王丽玲2 胡荣2 肖杰2 阮小洁2 宋家武2发布时间：2023-05-14T03:07:24.287Z 来源：《中国科技人才》2023年5期作者：杨璟1 王丽玲2 胡荣2 肖杰2 阮小洁2 宋家武2 [导读] 目的：对结核分枝杆菌耐药性检测过程当中应用基因芯片技术的效果以及价值进行分析研究。

方法：从2019年1月至2022年11月在医院接受治疗的疑似患有结核病的患者当中随机无目的性地挑选200名参与到这一次实验研究当中。

结果：200名疑似患者当中阳性患者40名，占比20%，基因芯片检测结果显示结核病38例，非结核病2例，阳性几率为19%，耐药基因检测21例，利福平以及异烟肼基因突变3例，总突变几率为14.3%，其中，有2例为利福平以及异烟肼均耐药，双重基因突变几率为9.5%，另外1例只耐受利福平，利福平总突变几率为14.3%，异烟肼总突变几率为9.5%，耐多药几率为9.5%。

结论：结核分枝杆菌耐药性检测过程当中应用基因芯片技术具有明显的效果，能够有效减少诊断时间，提高工作效率，所以可以进行大范围推广应用。

1.珠海市人民医院呼吸科2.广东省基因芯片工程技术研究中心，珠海赛乐奇生物技术股份有限公司广东珠海 519001摘要：目的：对结核分枝杆菌耐药性检测过程当中应用基因芯片技术的效果以及价值进行分析研究。

方法：从2019年1月至2022年11月在医院接受治疗的疑似患有结核病的患者当中随机无目的性地挑选200名参与到这一次实验研究当中。

结果：200名疑似患者当中阳性患者40名，占比20%，基因芯片检测结果显示结核病38例，非结核病2例，阳性几率为19%，耐药基因检测21例，利福平以及异烟肼基因突变3例，总突变几率为14.3%，其中，有2例为利福平以及异烟肼均耐药，双重基因突变几率为9.5%，另外1例只耐受利福平，利福平总突变几率为14.3%，异烟肼总突变几率为9.5%，耐多药几率为9.5%。

『毕业论文社区』优质论文硕博学位论文1／62学校代码10285学号20134221110硕士学位论文学术学位论文题目结核分枝杆菌磷酸酶ptpB抑制巨噬细胞杀伤TB的功能研究题目英文翻译Effect of MptpB on inhibiting the function of macrophage to kill TB研究生姓名樊玲波指导教师姓名董元舒副教授专业名称免疫学研究方向感染免疫病所在院系生物医学研究院论文提交日期2016年3月『毕业论文社区』中文摘要目的：结核病是由结核分枝杆菌（Mtb）感染引起的严重的慢性传染性疾病，世界上有三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年造成约两百万人死亡。

近年来，随着结核分枝杆菌的多重耐药性菌株的出现及与艾滋病的共感染，结核病的控制难度不断加大。

为研发新型的疫苗及治疗药物，我们需要对结核病发病的分子机制做透彻的研究。

MptpB是Mtb分泌的重要毒力因子。

从结构上看MptpB属于酪氨酸磷酸酶，体外实验显示出对酪氨酸，丝氨酸/苏氨酸及磷酸肌醇的磷酸酶活性，体内底物尚不清楚。

MptpB缺失的Mtb感染豚鼠后细菌载量比野生型低越70倍，感染活化的巨噬细胞后细菌载量也比野生型低5到7倍，说明MptpB抑制了巨噬细胞杀伤Mtb的功能，是支持Mtb在体内存活的重要毒力因子。

本研究的目的是探查MptpB在巨噬细胞中的作用，并初步探讨其作用机制。

方法及结果：（1）我们首先克隆了MptpB基因，构建了其真核载体，并建立了过表达MptpB的巨噬细胞系Raw-MptpB。

为检测过表达的MptpB对Mtb存活的影响，我们用H37Rv感染了Raw-MptpB及对照细胞，并分别计数了细菌载量。

结果表明，Raw-MptpB细胞在感染H37Rv2-6天后细菌载量比对照细胞高2-4倍。

（2）为确定MptpB对巨噬细胞免疫功能的影响，我们在用IFN-γ，LPS及H37Rv 刺激Raw-MptpB及对照细胞后，用real time PCR及ELISA检测了多种细胞因子的表达，发现MptpB抑制了IL-1β及IL-6在巨噬细胞中的表达；我们同时用western blot测定iNOS表达量，并检测了其产物NO的含量，发现MptpB抑制了iNOS 的表达并降低了NO在培养液中的浓度；我们用被剪切的caspase3的蛋白量,caspase3的活性及p53蛋白水平来检测Raw-MptpB细胞的凋亡，发现MptpB抑制了IFN-γ及H37Rv诱导的细胞凋亡。

结核分枝杆菌基因分型及其耐药性分析【摘要】探讨四川地区结核患者结核分枝杆菌基因分型及其与耐药性关系。

方法采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术，对124株结核分枝杆菌的6个可变重复位点进行检测，并应用Gel-Pro analyzer 3.0软件和BioNumerics(Version 3.0)软件对检测结果进行基因型分析，同时分析其基因型与耐药之间的关系。

结果 124株结核分枝杆菌共分为37个不同的VNTR类型，成簇基因型占74.19%（92/124），单一基因型占25.81%（32/124）。

耐药菌株在成簇类型和单一类型的分布上存在统计学差异。

结论四川地区结核患者的结核分枝杆菌具有明显的基因多态性，成簇类型是主要流行菌株，应加强流行结核菌株的监控。

【关键词】结核结核分枝杆菌基因分型Abstract：Objective To study on genotyping of Mycobacterium tuberculosis(MTB) isolates and to analysis the relation between drug resistance and genotype of Variable number tandem repeat(VNTR)in Sichuan area.Methods Six tandem repeat loci of the 124 isolates ofM.tuberculosis in Sichuan area were analyzed by PCR and agarose gel electrophoresis.The results of genotyping were analyzed with Gel-Pro analyzer 3.1 software and BioNumerics 3.0 software，and the relation between genetic type and drug resistance was explored.Results A total of 37 different allele profiles were identified by the VNTR for all the 124 isolates，74.19%（92/124）and 25.81%（32/124）belonged to cluster type and single type respectively.Drug resistant M.tuberculosis was significantly associated with cluster type.Conclusion There is obvious genetic polymorphism in the M.tuberculosis isolates in Sichuan area.And the clustering type was perhaps the main epidemic strains.It is suggested that surveillance of the epidemic genotype to be strengthened.Key words:tuberculosis；Mycobacterium tuberculosis;genotyping结核病仍然是一种严重危害人类健康的重大传染性疾病，特别是耐药结核分枝杆菌的发生和流行，给结核病的治疗、预防和控制带来巨大困难。

基因芯片技术及其在结核分枝杆菌检测中的应用荣爱红;赵蓬波;侯晓杰【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)012【总页数】3页(P2347-2349)【作者】荣爱红;赵蓬波;侯晓杰【作者单位】吉林省人民医院,吉林,长春130021;吉林省人民医院,吉林,长春130021;吉林省人民医院,吉林,长春130021【正文语种】中文结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，主要侵犯肺脏。

在某些经济欠发达地区，许多结核病患者因为得不到全程，合理的救治而产生结核耐药，这使得控制结核病的发生发展成为世界性问题。

目前，临床实验室采用的检测结核分枝杆菌的方法主要有抗酸染色法和细菌培养法。

抗酸染色法简便、实用、快捷，但非结核性分枝杆菌亦可出现阳性结果；细菌培养作为结核病诊断的金标准，虽优于抗酸染色法，但时间比较长，影响早期用药；荧光染色和PCR是可供选择的检测方法，却可能出现假阳性和假阴性；而依赖于基因芯片的PCR杂交法敏感性和特异性均高，是比较准确的检测方法［1］。

1 基因芯片基因芯片（gene chip）技术是随着“人类基因组计划”（human genome project，HGP）的进展而发展起来的，它是21世纪以来影响最深远的重大科技进展之一，是物理学、微电子学与分子生物学综合交叉形成的高新技术。

