液相色谱_串联质谱法测定焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的含量
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液相色谱－串联质谱法测定焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的含量章宇１焦晶晶１张英１黄百芬２任一平２（１浙江大学生物系统工程与食品科学学院杭州３１００２９２浙江省疾病预防控制中心杭州３１０００９）摘要建立了一种液相色谱－电喷雾同位素稀释串联质谱方法，并对焙烤和油炸食品中的丙烯酰胺进行定量分析。
方法包括用石油醚脱脂、ＮａＣｌ溶液提取、乙酸乙酯萃取和ＯＡＳＩＳＨＬＢ固相萃取柱纯化。
采用ＡｔｌａｎｔｉｓｄＣ１８柱（５μｍ，１５０ｍｍ×２．１ｍｍ），以０．１％甲酸和甲醇（体积比９０∶１０）为流动相洗脱，并经过精密度、重现性和加标回收率等实验得到了验证。
采用该方法测得焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的含量分别在１１．１～７３３．９ｍｇ／ｋｇ和１３６．７～５２６９．２ｍｇ／ｋｇ之间。
该方法适用于其它类食品中丙烯酰胺的测定，由于其灵敏度高、重现性好，因此同样适合于痕量分析。
关键词液相色谱－串联质谱法焙烤食品油炸食品丙烯酰胺文章编号１００９－７８４８（２００７）０１－０１３１－０７丙烯酰胺（其分子结构式见图１）是一种白色晶体，溶于水、乙醇、甲醇、二甲醚、丙酮等，但不溶于非极性溶剂如庚烷和苯。
它的α，β－不饱和氨基系统非常容易与亲核物质（例如蛋白质中半胱氨酸的巯基）通过迈克尔加成（Ｍｉｃｈａｅｌａｄｄｉｔｉｏｎ）发生化学反应，从而影响蛋白质的正常功能而致病［１］。
由于丙烯酰胺具有潜在的神经毒性［２］、遗传毒性［３］和致癌性［４］，因此食品中丙烯酰胺的污染引起了国际社会和各国政府的高度关注。
ＦＡＯ和ＷＨＯ联合食品添加剂专家委员会（ＪＥＣＦＡ）第６４次会议根据近两年来的新资料，对食品中的丙烯酰胺进行了系统的危险性评估，并于２００５年２月发布预警，警告公众关注食品中的丙烯酰胺，以确保食品的安全性［５］。
早在２０世纪９０年代初，研究者已经开始采用高效液相或气相色谱的方法来测定食糖［６］、田间作物［７］和蘑菇［８］中丙烯酰胺的含量，但其灵敏度无法满足痕量分析的需要。
自从Ｒｏｓéｎ和Ｈｅｌｌｅｎ%ｓ［９］首次采用液－质联用法（ＬＣ－ＭＳ）测定丙烯酰胺并探讨了丙烯酰胺的质谱解离方式以来，质谱日益成为备受推崇的分析方法［１０￣１２］。
焙烤和油炸食品是深受我国居民喜欢的传统食品，目前国内还很少有采用质谱手段来测定食品中丙烯酰胺的相关报道，因此，建立一种食品中丙烯酰胺的质谱检测方法具有重要的意义。
本研究建立了利用液相色谱－电喷雾串联质谱（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）技术测定丙烯酰胺的方法，该方法灵敏、准确，重现性好，适合于焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的测定。
１实验部分１．１仪器、试剂和样品Ｗａｔｅｒｓ２６９５高效液相色谱仪，美国Ｗａｔｅｒｓ公司，包括四元泵、真空脱气机、自动进样器、恒温柱箱；ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏＵｌｔｉｍａ四极杆串联质谱仪，英国Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ公司；ＯＡＳＩＳＨＬＢ６ｃｃ固相萃取柱（２００ｍｇ）购自Ｗａｔｅｒｓ公司；丙烯酰胺标准品购自Ｓｉｇｍａ公司；１３Ｃ３－丙烯酰胺同位素购自剑桥大学同位素实验室；超纯水用法国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司收稿日期：２００６－０２－２１基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３０５４００１６）作者简介：章宇，男，１９８０年出生，博士生通讯作者：任一平ＯＣＨ２Ｈ２Ｎ相对分子质量：７１．