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荧光探针定量PCR技术原理及应用PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。
荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。
该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。
1.原理FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’→ 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。
该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。
当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。
当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。
当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→ 3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。
荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。
PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。
由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。
由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造了条件。
陈颉摘要在以科研实际应用为背景的高考命题中，PCR 技术相关知识点的考查也层出不穷。
PCR 技术的操作与应用是学生普遍反映的基因工程考题的难点之一。
高三一轮复习具有承上启下的特点。
在高三一轮复习中，针对PCR 技术，教师可通过微视频讲解、数形结合、节选例题、引导学生小组讨论等手段，夯实基本概念，探讨条件优化，拓展应用类型，层层递进，突破教学重难点。
关键词高中生物一轮复习PCR聚焦“PCR 技术技术””突破一轮复习重难点作者简介：陈颉（1981—），男，江苏南通人，江苏省南通中学一级教师，硕士，研究方向：高中生物教学。
基金项目：本文系第二届江苏省教育考试招生研究课题“基于生物学核心素养的高考命题创新研究”（课题编号：K-e/2018/07）的阶段性研究成果。
自20世纪80年代多聚酶链式反应（PCR ）与热稳定型DNA 聚合酶（Taq 酶）被发现以来，DNA 扩增技术有了突破性的进展，PCR 技术在现代基因工程操作中的应用也越来越广。
在以科研实际应用为背景的高考命题中，PCR 技术相关知识点的考查也层出不穷。
学生普遍反映基因工程考题的难点之一为PCR 技术的操作与应用。
因此，笔者在一轮复习中就如何突破PCR 技术的教学重难点作了以下的尝试。
一、PCR 技术的知识点架构高三一轮复习具有承上启下的特点。
在复习中教师既要帮助学生对所学知识进行提炼，又要注重学生在学科核心素养方面的提升。
基于维果斯基的最近发展区理论，笔者把高中生物有可能涉及的PCR 技术知识点做了如图1所示的架构设计。
在这个知识点架构中，“基本概念”和“条件优化”两部分间是递进关系，都是重要的基础性知识。
只有深刻理解和掌握这两部分内容，才能完成“应用类型”这一学生难于理解和运用部分的学习。
而“应用类型”的知识点之间也是递进关系。
笔者通过适当选取与之相关的高考试题，依据这种递进关系把一道试题拆解成梯度难度的多个问题，帮助学生突破这一难点。
图1PCR 技术知识点架构二、PCR技术重难点的突破在突破PCR技术重难点的教学实践中，笔者是通过适当采用微视频讲解、数形结合、节选例题、引导学生小组讨论等教学手段来达成的。
专题16 转基因生物，从基因工程中溯源考向一基因工程【母题来源】2022年全国乙卷【母题题文】(2022·全国·高考真题)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。
回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。
这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA 片段。
根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。
PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。
已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。
为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。
基因工程的基本操作流程是______。
【试题解析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA 解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。
(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(90-95℃)、复性(55-60℃)、延伸(70-75℃)，故其中温度最低的一步是复性(或退火)。
第一章1、现代生物技术:也称生物工程。
在分子生物学基础上建立的创建新的生物类型或新生物机能的实用技术，是现代生物科学和工程技术相结合的产物。
2、基因重组：gene recombination 造成基因型变化的核酸的交换过程。
