组蛋白磷酸化涉及的酶

表观遗传：组蛋白甲基化、磷酸化解决方案组蛋白修饰（histone modification）是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修饰的过程。

今天我们来重点说说组蛋白甲基化、组蛋白磷酸化。

一、组蛋白甲基化组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histonemethyl transferase，HMT）完成的。

甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。

甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的侧链N原子上。

组蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位Lys，H3的第2、l7、26位及H4的第3位Arg都是甲基化的常见位点。

研究表明·，组蛋白精氨酸甲基化是一种相对动态的标记，精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。

相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控中一种较为稳定的标记。

例如，H3第4位的赖氨酸残基甲基化与基因激活相关，而第9位和第27位赖氨酸甲基化与基因沉默相关。

此外，H4—K20的甲基化与基因沉默相关，H3—K36和H3—K79的甲基化与基因激活有关。

但应当注意的是，甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。

【1】组蛋白甲基化定量组蛋白甲基化位点主要发生在H3和H4上面赖氨酸（K）和精氨酸（R）上，且能够发生单、双、三甲基化等。

要按照数学的排列组合，那也是蛮多类型了，举例EpiQuik 组蛋白H3修饰多重检测试剂盒（比色法）（96 次），P-3100-96，EpiQuik组蛋白H3修饰定量试剂盒（比色法）是一组完全的、优化的试剂组合，可以同时定量H3上面21个修饰方式，是一个简单的Elisa检测方法。

【2】组蛋白甲基转移酶（HMTs）分析测定组蛋白甲基化修饰的时候，需要甲基转移酶来进行催化。

蛋白质磷酸化修饰在多聚谷氨酰胺疾病中的研究进展周亚芳△江泓△汤建光△唐北沙【摘要】多聚谷氨酰胺（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｐｏｌｙＱ）疾病是一大组常见的神经退行性疾病，疾病的发生源于致病基因编码区ＣＡＧ三核苷酸重复扩展突变导致基因的编码蛋白——ｐ０１ｙＱ蛋白产生多聚谷氨酰胺扩展突变。

ｐ０№疾病的发病机制目前虽然尚未得到完全阐明，但越来越多的研究表明蛋白质的磷酸化修饰在亨廷顿舞蹈病、齿状核红核苍白球路易氏体萎缩症、延髓脊肌萎缩症、遗传性脊髓小脑型共济失调１型、遗传性脊髓小脑型共济失调３型／马查多．约瑟夫病等疾病的发生发展中发挥了重要的作用。

【关键词】多聚谷氨酰胺疾病；蛋白质磷酸化；核内包涵体Ｔｈｅａｄｖａｎｃｅｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｄｉｓｅａｓｅ。

ＺＨＯＵＹａ－ｆａｎ９１△，Ｊｂ“ＶＧｌｌｏｎ９１△，ＴＡＮＧ励卜班矿，ＴＡＮＧＢｅｉ－ｓｈａｌ．１（玖妒删ｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｘｉｏ哪ａＨｏｓｐｉｔａｌ，ＧｅｒａｒｄＳＤ砒Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａ增ｓｈａ，Ｈｕｎａｎ，４１０００８Ｐ．Ｒ．Ｃｈ／ｎａ）；２（ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＸｉｏ愕，ｙａＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ，４１０００８Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）ＺＨＯＵＹａ－ｆｏ阢ｇ，ＪＩＡＮＧＨｏｎｇａｎｄＴＡＮＧＪｉａｎ－ｇｕａｎｇｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｅｑｕａｌｌｙｔｏｔｈｉｓｗｏｒｋＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＴＡＮＧＢｅｉ－ｓｈａ。

Ｅｍａ／／：ｂａａｎ９７３９８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｐｏｌｙＱ）ｄｉｓｅａｓｅｓｇｒｏｕｐｏｆｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｎｅｕｒｔＭｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓｃａｕｓｅｄｂｙｐａｍｉｏｎｏｆｇｌｕｔⅢｎｉｎｅｒｅｐｅａｔｉｎｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｇｅｎｅｐｌｎ（１ｕｃｔｓ．Ｔｏｄａｔｅ，ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｏｌｙＱｄｉｓｅａｓｅｓｉｓｓｔｉｌｌｎｏｔｖｅｒｙｃｌｅａｒ，ｂｕｔｍａｎｙｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｐｌａｙｓｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆＨｕ血ｎｇ—ｔｏｎ’８ｄｉｓｅａｓｅ，ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ－ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎａｔｒｏｐｈｙ，ｓｐｉｎａｌｂｕｌｂａｒｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ，ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒａｔａｘｉａ１ａｎｄｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒａｔａｘｉａ３／Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈｄｉｓｅａｓｅ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ；ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ；ｎｕｃｌｅａｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎ＊ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（喇．Ｎｏ．３０６７０７２０，３０４００２６２，３０７１０３０３０６１）多聚谷氨酰胺（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｐｏｌｙＱ）疾病是一大组常见的神经退行性疾病，疾病的发生源于致病基因编码区ＣＡＧ三核苷酸重复扩展突变导致基因的编码蛋白——凼ｒＱ蛋白产生多聚谷氨酰胺扩展突变。

首都师范大学学报(自然科学版)第27卷　第6期2006年12月Journal of Capital N ormal University(Natural Science Edition )V ol.27,N o.6Dec.　2006蛋白质的磷酸化修饰及其研究方法张　倩　杨　振　安学丽　王爱丽　李巧云　晏月明3(首都师范大学生命科学学院,北京　100037)摘要 蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体内的许多生命活动。

