土壤微生物生物量测定方法及其应用

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。

近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。

由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。

测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。

熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。

Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol·L-1K2SO4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。

Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol·L-1K2SO4提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数KEC(取值0.38)来计算土壤微生物碳。

Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。

该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。

林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。

对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数KEC的取值，有很多研究进行了大量的研究。

测定KEC值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

2 土壤微生物量测定土壤微生物量（MB）是指土壤中体积小于5x103叩3的生物总量，但活的植物体如植物根系等不包括在内］。

它通过调控土壤中能量和养分循环以及有机物转化，来反映土壤同化和矿化能力。

土壤微生物生物量包括土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量磷和土壤微生物生物量硫，但一般情况下土壤微生物生物量的大小以土壤微生物生物量碳来表示。

2.1熏蒸浸提法2.1.1原理利用不同的浸提剂，通过氧化滴定法来测定土壤浸提液中有机C、N和P提取的可溶性有机碳含量和微生物量C之间存在较稳定的比例关系。

2.1.2则定步骤1.根据土壤样品含水量，调节土壤含水量为田间持水量的50%，25 ℃下密封培养10 d，以保持土壤均匀和不同地方所得结果的可比性。

2.氯仿熏蒸24 h后，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。

根据所测对象不同选择不同的提取剂浸提，振荡浸提30 min后，立即分析浸提液中所测对象的含量或放入-15 ℃下保存。

表1指出氯仿熏蒸浸提法测定不同土壤微生物量所选用的浸提剂及其条件。

表1姓熏薪髓喉土就生帽条件Table I F'E fcrdieneasuirm aitcondiocnsof soilm riobialbmass土情即鄢Detemiia血cfhdicaMr Eitatnt土觥生醯K(=D,3S 或D.45土觥物1小K国加士躺蜘M恻般注®拓牖腌雄魂航觥刎楠融脑机装痴螭定雕耐帕帆小麒眼3 土壤酶活性测定土壤酶活性均用风干土壤。

土壤转化酶活性和过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性依次用硫代硫酸钠滴定法、高锰酸钾滴定法、靛酚蓝比色法和磷酸苯二钠比色法测定（关松荫,1986）3.1脲酶一一靛酚蓝比色法脲酶的活性可以用来表示土壤供氮能力（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。

常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。

滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。

滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。

通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。

薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。

这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。

电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。

这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。

2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。

常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。

ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。

微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。

细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。

微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。

氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。

微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。

3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。

常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。

引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。

土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。

配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。

待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。

（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。

（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。

要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。

值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。

（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。

土壤微生物生物量的测定方法汇总操作步骤：1.准备工作：采集土壤样品，并将土壤样品分为适量的小样品。

2.氯仿熏蒸：将一定量的小样品放入氯仿熏蒸瓶中，然后加入适量的氯仿，并快速将瓶口封紧。

3.震荡：用震荡器对氯仿与土壤样品进行充分的混合震荡，使氯仿充分与土壤样品接触。

4.放置：将瓶子放置在室温下静置一段时间，一般为24小时，使土壤样品中的微生物充分溶解到氯仿中。

5.分液：将上清液和沉淀物分离。

上清液中含有溶解在氯仿中的微生物细胞，沉淀物中含有没有溶解的土壤颗粒和其他杂质。

6.校验：对上清液进行校验，可以采用PFLA（没有悬浮杂质时的上清液）或PFLA-Na2CO3（有悬浮杂质时的上清液）校验液。

7.测定：将校验液填入比色皿中，使用分光光度计对比色皿中的液体进行测定，并记录吸光度值。

原理：氯仿熏蒸法通过将土壤样品与氯仿混合，可以将土壤中的微生物细胞全部溶解到氯仿中。

通过将溶解在氯仿中的微生物细胞与校验液比色，在分光光度计上测定吸光度值，从而确定土壤中微生物的生物量。

氯仿熏蒸法的优点：1.操作简单，不需要复杂的设备和技术支持。

2.适用于各种类型的土壤，包括砂土、壤土、黏土等。

3.测定结果可靠，具有较高的重复性和准确性。

氯仿熏蒸法的缺点：1.只能测定细菌和放线菌等氧气需氧微生物，不能测定厌氧微生物的生物量。

2.氯仿对环境和人体有一定的毒性和危险性，操作时需要注意安全。

总结：氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物生物量的方法。

通过将土壤样品与氯仿混合，将微生物细胞溶解到氯仿中，然后通过比色法测定吸光度值，从而确定土壤中微生物的生物量。

氯仿熏蒸法操作简单，适用于各种类型的土壤，且结果可靠。

但需要注意操作时的安全性。

除了氯仿熏蒸法外，还有其他一些方法也可用于测定土壤微生物生物量，如酚酸法、磷酸化氧化法等，可以根据实际需求选择合适的方法进行测定。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