1.1 基因芯片的概念基因是指具有遗传效应的DNA片段，位于细胞的染色体上。

我们将大量的基因片段按一定的顺序固定在特定的载体上，即为基因芯片。

在一块约1cm2大小的芯片上，可固定数千甚至上万的基因片段，由此形成一个密集的基因方阵，方便对多个基因进行同步检测［2］。

1.2 基因芯片的优点基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量的检测技术，正逐步成为疾病诊断的尖端技术之一［3］，其优点主要表现在：一，灵敏性和准确性；二，快捷简便性；三，同步性。

在医学领域，医生针对多种相似病原菌进行鉴别诊断时，若能应用基因芯片技术，则短时间内就能知道病人是哪种微生物感染，这对指导临床合理，及时，准确的用药提供了很大的方便。

扬州市结核分枝杆菌利福平耐药基因突变分析发表时间：2019-05-28T10:05:48.223Z 来源：《医药前沿》2019年9期作者：戴洁1 曾方林1 王金富（通讯作者）1,2 [导读] 目的：了解本地区结核分枝杆菌利福平耐药基因的突变特征。

（1扬州市第三人民医院江苏扬州 225025）（2扬州大学人兽共患病学重点实验室江苏扬州 225002）【摘要】目的：了解本地区结核分枝杆菌利福平耐药基因的突变特征。

方法：利用基因芯片检测346例经鉴定为结核分枝杆菌的菌株利福平耐药基因，分析本地区利福平耐药基因突变特征。

结果：346例结核分枝杆菌中利福平耐药基因发生突变的例数为58例（16.7%）。

利福平rpoB基因耐药位点分布如下：531位点为58.6%，526位点为31.1%，511位点为6.9%，516位点为3.4%。

结论：本地区MTB对利福平耐药rpoB基因耐药位点以531位点最多，526位点次之。

【关键词】结核分枝杆菌；基因突变；利福平【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）09-0223-02 利福平（RFP)是从利福霉素B得到的一种半合成抗生素，能抑制细菌DNA转录合成RNA，达到杀菌作用。

绝大多数的RFP耐药相关基因是rpoB（RNA聚合酶 β亚基），rpoB基因的突变会引起RFP与细菌RNA聚合酶的亲和力降低，导致细菌对RFP耐药[1]。

rpoB基因的突变主要是密码子507到533（RNA聚合酶（rpoB)β-亚单位的81-by）热点区域。

514位和533位密码子突变是引起低水平耐药的常见突变位点。

D516V，H526Y, H526D,S531L，这4个位点的突变是引起高水平耐药的常见突变[2]。

某些密码子突变引起的rpoB基因突变并不会导致细菌对RFP耐药。

本研究利用基因芯片技术对扬州地区结核分枝杆菌RFP耐药基因突变位点特征进行了分析，现报道如下。

结核分枝杆菌的研究历史及⽣物学性状！结核分枝杆菌的研究历史及⽣物学性状！！结核分枝杆菌的研究历史及⽣物学性状的研究历史结核分枝杆菌的⼀、⼀、结核分枝杆菌结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。

早在1882年，德国细菌学家柯赫（Robert Koch，1843-1910）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。

本菌可侵犯全⾝各组织器官，但以肺部感染最多见。

随着抗结核药物的不断发展和卫⽣⽣活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾⼀度⼤幅下降。

20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应⽤、吸毒、贫困及⼈⼝流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。

据WHO统计，全世界约每3个⼈中就有1个⼈感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成⼈中结核分枝杆菌携带率⾼达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。

近⼆⼗年由于艾滋病的流⾏，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性⽐未感染HIV者⾼30～50倍，且结核的病程发展更快。

此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发⽣的⼀种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病⼈的疾病负担，使其更易死亡。

21世纪以来全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万⼈死亡。

中国每年死于结核病的⼈约25万之多，是各类传染病死亡⼈数总和的两倍多。

因此，结核病⼜成为了威胁⼈类健康的全球性卫⽣问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病⾼发区⼈群的⾸要死因。

⼆、结核分枝杆菌⽣物学性状形态与染⾊结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，⼤⼩1～4X0.4µm。

⽜分枝杆菌则⽐较粗短。

分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较⾼，约占⼲重的60%，特别是有⼤量分枝菌酸（mycolic acid）包围在肽聚糖层的外⾯，可影响染料的穿⼊。

分枝杆菌⼀般⽤齐尼（Ziehl- Neelsen）抗酸染⾊法，以5% ⽯炭酸复红加温染⾊后可以染上，但⽤3%盐酸⼄醇不易脱⾊。

淮安地区350株痰结核分枝杆菌药敏结果及初复治耐药结果分析纪小亭;孙利华;曾东晓;王莉娟【摘要】目的分析淮安地区住院及门诊随访患者痰标本中分离出的结核分枝杆菌对4种常用抗结核药物的耐药情况,比较初治及复治患者对4种结核药物的敏感度差异,为临床治疗提供用药参考,减少经验用药加强规范合理用药减少结核分枝杆菌耐多药率的发生.方法采用比例法对350株结核分枝杆菌进行两种一线抗结核药(异烟肼,利福平)两种抗结核药(氧氟沙星,卡那霉素)敏感性测定.结果 350株结核分枝杆菌总体耐药率为37.7°(131/350),而初治耐药率为30.4％(71/233),复治耐药率为51.3％(60/117).另外350株结核分枝杆菌的总体耐多药率为15.4％(54/350),而初治耐多药率为11.2％(26/233),复制耐多药率为23.9％(28/117).与全国第五次结核病流行病学调查比较耐药率及耐多药率均有提高.结论复治肺结核患者分离出的结核分枝杆菌耐药率及耐多药率均较初治患者高.加强患者管理,规范治疗对初治患者尤为重要.【期刊名称】《临床荟萃》【年(卷),期】2016(031)011【总页数】4页(P1225-1228)【关键词】分枝杆菌,结核;广泛耐药结核【作者】纪小亭;孙利华;曾东晓;王莉娟【作者单位】淮安市第四人民医院医学检验中心,江苏淮安223002;淮安市第四人民医院医学检验中心,江苏淮安223002;淮安市第四人民医院医学检验中心,江苏淮安223002;淮安市第四人民医院医学检验中心,江苏淮安223002【正文语种】中文【中图分类】R378.911结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。

根据世界卫生组织的统计，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药流行严重的国家之一［1-2］。

耐药结核病尤其是耐多药结核病（multidrug resistance tuberculosis，MDR-TB）的出现给结核病的防治工作带来了极大的困难使结核病的发病率和病死率不断提高。

10种抗结核药物对结核分枝杆菌的体外抑菌试验结果分析施旭东;王雷【期刊名称】《实用医技杂志》【年(卷),期】2003(010)003【摘要】目的:探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis MTB)对抗结核药物的体外耐药情况.方法:采用绝对浓度法对840株结核杆菌和269株多耐药结核杆菌(Multidrug-resistant-Tuberculosis MDR-TB)进行10种抗结核药物体外抑菌试验.结果:在840株MTB中10种药物耐药率最高的为RFP(43.8%),最低为CPM(4.6%),而269株MDR-TB的耐药率最高为SM(74.6%),最低为CPM(11.9%).结论:应加强抗结核药物的耐药性监测,根据药敏试验选择科学有效的化疗方案.【总页数】2页(P174-175)【作者】施旭东;王雷【作者单位】南京市胸科医院,江苏,南京,210029;南京市胸科医院,江苏,南京,210029【正文语种】中文【中图分类】R978.3;R378.91+1【相关文献】1.安徽省420株结核分枝杆菌对一线和二线抗结核药物药敏结果分析 [J], 徐东芳;王庆;李孳;李东方2.结核分枝杆菌对一线抗结核药物的耐药情况分析 [J], 闫莉; 钟明浩; 关福源; 代艳杰; 罗兰娇3.北京基因型结核分枝杆菌的流行及与二线抗结核药物耐药性的相关性 [J], 梁晨; 张旭霞; 邢青; 易俊莉; 张雨晴; 李传友; 刘毅; 唐神结4.185株结核分枝杆菌抗结核药物耐药情况分析 [J], 王岙;刘昕;马莹聪;朱琳莹;齐鹏;王慧5.北京基因型结核分枝杆菌的流行及与二线抗结核药物耐药性的相关性 [J], 梁晨;张旭霞;邢青;易俊莉;张雨晴;李传友;刘毅;唐神结因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