０９化学式：ＣＨ２ＣＨＣＯＮＨ２熔点：８７．５°Ｃ沸点：１２５°Ｃ图１丙烯酰胺的分子结构和物理性质Ｆｉｇ．１ＭｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆａｃｒｙｌａｍｉｄｅＶｏｌ．７Ｎｏ．１Ｆｅｂ．２００７ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中国食品学报第７卷第１期２００７年２月中国食品学报２００７年第１期的Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水纯化系统制备；甲酸、乙酸乙酯和甲醇均为色谱纯；其它化学试剂为分析纯。
各种焙烤和油炸食品均购自自选超市。
１．２样品预处理称取适量经研磨粉碎后的样品，置于５０ｍＬ离心管中，加入１μｇ／ｍＬ１３Ｃ３－丙烯酰胺的甲醇内标液５００μＬ，静置１０ｍｉｎ，加入２０ｍＬ重蒸石油醚，充分混匀并超声振荡１０ｍｉｎ，取出后弃去石油醚层，重复上述石油醚脱脂过程１次。
向脱脂后的样品中加入８ｍＬ蒸馏水，充分混匀并超声振荡２０ｍｉｎ，取出后以１５０００ｒ／ｍｉｎ的转速离心１５ｍｉｎ，将上层清液转移至分液漏斗中，向样品中再次加入７ｍＬ蒸馏水，重复上述提取过程，并将离心后的上层清液与前次样液合并至分液漏斗中，混匀，备用。
在上述样液中加入乙酸乙酯充分萃取３次（１５ｍＬ×３），将乙酸乙酯层合并至圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，在（５０±１）°Ｃ水浴中减压浓缩至约１ｍＬ，将浓缩液转移至１０ｍＬ试管中，在圆底烧瓶中加入少量乙酸乙酯充分洗涤，将洗涤液合并至试管中，（５０±１）°Ｃ氮气吹干，加入１．５ｍＬ蒸馏水重溶并涡流混合，备用。
ＯＡＳＩＳＨＬＢ（６ｃｍ３／２００ｍｇ）固相萃取柱事先用３ｍＬ甲醇活化和３ｍＬ蒸馏水平衡，吸取上述１．５ｍＬ重溶样液通过ＯＡＳＩＳＨＬＢ固相萃取柱，然后用３ｍＬ蒸馏水洗脱并收集该洗脱液，进样分析。
固相萃取柱用适量甲醇反复冲洗，并用蒸馏水平衡处理。
１．３ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ测定条件色谱条件：色谱柱为ＡｔｌａｎｔｉｓＴＭｄＣ１８（５μｍ，１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）；流动相Ａ为０．１％甲酸，流动相Ｂ为甲醇，Ｖ（Ａ）∶Ｖ（Ｂ）＝９０∶１０；流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ，柱温２５℃，进样量１０μＬ。
质谱条件：ＥＳＩ＋模式，毛细管电压３．５０ｋＶ；锥孔电压５０Ｖ，源温１００℃，脱溶剂温度３５０℃；ＭＲＭ方式定量，丙烯酰胺（７２＞５５），１３Ｃ３－丙烯酰胺（７５＞５８）；碰撞能量均为６ｅＶ。
２结果与讨论２．１色谱条件与样品预处理方法的优化２．１．１电喷雾串联质谱条件的优化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ在以ＭＲＭ方式定量时灵敏度高，重现性好。
在以ＭＲＭ方式对丙烯酰胺进行定量分析时，碰撞能量的选择至关重要。
丙烯酰胺的质谱解离方式如图２所示。
通过预实验发现，子离子ｍ／ｚ５５是母离子（ｍ／ｚ７２）通过脱氨（ＮＨ３）得到的，具有较高的相对丰度，当碰撞能量达到６ｅＶ时达到最大值，而其它子离子ｍ／ｚ５４、ｍ／ｚ４４、ｍ／ｚ２７则需要更高的碰撞能量才能达到最大值，因此选择ｍ／ｚ５５作为定量离子。
同理，选择ｍ／ｚ５８作为１３Ｃ３－丙烯酰胺的定量离子。
另外，在流动相Ａ中添加体积分数０．１％的甲酸，其目的是改善质谱的离子化效率，提高质谱检测的灵敏度［１３］。
１３２第７卷第１期２．１．２液相条件的优化丙烯酰胺属于强极性化合物，因此在进行色谱分离时柱型的选择至关重要。
ＡｔｌａｎｔｉｓＴＭｄＣ１８色谱柱因其特殊的固定相材料而同时适用于极性与非极性化合物的分离。