3、酶工程：enzyme engineering 酶制剂在工业上的大规模应用，主要由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。
4、蛋白质工程：protein engineering 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。
5、快速无性繁殖：7、生物工程：bioengineering应用生命科学及工程学的原理，借助生物体作为反应器或用生物的成分作工具以提供产品来为社会服务的生物技术。
包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程等。
8、细胞工程：cell engineering应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤在细胞整体水平或细胞器水平上，遵循细胞的遗传和生理活动规律，有目的地制造细胞产品的一门生物技术。
9、发酵工程：是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。
10、转基因工程：转基因工程又叫重组DNA技术，重组是指在体外将分离到的或合成的目的基因（object gene）,通过与质粒、病毒等载体（vector）重组连接，然后将其导入不含该基因的受体细胞(host cell)，使受体细胞产生新的基因产物或获得新的遗传特性。
11、生物固氮：是指固氮微生物将大气中的氮气还原成氨的过程。
12、人类基因组计划：human genome project于20世纪80年代提出，由美、英、日、中、德、法等国参加并于2001年完成的针对人体23对染色体全部DNA的碱基对（3×109）序列进行排序，对大约25 000基因进行染色体定位，构建人类基因组遗传图谱和物理图谱的国际合作研究计划。
利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体【摘要】目的：本研究以构建存活素增强型绿色荧光蛋白(survivin ＆efp)融合基因慢病毒表达载体（pcfusurvivin）为例来探讨infusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。
方法：根据infusion技术原理，克隆引物设计时，在survivin 同源序列的两侧分别引入经ae i线性化的载体pcfu两端各15个碱基，将以此引物扩增的聚合酶链式反应（pcr）产物与线性化pcfu用infusion交换酶在室温下作用30min，使survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换，取2μl交换液进行转化，挑取阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。
将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293t 细胞，观察survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。
结果：每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数，阳性率达90%以上，瞬时转染pcfusurvivin可获得survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。
结论：该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。
关键词】基因；克隆细胞；基因，病毒value of infusion clonin techhique on routine vector construction lin chao ui fan lin chen lian londepartment of cardioloy，union hospital，fujianmedical university，fuzhou，fujian，350001，abstract：objective:to introduce a simple method for the clonin of pcr products.methods:the infusion clonin technique was described by constructin a rebinant lentivirus vector (pcfu) with survivin ＆efp fusion ene as a sample.the survivin cdna was amplified with survivin ene specific primers with 15 bp extensions homoloous to the pcfu ends.by the action of the infusion enzyme at room temperature for 30 minutes，the sinlestranded pcr frament and vector ends were fused due to the 15 bp homoloy.finally，clones derived from transformation were chosen randomly and identified.results:about 103 positive clones for inserts were obtained after transformation with 2 μl of exchanin products，and the ratio of the positive colonies was more than 90%.after 24 h the pcfusurvivin was transfected into 293t eukaryotic cells，the expression of the survivin ＆efp fusion ene can be confirmed with fluorescence microscope.conclusion:the liation independent property makes the infusion pcr clonin technique rapid，reliable and hiher costeffective，avoidin the need for multiple sub clonin steps.key words：enes;clone cells;enes,viral传统的聚合酶链式反应（pcr）产物克隆技术包括补平末端克隆、ta克隆以及连接酶依赖性克隆等。