论著·临床辅助检查CHINESE COMMUNITY DOCTORS中国社区医师2019年第35卷第33期结核分枝杆菌是导致结核病发生的主要因素，而结核病则是一种传染性比较强的疾病。

在过去一段时间内结核病得到一定程度控制，但是近几年其发病率却不断提高，成为当前对人们生命健康威胁较大的传染性疾病，得到了不少国家的关注[1]。

结核病实验室诊断是防治结核病的重点内容，金标法、抗酸染色体涂片法等都是实验室常见的检测方法，但是由于阳性检出率较低，花费时间多，所以无法更好地满足临床实际需求[2]。

基因芯片法是一种新出现的结核分枝杆菌检测技术，简单快速，准确度高[3]。

本文将选择实验室中常见的四种检测技术展开分析，具体如下。

资料与方法2018年2月-2019年2月收治结核分枝杆菌患者120例，分为4组；经过诊断后明确得出结核病患者52例，其中肺结核50例，其他种类结核2例。

方法：A 组、B 组、C 组和D 组分别接受基因芯片法、金标法、抗菌染色片涂片法和结核菌素检测法。

分枝杆菌菌种鉴定芯片从北京购买，结核抗体则是购买于上海，另外使用到的仪器包含PPD 皮试液、核酸快速提取仪、芯片干洗仪、微阵列芯片扫描仪。

征得患者同意后，所有患者分别接受四种检测法检测，具体步骤如下：①A 组方法为基因芯片法，先收集临床标本，然后再开始核算提取工作，PCR 扩增，杂交芯片、判读结果等，具体操作程序按照购买机器的说明书开展。

②B 组方法为金标法，标本需要离心之后使用。

需要在反应孔中间加上封闭液，在薄膜吸入之后继续开展检测工作，选取新鲜的血清标本，用量控制在40μL 左右，等到薄膜吸入后加入6滴洗涤液，观察结果，若检测和质控区域都呈现出红色斑点则表示结果阳性，若检测区无色，质控区红色，则为阴性。

③C 组方法为抗菌染色法，需要选取标本，在玻片正面靠右位置2/3左右的位置，将其涂抹成卵圆形，正面朝上，等到自然干燥之后再经火焰固定。

基因芯片法对苏州市结核临床分离株RFP耐药性快速检测价值的研究叶志坚;唐佩军;沈兴华;吴妹英;肖玉梅【摘要】目的通过基因芯片法检测结核分离株RFP的耐药性,为在临床诊断中利用该法快速鉴别苏州市结核RFP耐药菌株的可靠性奠定基础.方法收集痰液标本45例,利用罗氏固体培养法(金标准)对结核分枝杆菌进行传统药敏试验;利用晶芯结核分枝杆菌耐药检测试剂盒及相关仪器通过核酸提取、PCR扩增、芯片杂交和芯片扫描,对结核分枝杆菌RFP耐药相关基因rpoB的rpoB-RRDR511,513,516,526,531和533位点进行检测,将基因芯片检测获得的RFP药敏判读结果与金标准法获得的结果进行比较分析;将17例经基因芯片检测过的菌株用PCR法扩增包含rpoB-RRDR的基因片段,经纯化后进行DNA直接测序,将基因芯片对rpoB-RRDR 526,531位点的检测结果与DNA测序获得的结果进行比较分析.结果与金标准法相比,基因芯片法对菌株RFP药敏检测的准确率为93.3%(42/45);与DNA测序法相比,基因芯片法对rpoB-RRDR 526,531位点突变型检测的准确率为82.4%(14/17).结论 rpoB-RRDR 526,531位点突变是导致苏州市结核病RFP 耐药的主要因素,通过基因芯片法对rpoB基因相关位点的检测可为临床对RFP耐药结核鉴定提供一种快速、准确和批量性的检测手段,具有极大的应用价值.【期刊名称】《临床肺科杂志》【年(卷),期】2013(018)012【总页数】4页(P2169-2172)【关键词】基因芯片;结核病;利福平;耐药;DNA测序【作者】叶志坚;唐佩军;沈兴华;吴妹英;肖玉梅【作者单位】215007,江苏,苏州,苏州大学附属传染病医院;215007,江苏,苏州,苏州大学附属传染病医院;215007,江苏,苏州,苏州大学附属传染病医院;215007,江苏,苏州,苏州大学附属传染病医院;215007,江苏,苏州,苏州大学附属传染病医院【正文语种】中文随着MTB的耐药及耐多药和广泛耐药MTB的大量出现，难治性结核病的比例越来越高，结核病已成为造成死亡人数最多的单一传染病。

结核分枝杆菌分子分型技术的研究和应用李道群;夏雪山;宋玉竹;张阿梅【摘要】结核分枝杆菌是引发结核病的病原菌.近年,结核病发病有增加趋势,特别是结核杆菌耐药株增多,这些都提示其分子流行病学特点发生了改变.对不同基因型的结核病患者选取不同的治疗方案,是当今个性化医疗和结核病有效治疗的必然要求.目前广泛使用的结核分枝杆菌基因分型方法主要有插入序列6110限制性片段长度多态性、间隔区寡核苷酸分型法、多位点串联重复序列分析、全基因组测序技术、耐药相关基因突变谱分析、基因芯片分型技术等,这些方法在临床和基础研究中的应用各有利弊.本文对结核分枝杆菌的基因分型技术和应用作一综述,以期为临床工作者和基础研究人员选择适合的分型技术提供理论依据.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2016(032)001【总页数】7页(P76-82)【关键词】结核分枝杆菌;分型技术;基因分型【作者】李道群;夏雪山;宋玉竹;张阿梅【作者单位】昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650500;云南省分子医学研究中心,昆明 650500;昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650500;云南省分子医学研究中心,昆明 650500;昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650500;云南省分子医学研究中心,昆明 650500;昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明650500;云南省分子医学研究中心,昆明 650500【正文语种】中文【中图分类】R378.91目前，结核病仍然是危害全人类健康的重要感染性疾病之一[1]。

近年来由于流动人口增加、结核耐药菌株增多、HIV共感染的加剧，使得结核病的发病率和死亡率呈现逐年攀升的趋势。

2013年全球结核死亡患者达到130万，亚洲地区就达占到58%(仅我国就占到全球的10%左右)。

而传统的流行病学研究已不能很好地揭示其传播规律，因此分子生物学与流行病学研究方法相结合产生的分子流行病学方法在结核分枝杆菌分型方面表现出明显优势。

专利名称：一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统及方法专利类型：发明专利
发明人：孙义成,闫玫漪,李斯尚,丁鑫园,郭晓鹏,金奇
申请号：CN201910343121.9
申请日：20190426
公开号：CN111850025A
公开日：
20201030
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公布了一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统及方法，利用CRISPR技术与NHEJ 修复系统偶联，实现了对结核分枝杆菌基因的高效、快速的遗传操作。

本发明的基因编辑系统通过高表达NHEJ元件和抑制RecA介导的同源重组来提升NHEJ修复效率，并使DNA双链断裂发生在菌体生长的稳定期，能够实现精确删除以及同时引入多重突变，并可用于构建突变库，为研究结核分枝杆菌提供了有效的技术手段。

