第29卷第1期浙江林业科技Vol. 29 No.1 2 0 0 9年1月 JOUR. OF ZHEJIANG FOR. SCI. & TECH. Jan., 2 0 0 9 文章编号：1001-3776（2009）01-0044-02马尾松松针提取物抗氧化能力研究潘炘（浙江林业科学研究院浙江省森林资源与生物质化学利用重点实验室，浙江杭州 310023）摘要：以BHT作为对照研究了马尾松（Pinus massoniana）松针甲醇溶剂提取物（Pine needle extract, PMNE）在体外对1,1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH自由基）的清除能力，对Fe3＋的还原能力，同时测定了提取物中的总酚含量。
结果显示，PMNE在体外具有较强抗氧化能力，其清除DPPH自由基能力稍弱于BHT，还原Fe3＋能力则比BHT稍强，提取物内总酚含量为10.5μg/mg，因此PMNE是一种天然抗氧化剂。
关键词：马尾松，松针，提取物；抗氧化活性，总酚含量中图分类号：S791.248 文献标识码：AStudy on Antioxidative Activeities of Pinus massoniana Needles ExtractPAN Xin，LIU Ya-qun，CHEN Shun-wei，ZHUANG Xiao-wei（Key Laboratory of Forestry Resources Utilization of Zhejiang, Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China）Abstract: Experiment was carried out on antioxidative activities of Pinus massoniana needles extract(PMNE) , such as 1,1-dipheny l-2-pirylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and reducing force of Fe3＋in vitro, taking BHT as control. Total phenol content of Fe3＋was also measured. The result indicated that the DPPH radical scavenging activity of PMNE was just a little less than that of BHT and the reducing force of PMNE was higher than the control. The total phenol content of PMNE was 10.5 ug/mg. The conclusion was that PMNE is a natural antioxidant.Key words: Pinus massoniana; pine needles; extract; antioxidant; total phenol content马尾松（Pinus massoniana）是我国亚热带南部潮湿地区分布最广的树种。
干燥的马尾松针叶作为一味常用中药，始载于《名医别录》上。
其性温，叶苦、涩，有祛风止痛、杀虫止痒、活血消肿、安神、明目等功效，临床上用于治疗风湿疼痛、牙痛、跌打损伤、脚气水肿、夜盲症、心脑血管病、糖尿病、肥胖病、肝病、胃病、淋病、慢性支气管炎、肿瘤等症，其价值日益受到重视。
马尾松针叶中含黄酮类化合物、贝壳核酸-19-甲醚、南洋核酸等，并且还含有挥发油（主要成分为蒎烯及乙酸龙脑酯）和胡萝卜素、维生素B、维生素C、维生素K、维生素E等[1~3]。
活性氧（ROS）自由基，在生物体衰老与疾病以及正常的免疫、代谢与细胞信号传导等过程中都起着重要的生理作用，因此对活性自由基的研究倍受关注[4]。
研究发现有机体的多种疾病都与自由基对机体的氧化损伤有关。
因此寻找能够清除自由基的抗氧化剂，研究其抗氧化机理就显得十分重要。
本文旨在研究马尾松松针提取物的抗氧化性。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 原料及主要药品新鲜马尾松松针，采自浙江杭州午潮山。
1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），丁基羟基甲1期潘炘，等：马尾松松针提取物抗氧45苯（BHT），铁氰化钾；三氯化铁，三氯乙酸，磷酸，钨酸钠，钼酸钠，盐酸，硫酸锂，没食子酸，溴。
1.1.2 仪器设备 R-205旋转蒸发仪，752PC分光光度计、DL-4000B离心机，BS224S分析天平，SY-1000E超声发声器，DG-120中药粉碎机，LGJ-12冷冻干燥机。
1.2 实验方法1.2.1 提取物的制备将新鲜马尾松松针置于65℃烘箱10 h，将烘干马尾松松针打碎过100目筛，称取10 g置于锥形瓶中，加入其质量12倍的甲醇—水溶液（7∶3，V/V），在20℃下超声提取12 h，滤纸过滤得滤液。
