拟南芥alpha-Dioxygenase 2原核表达,纯化及亚细胞定位预测

,2002 a,b)。van der Biezen .(1996)首次利用转
座子标签法从在番茄中分离到一个新基因，该基因
突变导致生长缓慢、植株矮小柔弱、结实率低等，因
而命名为
。Sanz (1998)通过差异显示
技术从烟草中分离到参与细菌诱导的超敏反应过程
的新基因，并命名为 （pathogen­induced oxyge­
spectively. A fusion protein about 98 kD was detected by SDS­PAGE and Western blot in the induced recombinant BL21 (DE3)­RIPL
codon+ strain, and it accounts for 38% of the total bacterial proteins. The target protein was purified by the GST chromatography col­
第5 期
张美祥等: 拟南芥 Alpha­dioxygenase 2 原核表达、纯化及亚细胞定位预测
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们蛋白序列的相似性为 71.4%。拟南芥 DOX1 在蛋
白序列、表达模式与最初的从烟草中分离到的
相似，其表达受病原及抗逆过程诱导(Koeduka
,2005)，拟南芥 DOX2 与最初从番茄中分离到
nase），到目前为止研究者已先后从番茄、烟草、拟南
芥、水稻、小麦等植 物中分离 到 18 个 同源基 因
（Hamberg
,2005）， 并 将 其 统 一 归 类 为 al­
pha­dioxygenase。
拟南芥中脂肪酸 alpha­dioxygenase 存在两个拷
贝，根据发现先后顺序分别命名为 alpha­dioxyge­
were found in the
ORF. The subcellular localization analysis result predicted by Signal P, CELLO v.2.5, PSLpred and Softberry­ProtComp Version 6.1
indicated that the
(1.西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100；2. 河南科技大学农学院，洛阳 471003）
摘要: 将拟南芥 Dioxygenase 2
）基因编码区克隆到原核表达载体 pGEX­5X­1 获得重组表达载体 pGEX­
，
转化至大肠杆菌（
）BL21 (DE3) pLysS 和 BL21 (DE3)­RIPL codon+ 菌株中进行诱导表达。SDS­PAGE 和 Western
基 因 的 诱 导 表 达 将 pGEX­
分别导入 BL21 (DE3) pLysS 和 BL21 (DE3)­RIPL
codon+ 感受态细胞。挑取单菌落接种于在含 100
mg/L 氨苄青霉素的 LB 培养基中，37 ℃ ，180 r/min
过夜培养；以 10 %的接种量接到同样的培养基中，
扩 大 培 养 4 h 左 右 ， 加 入 终 浓 度 为 1 mmol/L 的
1 材料和方法
1.1 材料
基 因 从 ABRC (
Biological
Research Center) 获 得 （编 号 U16142）；pMD18­T
Simple Vector 购自 Takara 公司（大连），pGEX­5X­1
载体和 GSTrap 亲和柱为 Amersham 公司产品 （美
国）；Ligation Kit Version 2.0、 DNA 聚合酶和限
的 14%；Signal P 、CELLO v.2.5、PSLpred 和 Softberry­ProtComp Version 6.1 等软件分析结果显示，拟南芥 DOX2 可能定位于细
胞质。
关键词 琢­
；表达；稀有密码子；亲和纯化；亚细胞定位
中国分类号：S188 文献标识码：A 文章标号：1006­1304（2007）05­0816­05
的 FEEBLY 的蛋白序列更相似，拟南芥 DOX1 的研
究已经相当深入，其催化特性及代谢通路已基本阐
明，DOX1 可将多种碳原子数为 的脂肪酸氧化成
பைடு நூலகம்
少一个碳原子 的醛，并且伴有碳原子数为 的
羟过氧化物和碳原子数为 的脂肪酸产生(Ham­
berg ,1999)。 alpha­dioxygenase 可能与醛脱氢
制性内切酶购自 Takara 公司 （大连）；BL21（DE3）
pLysS 菌株和抗 GST 单抗购自天根公司 (北京)，
BL21 (DE3)­RIPL codon+、JM109 等菌株为本实验室
保存；1 kb plus ladder 和 PCR 产物纯化试剂盒为天
根公司产品（北京），质粒提取试剂盒购自优晶公司；