申请人：中国医学科学院病原生物学研究所
地址：100730 北京市东城区东单三条9号
国籍：CN
代理机构：北京万象新悦知识产权代理有限公司
代理人：李稚婷
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㊀２０２１,３７(４)中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e sD O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０２１．００．０４５ 论㊀著基于P C R 熔解曲线技术的结核分枝杆菌S p o l i g o t y p i n g 基因分型的临床应用研究蓝如束１,叶㊀婧２,罗㊀丹３,覃慧芳２,黄莉雯２,苏华斌１,罗淋尹１,林㊀玫２国家自然科学基金(N o ．８１５６０５４９)㊁广西自然科学基金(N o ．２０１７G X N S F A A １９８３３０)联合资助通讯作者:林㊀玫,E m a i l :gx l i n m e i ＠１２６．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００２Ｇ１６９３Ｇ３７２４作者单位:１．广西壮族自治区江滨医院,南宁㊀５３００２１;２．广西壮族自治区疾病预防控制中心,南宁㊀５３００２８;３．广西中医药大学公共卫生与管理学院生物统计学教研室,南宁㊀５３０２００摘㊀要:目的㊀利用基于P C R 熔解曲线技术的结核分枝杆菌S p o l i g o t y p i n g 基因分型方法(M c S p o l i g o t y p i n g)对结核分枝杆菌分离株进行基因分型,以评价其在结核病流行病学调查中的应用价值.方法㊀对广西２０１７年结核耐药监测点收集的９４９株结核分枝杆菌,采用M c S p o l i g o t y p i n g 分型方法对其进行基因分型.首先,通过对其中的３６１株菌株的M c S p o l i g o t y p i n g 分型结果与全基因组测序(WG S )结果的一致性比较来评价M c S p o l i g o t y p i n g 分型方法.其次,对９４９株菌株分型数据与S I T V I TW E B 数据库进行比对,获取间隔区寡核苷酸国际型别(s p o l i g o t y p e i n t e m a t i o n a l t y pe ,S I T )编号,将分型结果提交到h t t p s ://w w w．m i r u Ｇv n t r p l u s ．o r g /M I R U /i n d e x ．f a c e s 网站进行聚类分析.结果㊀M c S p o l ig o t y p i n g 分型与WGS 结果一致率为９４．１８％(３４０/３６１),在结果不一致标本中,出现不一致较多间隔序列在第５间隔.在９４９株菌株中新发现基因型为１２１株,已定义基因型为８２８株;其中已定义基因型共分为８４种基因型,主要归属于５种基因家族(B E I J I N G ㊁T ㊁H ㊁E A I ㊁L AM )和３个家系(L i n e a g e １㊁L i n e a g e ２㊁L i n e a g e ４);５种基因家族主要流行为B E I J I N G 和T 基因家族,家系中主要流行为L i n e a ge ２.９４９株菌株中的８２２株聚为４９个簇(２~５２８株),最大一簇为B e i j i n g 家族S I T １基因型,其余的１２７株菌表现为独特的基因型.结论㊀利用P C R 熔解曲线技术可快速对M T B 进行基因分型,此技术较传统方法操作简便㊁耗时短,对结核病疫情处置及结核病分子流行病学研究具有重要意义.关键词:结核分枝杆菌;M c S p o l i g o t y i n g;P C R 熔解曲线技术;WG S 中图分类号:R ３７８．９１㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０２１)０４－０２８５－０７C l i n i c a l a p p l i c a t i o no f s p o l i g o t y p i n g ba s e do nP C Rf u s i o n c u r v e t e c h n o l o g y i n M y c ob ac t e r i u mt u b e r c u l o s i s g e n o t y pe s L A N R u Ｇs h u １,Y EJ i n g ２,L U O D a n ３,Q I N H u i Ｇf a ng ２,HU A N GLi Ｇw e n ２,S U H u a Ｇb i n １,L U O L i n Ｇyi n １,L I N M e i ２(１．J i a n g b i n H o s p i t a l ,N a n n i n g ５３００２１,C h i n a ;２．D e p a r t m e n t o f T u b e r c u l o s i sC o n t r o l ,G u a n g x iZ h u a n g A u t o n o m o u sR e g i o nC e n t e r f o r D i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n ,N a n n i n g ５３００２８,C h i n a ;３．D e p a r t m e n t o f B i o s t a t i s t i c s ,P u b l i cH e a l t ha n d M a n a g e m e n t ,G u a n g x iU n i v e r s i t y o fC h i n e s eM e d i c i n e ,N a n n i n g ５３０２００,C h i n a )A b s t r a c t :T h i s s t u d y a i m e d t o e v a l u a t e t h e v a l u e o f s p o l i g o t y p i n g b a s e do nP C R m e l t i n g c u r v e t e c h n o l o g y (M c S p o l i g o t y pＧi n g )f o r M yc o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s (M T B )g e n e t i c t y p i n g i nt h e i n v e s t i g a t i o no f t u b e r c u l o s i se p ide m i o l o g y ．At o t a l o f９４９M T Bs t r a i n s c o l l e c t e df r o md r ug r e s i s t a n c em o n i t o r i n g s i t e s i n ２０１７i nG u a n g x i p r o v i n c ew e r e g e n o t y p e dw i t hM c S p o l i g o t y p i n g．T h e g e n e t i c t y p i n g r e s u l t s o f ３６１s t r a i n sw e r e c o m p a r e dw i t h t h e s e q u e n c e s f r o m w h o l e g e n o m e s e q u e n c i n g (WG S )f o rM c S po Ｇl i g o t y p i n g a s s e s s m e n t ．T h e t y p i n g d a t ao f ９４９s t r a i n sw e r e c o m Ｇp a r e dw i t h t h o s e i nt h eS I T V I TW E Bd a t a b a s e ,a n dt h es p o l i go Ｇt y p e i n t e m a t i o n a l t y p e (S I T )n u m b e r s w e r eo b t a i n e df r o m t h e S I T V I TW E Bd a t a b a s e ．T h e g e n e t i c t y p i n g r e s u l t sw e r e s u b m i t t e d t oh t t p s ://w w w．m i r u Ｇv n t r p l u s ．o r g /M I R U /i n d e x ．f a c e sf o rc l u s Ｇt e r a n a l y s i s ．T h e c o i n c i d e n c e r a t e o f t h e r e s u l t s (M c S p o l i g o t y p i n g a n d WG S )w a s ９４．１８％(３４０/３６１)．A m o n g t h e i n c o n s i s t e n t s p e c i Ｇm e n s ,t h e i n t e r v a l s e q u e n c e sw i t hm o r e i n c o n s i s t e n c i e sw e r e f o u n d ５８２i n５t h．A m o n g t h e９４９s t r a i n s g e n o t y p e s,１２１w e r en e w l y d i s c o v e r e d,a n d８２８h a db e e nd e f i n e d．T h e８２８d e f i n e d g e n o t y p e s w e r e c l a s s i f i e d i n t o８４g e n o t y p e s,w h i c hm a i n l y b e l o n g e d t o f i v e g e n e f a m i l i e s(B E I J I N G,T,H,E A I a n dL AM)a n d t h r e e l i nＧe a g e s(l i n e a g e１,l i n e a g e２a n d l i n e a g e４)．T h eB E I J I N Ga n dT g e n e f a m i l i e s,a n d l i n e a g e２w e r e t h em a j o r g e n o t y p e s．O f t h e ９４９s t r a i n s,８２２w e r e c l u s t e r e d i n t o４９c l u s t e r s(２t o５２８s t r a i n s)．T h e l a r g e s t c l u s t e rw a s t h eB e i j i n g f a m i l y S I T１g e n o t y p e, a n d t h e r e m a i n i n g１２７s t r a i n s s h o w e du n i q u e g e n o t y p e s．M T Bc a nb e g e n o t y p e d q u i c k l y w i t hP C R m e l t i n g c u r v e t e c h n o l o g y, w h i c h i s s i m p l e r a n d l e s s t i m eＧc o n s u m i n g t h a n t r a d i t i o n a lm e t h o d s．