一种土壤微生物生物量磷的测定方法与流程土壤微生物生物量磷是评估土壤肥力和生态系统中磷循环的重要指标。

本文将介绍一种测定土壤微生物生物量磷的方法及其操作流程，以期为土壤学研究及相关领域提供参考。

一、测定方法概述土壤微生物生物量磷（Microbial Biomass Phosphorus, MBP）的测定通常采用化学提取法，结合磷的测定手段，来评估土壤中微生物生物量磷的含量。

本文介绍的方法为氯仿熏蒸法，该法能够有效提取土壤微生物生物量磷，并结合紫外分光光度法或其它磷测定方法进行定量分析。

二、测定流程1.土壤样品的采集与预处理（1）在研究区域内选择具有代表性的土壤采样点。

（2）使用不锈钢或玻璃采样器采集表层土壤（0-20cm）。

（3）将采集的土壤样品混合均匀，去除植物残体和石头等杂质。

（4）将土壤样品分成两份，一份用于测定土壤微生物生物量磷，另一份用于测定土壤全磷。

2.氯仿熏蒸（1）将预处理后的土壤样品放入干燥器中。

（2）将干燥器内的氯仿蒸汽浓度调节至5%，熏蒸24小时。

（3）熏蒸过程中，保持干燥器内温度恒定，避免氯仿蒸汽浓度下降。

3.土壤微生物生物量磷的提取（1）熏蒸后的土壤样品取出，立即加入100mL 0.5mol/L NaHCO3溶液。

（2）将提取液在恒温振荡器中振荡1小时，以充分提取土壤微生物生物量磷。

（3）提取液过滤，收集滤液，用于后续磷的测定。

4.土壤全磷的测定（1）将另一份预处理后的土壤样品进行消解。

（2）消解后的样品采用磷的测定方法（如紫外分光光度法）进行全磷含量的测定。

5.土壤微生物生物量磷的计算（1）根据熏蒸前后土壤样品中磷的差值，计算土壤微生物生物量磷的含量。

（2）土壤微生物生物量磷的含量= 熏蒸后土壤样品中磷的浓度- 熏蒸前土壤样品中磷的浓度。

三、注意事项1.在操作过程中，避免氯仿蒸汽对人体造成危害，应在通风柜中进行。

2.提取液的选择和浓度应根据土壤类型进行调整。

3.消解过程中，注意温度控制，避免样品损失。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物数量的测定方法土壤微生物数量的测定方法是指用来确定土壤中微生物的数量的一系列方法。