白 DOX2 按不同浓度（0.1~0.9 滋g）设 5 个梯度，分
别加入到 1 mL 含 0.2 mol/L 愈创木酚、0.03 mol/L
H2O2 和 0.1 mol/L PBS(pH 6.0)的反应溶液中。以不 加 H2O2 的重组蛋白和愈创木酚的 PBS 溶液调零进 行比色，观测 470 nm 下吸光值的变化(Saffert ,
blot 结果表明，融合蛋白在 BL21 (DE3)­RIPL codon+ 中得到了高效表达，融合蛋白表观分子量约为 98 kD，占菌体总蛋白的
38%。经 GST 亲和柱层析进一步纯化获得了可溶性重组蛋白；愈创木酚法测试表明，可溶性重组蛋白不具有过氧化物酶活性。
利用 Rare codon Caltor 进行的密码子偏爱性分析显示，该基因读码框中含有 88 个大肠杆菌稀有密码子，占总密码子（631 个）
Handbook 进行纯化，以 10 倍柱体积的 PBS 平衡
GSTrap FF, 流 速 约 1 mL/min， 将 上 清 液 以 0.5
mL/min 流速上柱，上样结束后以 20 倍柱体积的
PBS 洗柱，以 10 倍柱体积的洗脱液上柱，分别收集，
SDS­PAGE 检测纯化结果。
1.2.5 DOX2 过氧化物酶活性分析 将纯化的蛋
为二抗，用 AP 缓冲液稀释的 BCIP­NBT 显色，进行
Western blot 分析。
1.2.4 DOX2 亲和纯化 按上述 1.2.2 方法对阳性
克隆进行大量诱导表达后用溶菌酶加超声裂解菌
体,４ ℃ ，12 000 r/min 离心 30 min，分别保留上清和
沉 淀 。 上 清 部 分 按 照 GST Gene Fusion System
IPTG，37℃ ，诱导表达 4 h。12 000 r/min 离心 1 min
收 获 菌 体 ， 加 入 上 样 buffer, 煮 沸 10 min, 进 行
SDS­PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色，观察照相。
1.2.3 重组蛋白可溶性分析及 Western blot 分析
诱导后的菌体经超声波破碎，上清和沉淀分别用
DOX2 located in cytoplasm.
琢­dioxygenase 2; expression; rare codons; affinity purification; subcellular localization
琢­dioxygenase 是脂肪酸 alpha 氧化通 路的关
键成员，是脂肪酸降解的重要蛋白家族(Hamberg
2000)。阳性对照为辣根过氧化物酶。
1.2.6
基因的稀有密码子分析及亚细胞定
位 的生 物 信 息学 预 测 利 用 Rare codon Caltor 对
进行密码子 偏爱性 分析。 利用 Signal P 对
DOX2 进行信号肽预测分析，用 CELLO v.2.5、PSL­
pred 和 Softberry­ProtComp Version 6.1 等 软 件 对
Expression, Purification and Prediction of Subcellular Localization of 琢­dioxygenase 2
ZHANG Mei­xiang1, ZHANG Xiao­mei1,2, FAN San­hong1**, LUO Long­hai1, YAN Xiao­hua1, GUO Ai­guang1
umn, and the peroxidase activity of the purified protein was tested using the guaiacol method, the result showed that the soluble fusion
protein had no detectable peroxidase activity. Using rare codon Caltor software, 88 rare codons of
伸 5 min。 用 1%的琼脂糖电泳检测并回收目的片
段 ， 克 隆 入 pMD18­T Simple Vector， 命 名 为
pMD­
，筛选并测序鉴定阳性重组子。用
玉和 玉双酶切 pMD
，胶回收目的片段，
再将其与相同酶消化回收的 pGEX­5X­1 载体连接，
最后获得重组载体 pGEX­
。
1.2.2
nase 1 (
) (Ponce de Leon .,2002) 和 al­
pha­dioxygenase 2 (
)(Hamberg .,2005)，它
* 基金项目：国家自然科学基金（No.30300222）和西北农林科技大学优秀人才基金（No.042R009）资助。 ** 通讯作者。Author for correspondence. 副教授，主要从事植物分子生物学研究。E­mail: <sanhongfan@>. 收稿日期：2007­01­04 接受日期：2007­07­04