T h i sm e t h o d s h o u l db e h i g h l y u s e f u l i n t h em a n a g e m e n t o f t u b e r c u l o s i s e p i d e m i c s a n dm o l e c u l a r e p i d e m i o l o g i c a l r e s e a r c h．K e y w o r d s:M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s;M c S p o l i g o t y p i n g;P C R m e l t i n g c u r v e t e c h n o l o g y;WG SS u p p o r t e db y t h eN a t i o n a lN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o n o f C h i n a(N o．８１５６０５４９)a n d t h eN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o n o fG u a n g x i (N o．２０１７G X N S F A A０１９８３３０)．C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:L i n M e i,E m a i l:g x l i n m e i＠１２６．c o m㊀㊀结核病仍然是严重危害人类健康的传染病之一,每年大约有１０４０万人感染,１４０万人死于结核,形势十分严峻[１].近年来,结核分枝杆菌(M y c oＧb a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s,MT B)基因分型方法普遍用于结核病疫情处置和结核病分子流行病学研究.目前,用于MT B基因分型的主要方法有限制性片段长度多态性(I S６１１０ＧR F L P)㊁间隔区寡核苷酸分型技术(S p o l i g o t y p i n g)㊁可变串联重复序列技术(V NＧT R)等[２].这些方法普遍操作繁琐㊁耗时长㊁结果判读主观性大,操作人员需要经过严格培训.其中间隔区寡核苷酸分型技术(S p o l i g o t y p i n g)方法是最常用基因分型方法之一,传统检测技术是利用P C R方法扩增间隔序列,扩增产物与固定在杂交膜上的４３个合成的间隔序列捕获探针杂交,根据显影结果判读相应的间隔序列是否存在,进而得到菌株的基因型特征.其操作步骤多且非常繁琐,结果需要人工判读.近两年来,厦门致善公司研制出一种利用P C R熔解曲线技术对结核分枝杆菌进行s p o l i g o t yＧp i n g基因分型,该技术仅需３h完成检测,实现结果自动化判读.本研究旨在应用M c s p o l i g o t y p i n g方法对临床样本进行检测,评价其在结核病疫情处置及结核病分子流行病学研究中的应用价值.１㊀材料和方法１．１㊀标本来源㊀９４９株菌株来源于２０１７年广西结核病耐药监测,监测期间收集临床病人痰标本,应用罗氏培养基传统固体分离培养方法获得阳性培养物,经硝基苯甲酸(P N B)和噻吩Ｇ２Ｇ羧酸肼(T C H)鉴别培养基确定为MT B.质控标准菌株H３７R v由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供.１．２㊀仪器和试剂㊀Z E E S A NS L A N９６实时荧光定量P C R仪(厦门致善生物科技股份有限公司)㊁细菌超声分散计数仪(广东体必康生物有限公司).结核分枝杆菌M c S p o l i g o t y p i n g分型检测试剂盒购买于厦门致善生物科技股份有限公司,试剂包含P C R M i x A㊁P C R M i x B㊁P C R M i x C㊁MT B C酶㊁阴性和阳性对照.分枝杆菌菌种鉴定培养基购自珠海贝索生物技术有限公司.１．３㊀方㊀法１．３．１㊀D N A提取㊀采用C T A B法进行提取D N A[３],在１．５m L离心管加入４００μL１ˑT E缓冲液并取满环生长良好结核分枝杆菌,置于８０ħ水浴３０m i n灭活,将灭活好菌液在细菌超声分散计数仪超声１m i n,使细菌充分分散,加入溶菌酶使细菌充分破壁,然后用S D S/蛋白酶K混合,用C T A B/ N a C l溶液沉淀非核酸细胞碎片,用氯仿/异戊醇提取D N A,在提取液中加入异丙醇使D N A沉淀,沉淀物经洗涤且自然干燥后,加入５０μL１ˑT E缓冲液使沉淀物充分溶解,置－２０ħ保存备用,作为基因分型和WG S检测的D N A模板.１．３．２㊀M c S p o l i g o t y p i n g检测方法１．３．２．１㊀M c S p o l i g o t y p i n g方法原理㊀是采用荧光P C R熔解曲线法,选择结核分枝杆菌所携带的４３个特定的间隔序列作为检测模型.首先,在高度同源的同向重复序列(D R,d i r e c t r e p e a t)上设计一对通用引物,并利用这对通用引物扩增出间隔序列(S１ＧS４３);其次,根据每个间隔序列的D N A序列设计能够与之特异杂交的荧光探针.每条荧光探针都带有特征性的荧光标记和熔点温度组合.当P C R 产物中存在某一间隔序列时,相应的荧光探针就能与之杂交形成特征的熔解曲线峰;最后,通过这些熔解曲线峰的组成确认待检样品中所存在的间隔区,从而推断样本中所携带的结核分枝杆菌型别.对于每份检测样本需３个反应对其进行检测,对应扩增试剂中的P C R M i x A㊁P C R M i x B㊁P C R M i x C.１．３．２．２㊀P C R反应及熔解曲线分析㊀所有试剂从６８２中国人兽共患病学报２０２１,３７(４)冰箱取出平衡至室温.P C R反应液配液标准为:取nˑ１９．７５μLP C R M i x(A/B/C)(n根据反应管数确定)和nˑ０．２５μL MT B C酶混合液加入到１．５m L 离心管中,振荡混匀数秒,然后瞬时离心,配成P C R 反应液,以每管２０μL分装于P C R反应管.用微量加样器向每个P C R反应管加入相应的D N A样品,并设阴阳性对照.采用致善S L A N９６实时P C R仪进行扩增及熔解曲线分析.反应体系设为２５μL, P C R程序设置如下:５０ħ５m i nң９５ħ１０m i nң(９５ħ１５sң５７ħ１５sң７２ħ１５s)ˑ５０个循环.熔解曲线分析程序设置如下:９５ħ１m i nң３５ħ１m i nң３５ħ~９０ħ以０．０４ħ/s的升温速率进行熔解分析,且在此阶段采集F AM㊁H E X㊁R O X和C Y５通道荧光信号.１．３．２．３㊀结果判读㊀４３个间隔序列有对应的荧光与熔点范围,实验运行结束后,分析软件根据每个样本的荧光与熔点组合,自动给出一个对应的４３位的二进制码.待测样本,按以下规则判读结果:①优先判读H E X通道的内控熔解峰(I C,４４ħ~４８ħ),如果无内控峰则判定该样品无效,即不含结核分枝杆菌基因组D N A或浓度很低达不到检测要求.②若对应的熔点范围内有熔解峰,则该间隔子存在,表示为 n ;若无熔解峰,则该间隔子缺失,表示为 o ;最后的结果按间隔序列S p１ңS p４３的顺序输出.１．３．３㊀全基因组测序分析１．３．３．１㊀全基因组测序㊀由北京诺禾致源生物有限公司完成检测,利用高通量二代I l l u m i n a测序技术平台,进行D N A片段文库构建,双端测序,P E１５０,深度至少２００X,每个样品总测序深度数据量ȡ１Gc l e a nd a t a.测序数据经过过滤处理,去除包含AＧd a p te r的序列及低质量数据,得到的C l e a nD a t a用于后续分析.１．３．３．２㊀基于全基因组序列对结核分枝杆菌分离株S p o l i g o t y i n g分析㊀将每株菌株全基因组原始数据通过p y t h o n２．７软件进行处理,再经过B l a s t n软件进行序列比对提取出４３个间隔序列,每个菌株的４３个特定间隔序列结果转化为二进制(０和１)形式输出[４].１．４㊀数据分析㊀将S p o l i g o t y i n g结果数据与S I T V I TW E B数据库进行比对,获取间隔区寡核苷酸国际型别(s p o l i g o t y p e i n t e m a t i o n a l t y p e,S I T)编号,通过P H Y L O V i Z２．０软件[５]和h t t p s://w w w．m i r uＧv n t r p l u s．o r g/M I R U/i n d e x．f a c e s网站对结果进行聚类分析并构建进化树,在h t t p s://i t o l．e m b l．d e网站对进化树进行修饰.２㊀结㊀果２．１㊀WG S和M c S p o l i g o t y i n g两种方法检测结果一致性㊀本研究有３６１株菌株通过WG S和M c S p o l iＧg o t y i n g两种方法进行结核分枝杆菌S p o l i g o t y i n g 基因分型,以WG S方法作为对比方法,M c S p o l i g oＧt y p i n g结果一致性为９４．１８％(３４０/３６１),有２１株结果不一致.３６１株菌株共检测１５５２３间隔序列,其中２１株结果不一致表现在２５个间隔序列,不一致率为０．１６％(２５/１５５２３),不一致较多间隔序列在第５间隔,有４株菌株出现２个间隔序列不一致,其余标本均为１个间隔序列不一致,具体见表１.表１㊀２１株M T B间隔序列不一致分布情况T a b．１㊀I n c o n s i s t e n t d i s t r i b u t i o no f i n t e r v a l s e q u e n c e s i n２１M T Bs t r a i n s不一致间隔序列２５６７１４１５１９２５２９３０３５３６３７３８４０４１菌株数１５２１１１１１１２１１２１２２２．２㊀９４９株MT B M c S p o l i g o t y i n g基因分型结果㊀９４９株菌株中新发现基因型为１２１株,已定义基因型为８２８株.其中已定义基因型共分为８４种基因型,主要归属于５种基因家族(B E I J I N G㊁T㊁H㊁E A I㊁L AM)和３个家系(L i n e a g e１㊁L i n e a g e２㊁L i nＧe a g e４)[６].在５种基因家族中B E I J I N G为６０．４８％(５７４/９４９)㊁T为２１．８１％(２０７/９４９)㊁H为３．６９％(３５/９４９)㊁E A I为０．９５％(９/９４９)㊁L AM为０．３３％(３/９４９),主要流行基因家族为B E I J I N G和T.在３个家系中L i n e a g e１为０．９５％(９/９４９)㊁L i n e a g e２为６０．４８％(５７４/９４９)㊁L i n e a g e４为２５．８２％(２４５/９４９)㊁未定义家系为１２．７５％(１２１/９４９).具体分型结果见表２和图１.３７５株非北京基因型和新发现基因型构建进行树及各种基因类型在聚类图中分布情况见图２.７８２４期蓝如束,等:基于P C R熔解曲线技术的结核分枝杆菌S p o l i g o t y p i n g基因分型的临床应用研究表２㊀９４９株M T B M c S p o l i g o t y p i n g 基因分型结果T a b ．２㊀M c S p o l i g o t y p i n g g e n o t y p i n g o f ９４９M T Bs t r a i n s L i n e a ge C l a d e /S u b c l a d e菌株数/株百分比/％L i n e a ge １E A I ４_V NM ５０．５３E A I ２MA N I L L A３０．３２E A I ５１０．１１L i n e a g e ２B E I J I N G ５６７５９．７４B E I J I N G _L I K E７０．７４L i n e a ge ４T １１４１１４．８５T ２４７４．９５H ３３１３．２６T ３６０．