微生物在土壤中的数量是影响土壤肥力、健康状态以及生物多样性的主要因素，所以对土壤微生物数量的测定十分重要。

目前，有几种常用的测定土壤微生物数量的方法，包括计数法、分子生物学方法和非分子生物学方法。

一、计数法计数法是目前最常用的测定土壤微生物数量的方法。

该方法通过对样本中的细胞进行数目和形态的观察，来获得关于微生物数量的信息，然后通过计算微生物数量来估计土壤微生物总数。

1. 总体计数法总体计数法是使用显微镜观察和计数样品中的微生物，把检测到的微生物总数乘以一定的系数，就可以估算出土壤中的总微生物数量。

该方法是实时性强，耗时少，易于操作，但是由于细胞大小不一，活性差异大，难以检测到的微生物会影响准确性，因此不能精确测定土壤中的微生物数量。

2. 半定量计数法半定量计数法是通过将土壤样品进行细胞悬液制备，然后用显微镜观察和计数，来估算土壤中的微生物总数。

该方法也是实时性强，耗时少，易于操作，但是由于细胞大小不一，活性差异大，难以检测到的微生物会影响准确性，因此也不能精确测定土壤中的微生物数量。

二、分子生物学方法分子生物学方法是指使用基于DNA或RNA的技术来测定土壤中的微生物数量的方法。

目前，常用的分子生物学方法有PCR方法、qPCR方法、FISH方法、DGGE方法和pyrosequencing方法。

1. PCR方法 PCR方法是使用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术来检测土壤中的微生物数量的方法。

PCR方法可以快速检测出土壤中的微生物，但它不能检测出细菌的种类。

2. qPCR方法 qPCR方法是使用定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）技术来检测土壤中的微生物数量的方法。

qPCR技术可以检测出微生物的种类，并且可以准确测定土壤中的微生物数量。

土壤微生物生物量的测定方法土壤微生物生物量是衡量土壤生态系统功能的重要指标之一、测定土壤微生物生物量可以帮助我们了解土壤生态系统的活跃度和健康状况，进而指导土壤环境修复以及农田生产管理。

氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物生物量的方法，本文将对该方法进行详细介绍。

首先，介绍氯仿熏蒸法的原理。

氯仿是一种广谱杀菌剂，可以破坏土壤中的微生物细胞膜，使微生物失去活性。

在测定土壤微生物生物量时，将土壤样品放置在含有适量氯仿的密闭容器中，通过熏蒸的方式杀灭土壤中的活性微生物。

熏蒸时间通常为24小时。

然后，通过测定氯仿熏蒸前后土壤中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。

其次，介绍氯仿熏蒸法的操作步骤。

首先，将采集到的土壤样品通过筛网筛选除去杂质。

然后，将土壤样品平均分配到已预先称量好的量筒中。

每个量筒中的土壤样品重量应保持一致。

为了保证测定的准确性，通常会设置重复样品。

接下来，在密闭容器的底部放置氟化钾和含有适量氯仿的吸附剂。

然后，将装有土壤样品的量筒设置在容器的顶部，将密闭容器封闭并在室内温度下进行熏蒸。

熏蒸时间通常为24小时。

熏蒸结束后，取出含有氯仿的吸附剂，并将土壤样品离心以去除残余的溶液。

最后，用适量的蒸馏水冲洗残留在土壤样品中的溶解态氮，并测定冲洗液中溶解态氮的浓度。

最后，介绍氯仿熏蒸法的数据分析和结果解释。

首先，通过测定熏蒸前后土壤样品中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。

常用的计算公式为：其中，溶液体积为冲洗液的体积，土壤样品质量即为放置在量筒中土壤样品的质量。

通过计算，可以得出土壤微生物生物量的结果。

根据测定结果，我们能够了解土壤微生物的数量和活性程度。

较高的土壤微生物生物量通常表示土壤中的微生物丰富多样且活跃，土壤生态系统功能较好。

而较低的土壤微生物生物量则提示土壤中微生物数量和活性较低，土壤生态系统功能受到一定程度的抑制。

因此，通过氯仿熏蒸法测定土壤微生物生物量，可以为土壤环境修复和农田生产管理提供科学依据。

土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。

土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N 、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。

测定指标：1、土壤微生物量(MierobialBiomass ，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um 3的生物总量。

它与土壤有机质含量密切相关。

目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO 2，根据释放出的CO 2:的量和微生物体矿化率常数Kc 可计算出该土样微生物中的碳量。

因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。

此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。

受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。

熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取将熏蒸土壤无损地转移到200mL 聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol ·L -1K 2SO 4（图水比为1:4；w ：v ），振荡30min （300rev ·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL 塑料瓶中。

熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL 聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol ·L -1K 2SO 4提取；另作3个无土壤空白。

提取液应立即分析。

（3）测定吸取10mL 上述土壤提取液于150mL 消化管（24mm х295mm ）中，准确加入10mL0.018mol ·L -1K 2Cr 2O 7—12mol ·L -1H 2SO 4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min （放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。

方法:（1）土壤培养称取风干土（高砂土）9克于培养皿，加入1克煤灰（80目），混合均匀。

加入1ml新鲜土壤的浸提液作为接种菌液，再加入蒸馏水10ml，在28度恒温条件下7天。

(2)氯仿熏蒸将25ml无乙醇氯仿和培养的样品放入抽气皿，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5min，关紧活塞，关闭抽气机。