Ｏｎｏ等［１４］采用该柱对丙烯酰胺进行了反相色谱的分离，由于其良好的保留性，降低了杂质对丙烯酰胺的出峰干扰，因此，本实验以ＡｔｌａｎｔｉｓＴＭｄＣ１８为色谱柱，比较了不同流动相配比对丙烯酰胺出峰影响的色谱图（见图３）。
从保留时间和响应面积综合考虑，选择１０％甲醇作流动相，丙烯酰胺的出峰效果最好。
另外，标准品和样品的进样时间均为１０ｍｉｎ，其中丙烯酰胺的保留时间为（３．３±０．１）ｍｉｎ。
１００％０１．００２．００３．００４．００５．００保留时间／ｍｉｎ注：甲醇在流动相中的比例分别为：１．１％；２．２％；３．５％；４．１０％；５．１５％；６．２０％；７．２５％；８．３０％；９．４０％；１０．５０％；１１．６０％；１２．８０％；１３．１００％１３１２１１１０９８７６５５３２１图３不同流动相配比对丙烯酰胺出峰影响的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ色谱图Ｆｉｇ．３ＬＣ－ＭＳ／ＭＳｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｎｅｌｕｔｉｏｎｏｆａｃｒｙｌａｍｉｄｅｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏｓｏｆｍｅｔｈａｎｏｌａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ２．１．３萃取方法的优化本研究样品预处理的两个关键因素是提高丙烯酰胺的回收率和减少杂质干扰，而这主要取决于液－液萃取和固相萃取的条件优化［１０］。
在液－液萃取方面，通过实验发现乙酸乙酯可以很好地将水相中的丙烯酰胺萃取出来，使用乙酸乙酯萃取３次（每次为等体积萃取），可使萃取效率达到９０％以上。
在固相萃取方面，本实验曾经尝试用ＶａｒｉａｎＢｏｎｄＥｌｕｔ－Ｃ１８（１ｃｍ３／１００ｍｇ和３ｃｍ３／５００ｍｇ）及ＯａｓｉｓＨＬＢ（３ｃｍ３／６０ｍｇ和６ｃｍ３／２００ｍｇ）４种固相萃取柱，并测定相应的回收率，结果发现，由于ＶａｒｉａｎＢｏｎｄＥｌｕｔ－Ｃ１８柱的固定相极性偏弱，使得丙烯酰胺不易在该类型的柱上保留；对于ＯａｓｉｓＨＬＢ（３ｃｍ３／６０ｍｇ）小规格柱，由于填料量少，丙烯酰胺难以全部保留而易被洗脱，很难提高预处理过程的回收率。
然而，ＯａｓｉｓＨＬＢ（６ｃｍ３／２００ｍｇ）柱具有很好的吸附性，当丙烯酰胺水溶液的含量为０．５、２５、１００ｎｇ／ｍＬ时，丙烯酰胺的回收率可分别达到（９０．３±２．８）％、（９７．５±０．４）％和（９８．１±５．２）％，因此该型号柱适合于不同浓度样品提取液的固相萃取需要。
液相色谱－串联质谱法测定焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的含量１３３中国食品学报２００７年第１期２．２方法学验证２．２．１线性关系的考察称取丙烯酰胺标准品１０ｍｇ，用超纯水配制成１００μｇ／ｍＬ的标准溶液；吸取１３Ｃ３－丙烯酰胺原液１ｍＬ，用甲醇配制成１００μｇ／ｍＬ的内标溶液。
适量吸取上述两种溶液，配制成标样质量浓度分别为１、５、１０、５０、１００、１５０、２００ｎｇ／ｍＬ的溶液；内标浓度均为５０ｎｇ／ｍＬ的溶液，依次取１０μＬ进样，用ＭａｓｓＬｙｎｘｖ４．０软件计算峰面积并绘制标准曲线（ｙ＝０．７５４４２１ｘ－０．００９９５６８８，ｒ＝０．９９９９４，Ｒ２＝０．９９９８８１），内标法定量，标准曲线及相关系数如图４所示。
２．２．２精密度及稳定性实验以１、５０、２００ｎｇ／ｍＬ的标准溶液分别代表低、中、高浓度，各浓度溶液分别连续进样６次，计算得到３个浓度测定的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为５．４％、１．１％和０．５％。
取有代表性受试样品２份，按１．２节进行样品预处理后于１ｄ内的６个不同时段作进样分析；同时，分５ｄ连续测定，取平均值并计算ＲＳＤ值。
两种代表性样品中，薯片的日内和日间差ＲＳＤ分别为２．５％和３．５％，蛋糕的日内和日间差ＲＳＤ分别为１．６％和１．９％。
２．２．３最低检测限和加标回收率实验取低浓度丙烯酰胺标准溶液，用超纯水逐级稀释并进样测定，以信噪比（Ｓ／Ｎ）等于３为基准，测得该条件下丙烯酰胺的最低检测限（ＬＯＤ）为０．１ｎｇ／ｍＬ。