６３T ４４０．４２T １ＧT ２３０．３２T ２ＧT ３３０．３２H １３０．３２T ５２０．２１L AM ３a n dS/c o n v e r g e n t ２０．２１T ３ＧO S A １０．１１H ４１０．１１L AM ９１０．１１N E W１２１１２．７５T o t a l ９４９１００．００２．３㊀成簇性分析㊀９４９株菌株中的８２２株聚为MT B 归类于４９个簇(２~５２８株),最大一簇为B e i Ｇj i n g 家族SI T １基因型,其余的有１２７株表现为独特的基因型.主要流行簇分别为S I T １(５５．６４％,５２８/９４９)㊁S I T ５３(８．４９％,８０/９４９)㊁S I T ５２(２．２１％,２１/９４９)㊁S I T １９０(１．９０％,１８/９４９)㊁S I T ５０(１．６９％,１６/９４９)和S I T ２４９(１．５８％,１５/９４９),分属于B E I J I N G ㊁T １㊁T ２和H ３基因家族,各个簇在M c S p o l i g o t y p i n g 分型结果中占比情况具体见表３.３㊀讨㊀论间隔区寡核苷酸分型(s p o l i g o t y p i n g )是１９９５年由K a m e r b e e k J 等[７]学者提出来,基于其标准化操作程序和可数字化的结果,多年来s p o l i g o t y p i n g是研究结核分枝杆菌遗传多态性和分子流行病学一种有价值的基因分型方法[８].传统膜杂交s p o l i go Ｇt y p i n g 方法是利用PC R 方法扩增间隔序列,扩增产物与固定在杂交膜上的４３个合成的间隔序列捕获探针杂交,根据显影结果判读相应的间隔序列是否存在,进而得到菌株的基因型特征.其操作步骤多且非常繁琐,整个检测过程耗时约８h ,结果需要人工判读,容易出现样本污染和判读错误现象.近年来,不少学者提出完善传统s p o l i g o t y p i n g 的方法.H o n i s c hC 等[９]学者利用MA L D I ＧT O F M S 平台开发一种基于设计多对引物扩增,无需杂交,耗时约７h .R u e t t g e rA 等[１０]学者采用A r r a y S t r i p平台替注:图中的每个圆球及每种颜色均代表一种基因型,圆球内的数字为S I T 号;圆球的大小表示相应的基因型所含的菌株数.图１㊀９４９株M T B M c S p o l i g o t y p i n g 基因分型结果在聚类图中分布情况F i g ．１㊀D i s t r i b u t i o no fM c S p o l i g o t y p i n g g e n o t y p e s i na c l u s t e rm a p of ９４９M T Bs t r a i n s ８８２中国人兽共患病学报２０２１,３７(４)图２㊀３７５株非北京基因型和新发现基因型菌株M c S p o l i g o t y p i n g分型结果在聚类图中分布情况F i g．２㊀D i s t r i b u t i o no fM c S p o l i g o t y p i n g g e n o t y p e s i na c l u s t e rm a p o f３７５n o nＧB e i j i n g s t r a i n s a n dn e w l y d i s c o vＧe r e d g e n o t y p e s t r a i n s代尼龙膜杂交,简化了操作步骤和结果记录过程,并能自动化处理信号和数据,耗时约４h.２０１３年O c h e r e t i n aO[１１]利用L u m i n e x M a g p l e x平台在杂交过程采用磁性标记微球体,耗时约４h.这些所谓的改善方法并未简化P C R扩增后的一系列反应如杂交㊁显影等,并且要求额外的设备,增加了实验的复杂性和费用.近两年,曾小红等[１２]学者提出了一种新型的闭管检测的s p o l i g o t y p i n g方法,称之为M c s p o l i g o t yＧp i n g.M c s p o l i g o t y p i n g是利用多色探针熔解曲线分析技术,仅需一步加样操作即将D N A模板加到P C R反应管中,上机检测仅需两个多小时,分型结果由仪器自动判读.和传统s p o l i g o t y p i n g方法相比较省略了P C R扩增后的一系列操作,避免了产物易污染㊁人工判读错误等缺点.一批次可同时检测３０个样本,整个过程耗时约３h.曾小红等利用来自４个结核病临床实验室收集的１９６８份MT B样本,对M c s p o l i g o t y p i n g方法进行多地区大样本量的临床评价,评估该方法的可行性.M c s p o l i g o t y pＧi n g和传统膜杂交s p o l i g o t y p i n g分型结果一致性达９９．９３％,结果表明M c s p o l i g o t y p i n g方法可在常规实验室使用.本研究对３６１株菌株进行分型结果一致性为９４．１８％,有而间隔序列一致性为０．１６(２５/１５５２３),不一致较多间隔序列分别在第５间隔,有４株菌株出现两个间隔序列不一致,其余标本均为１个间隔序列不一致.出现不一致主要原因是间隔序列的变化会导致熔解峰转移到一个较低的T m区域,从而出现假阴性结果和/或假阳性结果.有学者报道[１２]认为几乎所有间隔序列不一致结果都是由间隔中的S N P s或插入引起的,由于间隔序列具有高度保守性,间隔序列这种改变也是比较少见.其次,P C R实验室污染也有可能导致假阳性的结果.从本次研究结果可看出,该方法检测结果不影响对结核病疫情处置和分子流行病学研究.研究发现B E I J I N G基因家族与云南(５５．７２％)相当,低于福建(６７．２３％)㊁河南(８３．５３％)㊁陕西(８６ ２１％)㊁北京(８２．００％)[１３Ｇ１７],表明B E I J I N G基因家族是我国的主要流行基因型,但地域性分布差异非常大,南方地区所占比例低于北方地区.而国家间的基因型分布差异也很大,东南亚国家[１８]主要流行E A I和C A S,欧美地区[１９]主要流行L AM和T,邻国缅甸[２０]主要流行B E I J I N G㊁E A I和L AM.９８２４期蓝如束,等:基于P C R熔解曲线技术的结核分枝杆菌S p o l i g o t y p i n g基因分型的临床应用研究表３㊀４９个簇菌株在M c S p o l i g o t y p i n g 分型结果中占比情况T a b l e ．３㊀p r o p o r t i o no f ４９c l u s t e r s t r a i n s a m o n g t h eM c S p o l i g o t y p i n g g e n o t y pes ０９２中国人兽共患病学报２０２１,３７(４)而非北京基因家族和新发现基因型占３９．５２％(３７５/９４９),这类菌株存在高度的遗传多态性(图２).非北京基因家族共有８０个基因型,其中５０个为独立基因型.同时研究发现有１２１株为新基因型,归属于８６个基因型,其中７４个为独立基因型,暂未被S p o lD B４．０数据库收录.提示广西结核分枝杆菌遗传多态性非常丰富,是研究结核病进化和传播㊁耐药基因㊁疫苗等的理想现场.本研究对成簇性进行分析,发现９４９株菌株中的８２２株聚为MT B归类于４９个簇(２~５２８株),成簇率为８６．６２％(８２２/９４９),有１２７株菌表现为独特的基因型.在成簇的基因型中,B E I J I N G基因家族占比最大,与罗丹[２１]报道的５６．９５％接近,低于北方的一些省份(８２．１８％)[２２],但仍是广西目前最主要的流行基因型,提示B E I J I N G基因家族有可能具有更强的传播力,有待进一步研究证实.在４９个簇中,大部分簇中每个簇的菌株来源相同一个地方,说明结核病传播大多数可能是近期传播造成.因此,应开展早期快速诊断和治疗,切断传播源,防止结核病疫情进一步传播.综上所述,本研究利用M c s p o l i g o t y p i n g方法对９４９株结核分枝杆菌进行基因分型.初步了解到广西地区结核分枝杆菌基因遗传分布和成簇情况,提示广西地区结核分枝杆菌存在高度的遗传多态性和结核病传播情况.M c s p o l i g o t y p i n g方法操作简单㊁耗时短㊁费用低,大部分地区均可开展,对结核病疫情以及结核病分子流行病学研究具有重要意义.(志谢:厦门大学生命科学学院许晔和曾小红博士对本研究给予了科学指导.)利益冲突:无引用本文格式:蓝如束,叶婧,罗丹,等．基于P C R熔解曲线技术的结核分枝杆菌S p o l i g o t y p i n g 基因分型的临床应用研究[J]．中国人兽共患病学报,３７(４):２８５Ｇ２９１,３３８．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０２１．００．０４５参考文献:[１]M o l i n aＧM o y aB,A g o n a f i r M,B l a n c oS,e ta l．M i c r o b e a dＧb a s e d s p o l i g o t y p i n g o f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s f r o m Z i e h lＧN e e l sＧe nＧs t a i n e dm i c r o s c o p y p r e p a r a t i o n s i nE t h i o p i a[J]．S c i e n t i f i cR eＧp o r t s,２０１８,８(１):３９８７．D O I:１０．１０３８/s４１５９８Ｇ０１８Ｇ２２０７１Ｇ９[２]G a r cíaD eV i e d m aD,Pér e zＧL a g oL．T h e e v o l u t i o n o f g e n o t y p i n g s t r a t e g i e s t od e t e c t,a n a l y z e,a n dc o n t r o l t r a n s m i s s i o no f t u b e rＧc u l o s i s[J]．M i c r o b i o l S p e c t r,２０１８,６(５):２２９．D O I:１０．１１２８/m iＧc r o b i o l s p e c．M T B PＧ０００２Ｇ２０１６[３]D eA l m e i d a I N,D a S i l v aC a r v a l h oW,R o s s e t t iM L,e t a l．E v a l u aＧt i o no fs i xd i f f e r e n tD N A e x t r a c t i o n m e t h o d sf o rd e t e c t i o no f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s b y m e a n so fP C RＧI S６１１０:p r e l i m iＧn a r y s t u d y[J]．B M C R e sN o t e s,２０１３,６:５６１．D O I:１０．１１８６/１７５６Ｇ０５００Ｇ６Ｇ５６１[４]X i aE,T e oY Y,O n g R T．S p o T y p i n g:f a s t a n da c c u r a t e i ns i l i c o M y c o b a c t e r i u ms p o l i g o t y p i n g f r o ms e q u e n c e r e a d s[J]．G e n o m e M e d,２０１６,８:１９．D O I:１０．１１８６/s１３０７３Ｇ０１６Ｇ０２７０Ｇ７[５]N a s c i m e n t o M,S o u s a A,R a m i r e z M,e ta l．P H Y L O V i Z２．