置于黑暗中24小时后取出氯仿，反复抽真空3～5次（每次5min）,排除氯仿。

同时做不熏蒸的处理（但同时进行暗培养）。

（3）浸提将上述经过氯仿熏蒸与未经过氯仿熏蒸的样品转移【注】到塑料瓶中，加入0.5mol/L K2SO4 Xml,在25度、200rpm 的水平恒温振荡机上振荡30min离心过滤，上TOC仪测定。

【注】为确定样液比，转移前称整个培养皿重(W1)，转移后再称重(W2)，二者之差再减去原来加入的样重（W3），即为转移时样品中的水分重量。

样液比＝W3/（W1-W2-W3+VK2SO4）样重W3＝煤灰重＋土重W1(g)W2(g)水分重量（g)VK2SO4(ml)W3(g) 样液比TOC结果（ppm)全＋熏蒸41.531.05 5.454050.1100128.2厌＋熏蒸54.0139.15 4.8640100.2229129.6好＋熏蒸45.1134.940.1735100.284332.9全47.7242.470.253550.14188.366厌52.2736.09 6.1835100.242820.56好42.3532.36-0.0135100.285831.34样品有机C含量(ppm)Ec(ppm)微生物碳Bc(ppm)全＋熏蒸1165.31106.42456.1厌＋熏蒸581.4496.71102.7好＋熏蒸115.7 6.113.4全59.0厌84.7好109.7。

土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

土壤微生物量氮的测定方法土壤微生物量氮（Microbial biomass nitrogen，MBN）是土壤中微生物形成的氮的总量，是土壤中活性微生物数量和活力的指标之一、测定土壤微生物量氮的方法有多种，下面介绍其中几种常用的方法。

1.氯仿熏蒸法氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物量氮的方法。

具体操作步骤如下：（1）选取代表性的土壤样品，将土壤样品过筛，并按照一定比例称取一定质量的土壤样品。

（2）将称取的土壤样品放入密封容器中，向容器中加入一定量的氯仿（或氯仿和甲醇混合物），使土壤样品充分与氯仿接触。

（3）密封容器，摇动混匀，使氯仿充分揉搓土壤样品，并让土壤样品中的微生物氮释放。

（4）打开容器，将装有氯仿的倒头管放入容器中吸取氯仿，并尽量不吸取液体底部的土壤悬浮液。

（5）将吸取的氯仿放入创口板上，用水浴加热挥发氯仿，使样品中的微生物氮固定为氨态氮。

（6）再将固定后的氨态氮用氯化亚铜溶液测量，即可得到土壤中的微生物量氮。

2.氯仿氯化亚铜法氯仿氯化亚铜法是一种精确测定土壤微生物量氮的方法。

具体操作步骤如下：（1）取一定质量的土壤样品，经过干燥和过筛处理后，称取一定质量的土壤样品。

（2）将称取的土壤样品与一定体积的氯仿混合，并进行摇动搅拌，使土壤样品充分与氯仿接触。

（3）将搅拌后的土壤样品与一定质量的氯化亚铜溶液混合，使土壤样品中的微生物氮转化为氨态氮。

（4）经过一定时间的反应后，向反应体系中加入一定量的盐酸，破坏悬浮液中未转化的氯化亚铜。

（5）用氯化亚铜溶液测量反应体系中残留的氯化亚铜，即可计算出土壤中的微生物量氮。

3.直接抑制法直接抑制法是一种快速测定土壤微生物量氮的方法，其原理是通过添加抑制剂抑制土壤中的微生物活动，从而间接测定微生物量氮的含量。

目前常用的抑制剂包括三氟乙酸（TFPA）和亚硝酸盐等。

具体操作步骤如下：（1）取一定质量的土壤样品，分为两组。

（2）一组不加抑制剂，作为对照组。

另一组加入一定量的抑制剂，抑制土壤中的微生物活动。

土壤微生物生物量(碳、氮）的测定(滴定法)一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。

耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。

近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。

目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（ATP）法。

氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。

通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。

二、实验材料和用具仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。

方法为：量取500ml氯仿于1000ml 分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。

再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。

将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。

2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。