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第三章酶一、名词解释1.Km2.限速酶3.酶的化学修饰4.结合酶5.Allosteric regulation6.别构调节7.Activators8.辅基9.反竞争性抑制作用10.酶的特异性二、填空1.在酶浓度不变的情况下，底物浓度对酶促反应速度的作图呈____________双曲线，双倒数作图呈线。
2. Km值等于酶促反应速度为最大速度时的________________浓度。
3.关键酶所催化的反应具有下述特点：催化反应的速度，因此又称限速酶；催化反应，因此它的活性决定于整个代谢途径的方向；这类酶常受多种效应剂的调节。
4. 可逆性抑制作用中，抑制剂与酶的活性中心相结合，抑制剂与酶的活性中心外的必需基团相结合。
5. 酶的化学修饰主要有磷酸化与脱磷酸，，________________，腺苷化与脱腺苷及SH与-S-S-互变等，其中磷酸化与脱磷酸化在代谢调节中最为多见。
6. 同工酶指催化的化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质的一组酶。
7. 竞争性抑制剂使酶对底物的表观Km ，而Vmax 。
8. 酶的特异性包括特异性，特异性与特异性。
三、问答1.简述酶的“诱导契合假说”。
2.酶与一般催化剂相比有何异同？3.什么是同工酶？请举例说明。
4.金属离子作为酶的辅助因子有哪些作用？5.说明温度对酶促反应速度的影响及其实用价值。
参考答案一、名词解释1. 即米氏常数。
Km米氏常数是单底物反应中酶与底物可逆地生成中间产物和中间产物转化为产物这三个反应的速度常数的综合。
Km=k2+k3/k1 米氏常数等于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
2.指整条代谢通路中，催化反应速度最慢的酶，它不但可以影响整条代谢途径的总速度，还可改变代谢方向，是代谢途径的关键酶，常受到变构调节和/或化学修饰调节。
3.某些酶分子上的一些基团，受其他酶的催化发生共价化学变化，从而导致酶活性的变化。
4.酶分子中除含有氨基酸残基组成的多肽链外，还含有非蛋白部分。
简述酶的化学修饰调节的特点
酶的化学修饰调节是指通过酶分子上某些化学基团的改变，从而改变酶的活性或特性的过程。
这种调节方式具有以下特点：
1. 调节效率高：酶的化学修饰调节通常可以在短时间内快速响应细胞内环境的变化，使酶的活性迅速改变，以适应细胞的生理需求。
2. 调节方式多样：酶的化学修饰调节可以通过多种方式进行，如磷酸化、乙酰化、甲基化、腺苷酸化等。
不同的修饰方式可以导致酶的活性、稳定性、特异性等方面的改变。
3. 具有级联放大效应：酶的化学修饰调节可以引发一系列的级联反应，从而对细胞内的信号通路产生放大作用。
这种级联放大效应使得细胞能够对微弱的信号做出快速而强烈的反应。
4. 受多种因素调控：酶的化学修饰调节受到多种因素的调控，如激素、生长因子、细胞因子等。
这些因素可以通过影响酶的修饰酶或修饰底物的活性来调节酶的化学修饰。
5. 可逆性：酶的化学修饰调节通常是可逆的，即修饰后的酶可以通过去修饰酶的作用而恢复到原来的状态。
这种可逆性使得酶的活性可以在需要时快速改变，以适应细胞的生理需求。
总之，酶的化学修饰调节是一种高效、多样、可逆的调节方式，对于细胞内代谢、信号转导等过程的精确调控具有重要意义。
酶的化学修饰名词解释
在生物化学中，酶是一类能够加速化学反应速率的蛋白质，它们起到了催化剂的作用。
酶的化学修饰，指通过化学手段对酶的部分或全部氨基酸残基进行改变，以改变酶的活性、稳定性或选择性。
常见的酶的化学修饰包括：
•磷酸化：在酶的氨基酸残基上添加磷酸基团，调控酶的活性和细胞信号传递。
•糖基化：在酶的氨基酸残基上添加糖基团，参与酶的稳定性和识别特异性。
•乙酰化：在酶的氨基酸残基上添加乙酰基团，影响酶的催化效率。
•甲基化：在酶的氨基酸残基上添加甲基基团，参与基因表达调控。
酶的化学修饰对于生物体的正常功能发挥至关重要，也是研究生物化学和药物开发领域的重要方向之一。
第三章酶一、名词解释 1 Km 2 限速酶 3 酶的化学修饰 4 结
合酶 5
Km：Km是酶活性检测中常用的单位，指每升溶液中所需要的活性物质（以酶为例）的量量。
又称以毫克特定物质或微克特定活性物质每升溶液为单位的量量，即为Km。
限速酶：限速酶是指在特定条件下，只要增加其反应物的浓度，其反应速率就不会改变的酶。
也就是说，限速酶的反应速率在一定的反应物浓度下与时间无关，而当反应物的浓度增加时，则限速酶的反应速率也不随时间而增加，是受到抑制的。
酶的化学修饰：酶的化学修饰指的是在酶的体外条件下，将酶外源的化学修饰剂与酶表面结合，使酶质量进行改变的一种技术。
化学修饰可以修饰酶表面的一些特殊分子，调节酶的性能，改变某些反应的传导特性，从而增加酶的生物活性等。
结合酶：结合酶是指一种特殊的酶，该酶特别能够与另一种物质结合起来，并参与化学反应。
结合酶具有较高的活性，可以变化特定的物质结构，有效地把特定的物质和其他物质转化成有用的物质。
它可以在自然环境中，对特定的物质产生分子变化，使其成为活性物质以及其他物质，从而得到新的反应物质或生物物质。
酶的化学修饰调节的特点酶的化学修饰调节是生物体内的一种重要调节方式，其特点主要包括以下几个方面：1、具有高度选择性：酶的化学修饰调节通常具有高度选择性，只针对特定的酶进行修饰，而对其他酶几乎没有影响。
这种选择性保证了生物体内不同酶的活性能够被精确地调控。
2、调节效果稳定：酶的化学修饰过程通常比较稳定，一旦酶被修饰，其活性往往会持续较长时间。
这使得酶的化学修饰调节能够在生物体内发挥持久的调节作用。
3、可逆性和可调控性：许多酶的化学修饰是可逆的，这使得酶的活性可以在不同的生理状态下进行动态的调整。
例如，在饥饿状态下，某些酶可能会被磷酸化而失活，而在饱食状态下，这些酶可能会被去磷酸化而重新激活。
这种可逆性和可调控性使得酶的化学修饰调节能够很好地适应生物体的不同生理需求。
4、具有级联放大效应：酶的化学修饰调节往往具有级联放大效应，即当一个酶被修饰后，会进一步影响其他酶的活性，从而产生更大的生理效应。