０: p r o v i d i n g s c a l a b l e d a t a i n t e g r a t i o na n dv i s u a l i z a t i o n f o rm u l t i p l e p h y l o g e n e t i ci n f e r e n c e m e t h o d s[J]．B i o i n f o r m a t i c s,２０１７,３３(１):１２８Ｇ１２９．D O I:１０．１０９３/b i o i n f o r m a t i c s/b t w５８２[６]B l o u i nY,H a u c kY,S o l e rC,e t a l．S i g n i f i c a n c eo f t h e i d e n t i f i c aＧt i o ni nt h e H o r no fA f r i c ao fa ne x c e p t i o n a l l y d e e p b r a n c h i n g M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s c l a d e[J]．P L o SO n e,２０１２,７(１２): e５２８４１．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．００５２８４１[７]K a m e r b e e kJ,S c h o u l sL,K o l k A,e ta l．S i m u l t a n e o u sd e t e c t i o n a n d s t r a i nd i f f e r e n t i a t i o no f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s f o rd iＧa g n o s i s a n d e p i d e m i o l o g y[J]．J C l i nM i c r o b i o l,１９９７,３５(４):９０７Ｇ９１４．D O I:１０．１１２８/J C M．３５．４．９０７Ｇ９１４．１９９７[８]V a s c o n c e l l o sS E,A c o s t aC C,G o m e sL L,e t a l．S t r a i nc l a s s i f i c aＧt i o no f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s i s o l a t e s i nB r a z i lb a s e do n g e n o t y p e s o b t a i n e d b y s p o l i g o t y p i n g,m y c o b a c t e r i a l i n t e r s p e r s e d r e p e t i t i v e u n i t t y p i n g a n d t h e p r e s e n c e o f l a r g e s e q u e n c e a n d s i nＧg l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m[J]．P L o S O n e,２０１４,９(１０): e１０７７４７．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．０１０７７４７[９]H o n i s c hC,M o s k oM,A r n o l dC,e t a l．R e p l a c i n g r e v e r s e l i n e b l o t h y b r i d i z a t i o ns p o l i g o t y p i n g o ft h e M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c o m p l e x[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１０,４８(５):１５２０Ｇ１５２６．D O I:１０．１１２８/J C M．０２２９９Ｇ０９[１０]R u e t t g e rA,N i e t e r J,S k r y p n y kA,e t a l．R a p i ds p o l i g o t y p i n g o f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s c o m p l e xb a c t e r i ab y u s eo fa m iＧc r o a r r a y s y s t e m w i t h a u t o m a t i c d a t a p r o c e s s i n g a n d a s s i g n m e n t[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１２,５０(７):２４９２Ｇ２４９５．D O I:１０．１１２８/ J C M．００４４２Ｇ１２[１１]O c h e r e t i n aO,M e r v e i l l eYM,M a b o uMM,e t a l．U s e o f L u m i n e x M a g P l e xm a g n e t i cm i c r o s p h e r e s f o r h i g hＧt h r o u g h p u t s p o l i g o t yＧp i n g o f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s i s o l a t e s i nP o r tＧa uＧP r i n c e,H a i t i[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２０１３,５１(７):２２３２Ｇ２２３７．D O I:１０．１１２８/J C M．００２６８Ｇ１３[１２]Z e n g X,X uY,Z h o uY,e t a l．M c S p o l i g o t y p i n g,ao n eＧs t e p m e l tＧi n g c u r v e a n a l y s i sＧb a s e d p r o t o c o l f o r s p o l i g o t y p i n g o f M y c o b a cＧt e r i u mt u b e r c u l o s i s[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２０１８,５６(８):u n d eＧf i n e d．D O I:１０．１１２８/J C M．００５３９Ｇ１８[１３]石洁,郑丹薇,朱岩昆,等．河南省结核分枝杆菌M I R UＧV N T R 和间隔区寡核苷酸分型分析[J]．郑州大学学报(医学版),２０１９,５４(３):４２５Ｇ４３０．D O I:１０．１３３５０/j．c j p b．１８１２０３[１４]杜永成,魏淑贞,赵永,等．福建省耐多药结核分枝杆菌V N T R 和S p o l i l g o t y p i n g基因多态性分析[J]．中国病原生物学杂志,２０１８,１３(１２):１３１０Ｇ１３１３．D O I:１０．１３７０５/j．i s s n．１６７１Ｇ６８２５．２０１８．０９．１３１(下转第３３８页)１９２４期蓝如束,等:基于P C R熔解曲线技术的结核分枝杆菌S p o l i g o t y p i n g基因分型的临床应用研究图８㊀２０１９年广州市甲型H１N１流感分离株N S基因遗传进化树F i g．８㊀G e n e t i c e v o l u t i o na n a l y s i s o fN S g e n e s f r o mn o v e l i n f l u e n z aA(H１N１)p d m０９i s oＧl a t e s i nG u a n g z h o u i n２０１９２．４㊀全基因分子特征分析㊀H A蛋白抗原位点分析结果显示,与２０２０－２０２１年疫苗推荐株A/ G u a n g d o n gＧM a o n a n/１５３６/２０１９(H１N１)相比,０１３３６㊁０４１６３㊁０４１７１分离株发生I２０２T变异,１４１３０㊁１４１３７㊁３０３９０分离株发生D２０４A变异.大部分毒株H A蛋白有７个糖基化位点,０４１７１分离株发生１０４ＧN G T糖基化位点缺失.在N A蛋白神经氨酸酶抑制剂耐药位点上,所有分离株未发生耐药突变.根据全基因进化树结果显示,A/G u a n g z h o u/００６６１/２０１９(H１N１)㊁A/G u a n g z h o u/１４１３０/２０１９(H１N１)㊁A/G u a n g z h o u/１４１３７/２０１９(H１N１)和A/G u a n g z h o u/３０３０９/２０１９(H１N１)毒株全基因片段均与我国２０２０－２０２１年疫苗推荐株A/G u a n gＧd o n gＧM a o n a n/１５３６/２０１９(H１N１)归属同一进化分支,对上述４株分离株毒株全基因氨基酸位点与另３株分离株进行变异分析,结果显示,除P A㊁M１㊁M２和N S２蛋白外,其余蛋白均有不同数量的相同特异性氨基酸突变,见表３.同时对两株流感疫情分离株A/G u a n g z h o u/１４１３０/２０１９(H１N１)和A/ G u a n g z h o u/１４１３７/２０１９(H１N１)进行全基因氨基酸变异位点特异性分析显示,两毒株具有H AＧK１８８E㊁N AＧI４０T㊁P B１ＧM６４６L㊁N S１ＧI１４５V等共同的氨基酸变异位点.３㊀讨㊀论自２０１７年开始,WHO推荐北半球使用的３株H１N１疫苗株(A/M i c h i g a n/４５/２０１５(H１N１)(２０１７－２０１９)㊁A/B r i s b a n e/０２/２０１８(H１N１)(２０１９－表３㊀同分支分离株基因组特异性氨基酸变异分析T a b．３㊀A n a l y s i s o f g e n o m e s p e c i f i c a m i n o a c i d v a r i a t i o n si nh o m o c l a d i s t i c i s o l a t e s疫苗株同分支分离株①A/G u a n g d o n gＧM a o n a n/１５３６/２０１９(H１N１)００６６１１４１３０１４１３７３０３０９HA N１４６D,T２０２IN A F７４S,T４５２IP B２T８１I,G２２５S,V６６７IP B１V２００I,K３８６RP A－N P V４２５IM１－M２－N S１T８０A,A１５５TN S２－㊀㊀①T h ea m i n oa c i d m u t a t i o n so f００６６１,１４１３０,１４１３７a n d３０３０９i s o l a t e s,w h i c hb e l o n g e d t o t h e s a m e c l a d e,w e r e c o m p a r e dw i t h t h o s e o f０１３３６,０４１６３a n d０４１７１i s o l a t e s．２０２０)㊁A/G u a n g d o n g－M a o n a n/１５３６/２０１９(H１N１) (２０２０－２０２１))亲缘关系较近,遗传进化上不断进化,２０２０－２０２１年疫苗株与２０１９年６月之后的流行株在全基因组上位于同一遗传进化簇上,提示２０２０年下半年启动使用的疫苗株与流行株匹配性较好.但该分支中００６６１毒株分离于２０１９年１月,说明广州地区甲型H１N１流感病毒流行的复杂性,不排除较早期流行株与近期流行株共同流行的情况,进而存在病毒重配风险,因此及时监测流行的变８２３中国人兽共患病学报２０２１,３７(４)。