四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA)为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标病原生物基因1。
菌种鉴定：PCR—测序和PCR—DNA探针杂交;缩短检测时间2。
确定病毒感染和病毒载量:明确感染源,判断病情,监测疗效3.病毒分析:基因型变异产生不同临床症状4。
细菌耐药监测和分子流行病学调查 :随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1。
致病基因的分子缺陷 2.线粒体基因突 3。
肿瘤相关基因单基因病1。
致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。
2。
致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。
基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2。
疾病诊断和遗传咨询3。
多基因病的研究4。
器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。
分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。
重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所(EBI） 3。
日本国立遗传研究所(DDBJ）一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPRO T等。
蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等.蛋白质数据库常用的有SWISS—PROT、 PIR、 PDB数据库。
分子生物学研究技术Modul e 1:分子生物学研究技术cDNA文库cDNA文库，代表了生物体某一器官或组织mRNA中所有的或绝大部分的遗传信息。
其构建过程总共有5个步骤（5项技术）：1、总RNA 的提取；2、mRNA的纯化；3、cDNA的合成；4、cDNA文库构建；5、基因文库筛选。
详细：1、总RNA的提取：目前常用的提取方法是异硫氰酸胍-苯酚提取法（Trizol提取法），提取步骤：（1）首先用液氮研磨材料成匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎并溶解细胞；（2）加入氯仿抽提，离心，收集含有RNA的水相；（3）用异丙醇沉淀，初步纯化RNA，获得样品用于下一步mRNA的纯化；（PS：实验中还常将含有RNA的细胞破碎物液通过硅胶膜纯化柱后，再通过低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱RNA，获得纯度较高的总RNA）；总RNA的浓度、纯度测定：通过分光光度计测其OD260和OD280值，OD260为1时相当于RNA总量为40μg/ml；而OD260/OD280的比值如果在1.8~2.0之间，则表示所提取的RNA纯度较好。
2、mRNA的纯化：纯化原理，将真核细胞的mRNA分子具有5‘端帽子（m7G）和3’端poly （A）尾巴的特征结构，作为提取时的选择性标记。
纯化提取方法：常用寡-纤维素柱层析法获，该方法利用mRNA3‘末端的poly（A）尾巴的特点，当RNA流经寡-纤维柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA或特异性结合到柱子上，之后再用低盐溶液洗脱mRNA，经过两次层析后可获得较高纯度的mRNA。
3、cDNA的合成：利用RT-PCR技术，常以oligo（dT）为引物，甲基化的dCTP（保证新合成的cDNA链被甲基化，防止构架克隆时被限制性内切酶切割）。
合成基本过程：以mRNA为模板链，在逆转录酶的催化下以甲基化dCTP为原料合成第一条cDNA链；之后再以第一条cDNA 链为模板，在DNA聚合酶催化下合成第二条cDNA（常用RNase H切割mRNA-cDNA杂链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成的第二条cDNA片段，再同过连接酶的作用连接成完整的DNA链。
大题分析与表达练7基因工程类大题突破1.(2021山东日照二模)新型冠状病毒主要通过其表面刺突蛋白(S蛋白)与人体细胞膜上的ACE2蛋白结合实现感染。
截至2021年4月12日,中国成为全球首个能提供三种生产新型冠状病毒疫苗技术路线(灭活疫苗、重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗)的国家。
三种新型冠状病毒疫苗研发途径的技术原理如下:灭活疫苗是用各种理化方法灭活病原微生物及其代谢产物,再通过纯化等步骤制备出相应疫苗;重组蛋白疫苗是将病毒的目标抗原基因整合到表达载体中,然后将表达载体转化到中国仓鼠卵巢细胞中,经诱导表达出大量的抗原蛋白,再通过纯化而得到的疫苗;腺病毒载体疫苗是以腺病毒作为载体,将目标抗原基因重组到载体病毒基因组中得到的疫苗。
回答下列问题。