这种放大效应使得微小的调节信号能够引发一系列的生理反应，最终导致显著的生理变化。
5、参与能量代谢的调节：酶的化学修饰调节在能量代谢过程中发挥着重要作用。
例如，磷酸化可以调节酶的活性，控制糖原的合成和分解，以及脂肪酸的氧化和合成等过程。
这些过程对能量的产生和利用至关重要，因此酶的化学修饰调节在能量代谢的平衡中起到关键作用。
6、涉及多种修饰方式的协同作用：酶的化学修饰包括多种方式，如磷酸化、乙酰化、甲基化等。
不同的修饰方式可以产生不同的调节效果，有时甚至可以相互拮抗或协同。
这种多种修饰方式的协同作用使得酶的化学修饰调节更加精细和复杂。
7、参与信号转导：酶的化学修饰不仅调节酶的活性，还参与信号转导过程。
例如，当细胞受到外界刺激时，某些酶会被磷酸化或去磷酸化，从而触发一系列的信号转导通路，最终导致相应的生理反应。
综上所述，酶的化学修饰调节具有高度选择性、调节效果稳定、可逆性和可调控性、级联放大效应、参与能量代谢的调节、多种修饰方式的协同作用以及参与信号转导等特点。
第三章酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
第三章酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合5、酶微环境稳定的维持pH值改变时：①破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢键等维持天然构象的平衡力②改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态和它们之间的相互结合及作用方式许多大分子修饰剂本身就是多聚电解质，能在酶分子表面或微环境区域形成一层“缓冲外壳”。
第二节酶分子修饰的基本要求和条件一、修饰剂的要求1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性2、修饰剂上反应基团的数目及位置3、修饰剂上反应基团的活化方法与条件一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团；试剂的选择—要根据修饰目的选择例如对氨基修饰可有几种情况——修饰所有氨基而不修饰其它基团；仅修饰 -氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基；修饰具有催化活性的氨基；例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。
用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备：⏹选择性地与一个氨基酸残基反应；⏹反应在酶蛋白不变性条件下进行；⏹所标记的残基在肽链中稳定以易于分离鉴定；⏹修饰反应的程度能简单测定；二、酶性质的了解（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等（2）酶活性中心的状况活性中心基团、辅因子等。
其他如分子大小、性状、亚基数等（3）酶侧链基团的性质及其反应性巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等三、反应条件的选择修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。
（1）pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。
由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。
（3）反应体系中酶与修饰剂的比例四、酶蛋白修饰反应的主要类型1. 酰基化反应试剂特点：O含有R-C-结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、酸酐磺酰氯、硫代酸氟乙酰乙酯等。
2. 烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
修饰剂：2，4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。
3. 氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基、咪唑基，酚基等还原剂：2-巯基乙醇、DTT等可被还原的侧链基团：二硫键4. 芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂5.溴化氰裂解反应BrCN裂解Met反应可在自发诱导重排条件下导致肽键断裂。
第三节酶分子的修饰方法酶的表面修饰——化学固定化1. 通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，酶的性质也相应发生改变。
例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH发生偏移。
糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适pH7.5 靠近，可简化高果糖浆生产工艺。
2. 载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km增加，反之，Km降低。
3. 增加酶分子构象稳定性。
酶的表面修饰——小分子修饰作用⏹利用特定的小分子修饰剂修饰酶表面的一些基团：-COO-、-NH3+、-SH、-OH等。
⏹α-胰蛋白酶表面的-NH3+→NH2COOH→60℃，热稳定性提高1000倍。
酶分子的侧链基团修饰⏹采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。
⏹酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。
主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。