Spoligotyping和MLVA用于71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株基因分型的初步研究王晓萌;吕冰;柳正卫;刘洁;何海波;蒋毅;张媛媛;董海燕;刘志广;赵秀芹;万康林【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2008(24)12【摘要】目的初步探讨寡核苷酸分型(Spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(MLVA)用于浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株的分型,以初步了解浙江省结核分枝杆菌的基因型特征.方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株,常规培养,收集菌体,提取基因组DNA.采用聚合酶链反应(PCR)扩增整个DR区进行Spoligotyping分型,同时分别扩增15个VNTR位点进行MLVA分型.聚类分析采用BioNumerics 软件.统计学分析采用卡方检验.结果对70株菌进行了基因分型,Spoligotyping结果显示,可分为2个基因群,即北京家族 (Beijing family)和非北京家族(Non-Beijing family),分别占70%和30%,49株北京家族菌株中,89.8%为典型北京家族;MLVA结果显示,可分4个基因群,分别为Ⅰ群占8.5%,含5个基因型,Ⅱ群占18.3%,含13个基因型,Ⅲ群占70.4%,含38个基因型,Ⅳ群占2.8%,含2个基因型.两种方法对菌株的基因分型结果非常吻合,Spoligotyping分型为北京家族的菌株均分布在MLVA Ⅲ型中,非北京家族菌株的基因多态性,分属于MLVAⅠ、Ⅱ和Ⅳ型.MLVA将70株菌分为58个基因型(含53个独特基因型),而Spoligotyping只分为18种基因型(含12个独特基因型).结合对临床一线4种药物的耐药检测结果分析,两种方法的分型结果均显示北京家族菌株中表现为全敏感者71.4% (35/49),表现为耐药者为28.6%(14/49);而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66.7%,表现为耐药者为33.3%,经卡方检验,两者间的差异无统计学意义(χ2=0.158,P>0.05).结论初步证实浙江省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为北京家族.北京家族与耐药无明显相关性.MLVA株水平鉴定能力明显高于Spoligotyping, 尤其是在鉴别北京家族菌株上具有明显的优势.【总页数】5页(P1090-1094)【作者】王晓萌;吕冰;柳正卫;刘洁;何海波;蒋毅;张媛媛;董海燕;刘志广;赵秀芹;万康林【作者单位】浙江省疾病预防控制中心;传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;浙江省疾病预防控制中心;传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;浙江省疾病预防控制中心;传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;传染病预防控制国家重点实验室,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206【正文语种】中文【中图分类】R378【相关文献】1.安徽省391株结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究 [J], 王庆;董海燕;包训迪;赵秀芹;徐东芳;万康林2.MLVA技术用于福建105株结核分枝杆菌基因分型的初步研究 [J], 蒋毅;张丽水;赵秀芹;黄明翔;刘志广;王琳;董海燕;万康林3.Spoligotyping对广西地区208株结核分枝杆菌临床分离株的基因分型 [J], 刘飞鹰;刘志广;王喜文;赵秀琴;董海燕;刘洁;吕冰;董柏青;万康林4.70株浙江省结核分枝杆菌临床分离株Spoligotyping基因分型研究 [J], 王晓萌;刘志广;柳正卫;刘洁;赵秀芹;张媛媛;吕冰;万康林5.71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究 [J], 柳正卫;吕冰;王晓萌;董海燕;何海波;赵秀芹;万康林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。