(1)上述灭活疫苗中的“灭活”是使新型冠状病毒失去,但并不破坏该病毒的。
(2)制备重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗均需要获取S蛋白基因,获取过程是提取新型冠状病毒总RNA,在酶的作用下合成DNA,再采用PCR技术选择性扩增出S蛋白基因。
PCR技术的前提是要有一段,以便根据这一序列设计出特异性的引物。
(3)腺病毒载体疫苗是将S蛋白基因重组到改造后的腺病毒内,导入人体,在体内产生S蛋白,刺激人体产生相应抗体。
改造后的腺病毒载体应具备的条件是(答出两点即可)。
与重组蛋白疫苗相比,腺病毒载体疫苗的优点体现在。
(4)腺病毒载体疫苗注入人体后,其发挥作用的机理是。
2.(2021山东青岛二模)基因工程抗体又称重组抗体,是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配,经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。
下图为某研究所制备小鼠抗甲型肝炎病毒抗体的流程图。
回答下列问题。
(1)实验室构建重组质粒时,为保证目的基因与载体的正确连接,过程①最好选择的限制酶是。
(2)在重组质粒中,目的基因首端的启动子能够,从而驱动目的基因的转录。
除启动子之外,重组质粒还应该包含等。
中国图书分类号Q789R373.3+1文献标识码A文章编号1004-5503（2008）12-1047-05【基础研究】以长链PCR为基础利用融合PCR扩增乙型脑炎病毒全长cDNA李静1俞永新2安琪2杨力宏2孔艳2【摘要】目的以长链PCR（Long-PCR）技术为基础，应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒（JEV）全长基因组。
方法根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物，分别扩增JEV SA14-14-2株的5′和3′半长分子，在5′端上游引物中引入T7启动子核心序列。
利用细胞培养增殖病毒，提取病毒RNA，逆转录后采用Long PCR方法得到JEV的5′和3′两个半长分子，在此基础上进行融合PCR，得到JEV全长cDNA分子，克隆入pGEM T-easy载体，酶切鉴定并测序。
结果扩增出均6000bp的JEV的5′和3′两个半长分子及约11000bp的全长cDNA片段，其二级结构丰富的非编码区未发生缺失。
JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性最高达99％，其氨基酸序列同源性最高达96.3%。
其E蛋白基因与野毒株和减毒株进行比较，核苷酸序列同源性高达98％～99％，氨基酸序列也未出现较大差异。
结论已获得了乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长基因组，为进一步构建感染性克隆奠定了基础。
【关键词】乙型脑炎病毒；全长cDNA；长链PCR；融合PCRAmplification of Full-length cDNA of Japanese Encephalitis Virus by Long PCR-based Fusion PCRLI Jing△,YU Yong-xin,AN Qi,et al（△Wuhan Institute of Biological Products,Wuhan430060,China）【Abstract】Objective To amplify the full-length cDNA of Japanese encephalitis virus（JEV）by long PCR-based fusion PCR. Methods The primers were designed according to the full-length cDNA of JEV reported in GenBank,and the core sequence of T7 promoter was introduced to the upstream primer at5'-terminus.JEV strain SA14-14-2was inoculated to Vero cells for proliferation, and viral RNA was extracted for reverse transcription and amplification of half-length of5'and3'gene sequences of JEV by long PCR respectively,based on which the full-length of JEV cDNA was obtained by fusion PCR and cloned into pGEM T-easy vector. The constructed recombinant plasmid was identified by restriction analysis and sequencing.Results The5'and3'gene fragments each at a length of about6000bp as well as full-length cDNA of about11000bp were amplified.No gene deletion was observed in the secondary structure-rich non-encoding region.The homologies of nucleotide and amino acid sequences of the amplified full-length cDNA were99%and96.3%to those of relevant strain in GenBank respectively.The nucleotide sequence of E gene showed a homol－ogy of98%-99%to those of wild and attenuated strain,while amino acid sequence showed no significant difference.Conclusion The full-length of cDNA of JEV strain SA14-14-2was amplified,which laid a foundation of further construction of infectious clones.