催化活性/非催化活性基团的修饰⏹对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。
⏹经常被修饰的残基是：亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His⏹亲电的Tyr、Trp⏹对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。
研究热点-核酸类酶的修饰RNA酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。
主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基。
氨基的化学修饰：来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂:三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修饰剂：2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差常用水溶性羰二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定量测定酶分子中羧基的数目巯基的化学修饰来源：Cys 饰反应:烷基化修饰剂：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM)N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）汞试剂：HgCl2、对氯汞苯甲酸(pCMB)和2-氯汞硝基苯酚等Ellman试剂：5，5’二硫-二-（2-硝基苯甲酸)是目前最常用的巯基修饰试剂，还可用来测定酶蛋白巯基含量胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化修饰剂：丁二酮二羰基化合物1，2－环己二酮酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应、酚羟基的修饰修饰剂：N-乙酰咪唑、碘、硝化试剂四硝基甲烷（TNM）可以高度专一地对酚羟基进行修饰咪唑基的化学修饰来源：His修饰反应:酰基化与烷基化酰基化修饰剂: 焦碳酸二乙酯烷基化修饰剂：碘乙酸吲哚基的化学修饰来源：Trp修饰反应：氧化反应修饰剂：N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）2-羟基-5-硝基苄溴（HNBB）4-硝基苯硫氯二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）解释修饰效果须十分小心，因为：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。
②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活。
③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。
酶的表面修饰——大分子修饰（大分子结合修饰），是目前应用最广的酶分子修饰方法。
1定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。
2修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子结合。
非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。
一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。
另一类添加物就是蛋白质。
蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。
共价修饰⏹用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。
⏹例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。
⏹每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；⏹每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍。
大分子修饰(共价)的过程⏹修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。
例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。
要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。
⏹修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。
使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。
⏹修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。
⏹分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得有较好修饰效果的修饰酶。
聚乙二醇及其修饰反应聚乙二醇的特点：①线性分子(HO-CH2-CH2-O-CH2)n-CH2-OH；②具有良好的生物相容性和水溶性；③在体内无毒性、无残留、无免疫原性；④末端活化后可与酶产生交联；⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学发生改变。
聚乙二醇作为修饰剂应注意的问题：①PEG分子量为750~5000的修饰效果较好，用甲氧基PEG效果更好；②修饰效果还与所用活化剂与酶的配比有关，PEG : E=15~50 : 1 → 40%活力保持。