随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。

本文介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记和分离与富集、磷酸化肽及磷酸化位点分析以及蛋白质的磷酸化改性等方法,并综述了近年来国内外的主要研究进展。

关键词:磷酸化,磷酸化蛋白质,磷酸化肽,磷酸化改性,质谱.中图分类号:Q 753收稿日期:20052092273通讯作者 蛋白质磷酸化(Protein phosphorylation )是生物界最普遍,也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰(P ost 2translational m odifications ,PT Ms ),20世纪50年代以来一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程.在细胞中,大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的[1].在人类基因组中,大约有2%的基因编码了500种激酶和100种磷酸酶[2].蛋白质磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达调控的关键环节,对许多生物的细胞功能起开关调控作用,是一种普遍的重要调节机制.因此,蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的焦点之一.1　蛋白质磷酸化的主要类型与功能磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类,即:O 2磷酸盐、N 2磷酸盐、酰基磷酸盐和S 2磷酸盐.O 2磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的,如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚;N 2磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的;酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成;而S 2磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成.蛋白质磷酸化具有以下功能:(1)磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S 2或N 2磷酸盐),如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统(PTR )的组氨酸蛋白激酶(HPr );(2)磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A (丝氨酸和苏氨酸残基)或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基);(3)天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离.2　磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记传统磷酸化蛋白质分析大多利用32P 放射性标记.Lees 2Miller 和Anders on [3]利用放射性32P 对人体内的两种热休克蛋白进行了标记,最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点.de Carvalho 等[4]在昆虫细胞表达了人的单核细胞中的细胞质磷脂酶A2,并采用放射性32P 标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点.尽管人们至今仍广泛地运用放射性同位素标记法分析蛋白质磷酸化,但是这种方法的固有缺点是显而易见的.首先,这种方法存在放射性污染问题;其次,在某一专一蛋白激酶或者蛋白质体外磷酸化条件还不清楚的情况下,需要分析内源性蛋白质磷酸化时,这种方法就无能为力了.从20世纪80年代起,人们开始研究蛋白质磷酸化分析的非放射性方法.Meyer等[5]报道了用ABI 470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸,并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH衍生物.车发云等[6]进一步建立了运用毛细管电泳同时非放射性分析蛋白质或多肽中的各种O2磷酸化氨基酸的方法,可以在低pm ol范围同时分析所有3种PTH2磷酸化氨基酸,进而可分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基,运用此方法他们对3个模型磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β2酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析.车发云和夏其昌[7]还对磷酸化底物肽的硫代磷酸化及荧光标记进行了报道,他们以七肽LRRAS LG(肯普肽K em ptide)为蛋白激酶A的底物模型,研究硫代磷酸化和荧光标记反应条件,以及标记产物的性质,为荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性研究提供了一种新的方法.杨琴等[8]利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布进行了研究.同位素编码亲和标签(IC AT)[9]作为蛋白水平定量的质量标签,已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究.磷酸同位素标记亲和标签[10](PhI AT)是一种含两个不同质量的生物素亲和标签,实际上就是用不同的化学方法处理磷酸肽,从而标记出修饰位点.现已建立了两种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白Π肽的方法.G oshe等[10]将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中,通过β消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H3PO4,形成的双键受到硫代二乙醇的作用,巯基取代磷酸根.生物素与巯基相连,标记过的蛋白肽用色谱分离.Zhou等[11]用另外一种方法修饰磷酸化肽,用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分,修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合,酸洗涤释放.此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸.3　磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集 目前,在磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集的研究中经常使用的方法有以下几种:311　固相金属亲和色谱固相金属离子亲和色谱最初用于磷蛋白的亲和纯化[12],磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力,可被选择性地吸附在上面,现在微升级的I M AC 柱被用来富集微量磷酸肽样品[13,14].在此方法中,键合在鳌合底物上的金属离子(通常是Fe3+或G a3+)选择性地与磷酸化肽中的磷酸部分相结合,并且在高pH或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来.此方法的优点在于每一个可溶磷酸化肽,不管其长度如何都能被富集,而且I M AC柱洗脱下的样品可直接用于RP2HP LC分析.这种方法的局限性在于不能与I M AC相结合的磷酸化肽和难于洗脱的磷酸化肽可能会丢失.312　免疫沉淀高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白.选择性分离磷酸化蛋白通用的方法是找到能免疫沉淀任何含有磷酸化残基蛋白的抗体.酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体是已知的较好的检测磷酸化蛋白质的抗体,它具有较强的亲和力,可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质[15].T illey和Schofieldt[16]利用磷酸化酪氨酸抗体对小麦的高分子量谷蛋白进行了Western2blotting分析,发现了酪氨酸磷酸化的高分子量谷蛋白亚基. Pandey等[17]用两种检测酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体混合物,免疫沉淀表皮生长因子(EG F)刺激后的HeLa细胞总蛋白质和未处理的HeLa细胞总蛋白质,通过MS分析共鉴定出7个已知的EG F激酶底物和一个新的EG F激酶底物.为了深入探索在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法,陈沙力等[18]采用免疫沉淀法及Western印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析.结果表明在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western印迹法.王天然等[19]还初步探讨了酶联免疫试验检测磷酸化酪氨酸蛋白的可行性.抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体特异性不高,但G ronborg等[20]用6种不同的检测丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质的抗体对细胞总蛋白质进行免疫沉淀.其中3种抗体可对丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质进行免疫沉淀.共鉴定出7个丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质,其中5个是已知的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的蛋白质,1个是已知蛋白质,但以前并不知道其发生磷酸化。