【Key words】Japanese encephalitis virus;Full-length cDNA;Long PCR;Fusion PCR乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是黄病毒科黄病毒属成员，属于单股正链RNA病毒。
其病毒颗粒呈球形，直径约50nm。
基因组RNA 约11000bp，其5′和3′端为非编码区（UTR），分别约120和500个核苷酸，是RNA复制和翻译的基本序列［1］。
其基因组翻译后首先合成一多聚蛋白前体，其含有的病毒蛋白依次为：C-prM／M-E-NS1-NS2A／2B-NS3-NS4A／4B-NS5。
结构蛋白基因和非结构蛋白基因在ORF中按5′-3′方向排列。
为了便于在基因水平上进行操作、改造病毒基因组，从而更好地研究该病毒复制、表达与致病机理等特性，得到其全长cDNA序列至关重要。
本研究将长链PCR（Long-PCR）与融合PCR方法相结合，在获得其基因组3′和5′两个半长分子的基础上，利用融合PCR技术，扩增出JEV全长cDNA，并构建全长cDNA克隆，为进一步构建乙型脑炎病毒感染性克隆奠定基础。
1.材料与方法1.1菌毒株、细胞及载体乙型脑炎减毒活疫苗毒种SA14-14-2和Vero 细胞由中国药品生物制品检定所疫苗一室保存；大肠杆菌DH5α购自Roche公司；克隆载体pGEM T-easy 购自Promega公司。
1.2试剂限制性内切酶购自NEB公司；Expand Reverse Transcriptase购自Roche公司；Hot start LA Taq、DNA marker和dNTPs购自TaKaRa公司；质粒提取和PCR产物回收试剂盒购自Qiagen公司；DMEM培养作者单位：1武汉生物制品研究所（武汉430060）；2中国药品生物制品检定所疫苗一室（北京100050）.通讯作者：俞永新，E-mail：yuyongxin@基和胰酶等购自GIBICO公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司。
1.3病毒的培养用含10％小牛血清（FCS）和双抗的DMEM培养Vero细胞，待细胞长成单层后接种JEV SA14-14-2，37℃，5％CO2条件下培养5d后，收获细胞培养物，-70℃冻存，用于病毒核酸的提取。
1.4病毒RNA的提取利用Trizol试剂从细胞培养物中提取JEV RNA，按照试剂使用说明操作。
1.5引物的设计及合成根据GenBank中收录的JEV SA14-14-2株基因组全序列（U14163）设计引物。
根据JEV基因组3′端序列设计特异性引物jvanti用于逆转录，5′和3′端引物中分别添加酶切位点NotⅠ和XhoⅠ，并在5′端引物中添加T7启动子序列。
引物Jp1和Jp2、Jp3和Jp4分别用于扩增5′、3′半长分子，在获得两个半长分子的基础上，利用融合PCR技术，以Jp1和Jp4为引物，扩增全长cDNA分子。
引物序列见表1。
表1JEV全基因组RT-PCR引物Tab1.RT-PCR primers for full-length cDNA of JEVSite in reference Primer Sequence（5′-3′）sequence（nt）jvanti AGATCCTGTGTTCTTCCTCACTAC10953-10976Jp1AGCTGCGGCCGC TAATACGACTCACTATA NotⅠ／T7 GGAGAAGTT TATCTGTGTGAACTTCTTGG promotor／1～27 Jp2TGTGTCATAGGACTTGCGGTTG5765～5786Jp3CCACGCCACTCTGACCCATAG5393～5413Jp4ACACTCGAG AGATCCTGTGTTCTTCCTCAC10952～10976／TACC XhoⅠNote:The restriction site is in italics,and T7promoter is underlined.1.6逆转录合成cDNA将提取的总RNA溶于10μl DEPC水中，95℃作用2min，冰浴5min，然后加入1μl25mmol／L逆转录引物，4μl5×buffer，1μl二硫代苏糖醇（DTT），1μl RNase抑制剂，1μl Expand逆转录酶，1μl 10mmol／L dNTPs，最后加DEPC水至总体积20μl，42℃保温2h，进行反转录。
反应完毕，70℃灭活15min。
逆转录产物中加入1μl RNase H，37℃温育20min，去除cDNA中混合的RNA。
1.75′和3′半长分子的PCR扩增利用Hot start LA Taq酶进行PCR，反应体系：1μl 模板cDNA，2μl10×PCR buffer，2.5μl10mmol／LdNTPs，1μl LA Taq酶（5U／μl），上下游引物各0.5μl （25mmol／L），加无菌dH2O至总体积25μl。
反应条件：94℃2min；94℃15s，68℃6min，共30个循环；最后68℃延伸10min。
PCR产物于0.5％含Golden View的Agarose中进行电泳分析。
采用胶回收试剂盒纯化5′、3′两个半长PCR产物，-20℃保存备用。
1.8JEV5′和3′半长分子克隆载体的构建及鉴定将纯化后的5′、3′两个半长PCR产物分别连接于pGEM T-easy载体上，构建5′和3′半长cDNA分子克隆。