将滤液于60℃下真空浓缩，将得到的浓缩液进一步冷冻干燥，得浸膏状提取物。
将得到的浸提物配成1 mg/mL（溶剂甲醇—水溶液）待测。
1.2.2 提取物清除DPPH自由基能力的测定移取0.2 mM的DPPH甲醇溶液1 mL于不同比色管中后分别加入不同体积的马尾松提取物（1 mg/mL），用甲醇—水溶液补足至4 mL，使反应体系中提取物分别为1.00、0.75、0.50、0.25 mg，充分混匀，在室温下静置30 min后，以甲醇—水溶液调零点，在波长517 nm处测定其吸光值，记为样品吸光值[5]。
同时，以未加样液作为空白，在波长517 nm处测定其吸光值，记为空白吸光值。
以BHT 作对照。
根据以下公式计算马尾松提取物对DPPH自由基的清除率。
DPPH自由基清除率（%）=（空白吸光值－样品吸光）/ 空白吸光值×1001.2.3 提取物还原能力的测定移取提取物1.0 mL以甲醇—水溶液补到2.5 mL，加入磷酸缓冲液（2.5 ml，0.2 Ｍ，pH6.6）和铁氰化钾[2.5 ml，1%（W/V）]，并在50℃下反应20 min。
随后反应体系加入2.5 mL的三氯乙酸[10%，（W/V）] 混合物在1 000 g的离心机下离心10 min。
取上清液2.5 mL＋蒸馏水2.5 mL＋FeCl3[0.1%（W/V）]0.5 mL在700 nm下比色，高的吸光值表明高的还原能力[6]。
以BHT为对照。
1.2.4 提取物总酚含量的测定 Folin—酚试剂的配制：在1.5 L圆底烧瓶中加入100 g钨酸钠、25 g钼酸钠、700 mL蒸馏水、50 mL 85%磷酸及100 mL浓HCl，充分混匀后回流10 h，回流完毕，再加l50 g硫酸锂，50 mL蒸馏水及数滴液体溴，开水继续沸腾15 min，冷却后定溶至1 000 mL，即为Folin—酚试剂的贮备液。
使用前稀释1倍，此为Folin—酚试剂的应用液[7~8]。
标准曲线的建立，以没食子酸为标样，准确称取0.01 g溶于100 mL的容量瓶中，用移液枪分别吸取0、25、50、100、150、200μL，并以蒸馏水补足至1 mL。
将此1 mL加入2 mL Folin-酚试剂，并不断振摇，使之迅速反应，然后放置5 min。
加入1 mol/L的Na2CO3溶液，边加边振摇并定容至25 mL。
于50℃水浴中加热l5 min。
凉却后于756 nm处测定共吸光度。
2 结果与讨论2.1 提取物对DPPH自由基的清除能力DPPH自由基是一种以氮为中心、十分稳定的自由基，其稳定性主要来自共振稳定作用及3个苯环的空间障碍，而使夹在其中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。
DPPH乙醇溶液呈紫色，最大吸收波长为517 nm。
如果有其它物质提供一个电子使此孤电子被配对，吸收消失或者减弱，导致溶液颜色变浅，在517 nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系。
故该法可以用来表征某种物质对自由基的清除能力[9]，通常用清除率表示，清除率越大，表明该物质对自由基的清除能力越强。
不同浓度松针提取物清除DPPH自由基的能力见图1。
由图1可以看出，松针提取物具有清除DPPH自由基的能力，随着松针提取物浓度的增加，其对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，说明松针提取物对DPPH自由基的清除能力与其浓度存在明显的剂量效应关系。
与阳性对照BHT相对比可知，在低浓度时BHT比松针提取物有更高的DPPH自由基抑制率，但当提取物的浓度达到0.6 mg/mL以上时其DPPH自由基抑制率与BHT相当。
目前，半数清除浓度（IC50）被普遍采用作为评价抗氧化剂能力强弱的指标[10]。
松针提取物对DPPH自由基的清除率（y1）与其浓度（x1）之间的线性回归方程为：46 浙 江 林 业 科 技 29卷y 1 = 99.196 x 1＋7.583 8其IC 50为0.43 mg/mL ；BHT 对DPPH 自由基清除率（y 2）与其浓度（x 2）之间的线性回归方程为：y 2 = 65.309 x 2＋39.232其IC 50为0.16 mg/mL 。
表明松针提取物对DPPH 自由基的清除能力低于BHT 。
2.2 松针提取物还原能力的测定抗氧化剂的抗氧化能力与其还原力有关，还原力越大，抗氧化能力越强。
抗氧化剂能够在一定的条件下将Fe 3＋还原为Fe 2＋，因此根据Fe 3＋还原为Fe 2＋的多少来间接评价各种提取物的抗氧化能力。
图2为松针提取物与BHT 还原能力测定图。
从图2中可知，BHT 与松针提取物均显示出较强的还原能力，并且松针提物比BHT 的还原能力稍强。
2.3 松针提取物总酚含量的测定以吸光度x 为横坐标，总酚浓度y 为纵坐标建立标准曲线，回归方程：y = 41.345x －0.268 89绘制的标准曲线如图3所示。
经测定，1 mg 的马尾松提取物中总酚含量为10.5μg 。
3 结论对松针甲醇溶剂提取物进行了清除DPPH 自由基和还原能力研究，并对其提取液中的酚类物质进行了测定，结果表明，提取物有较强的抗氧化性质，其中还原能力与常用合成抗氧化剂BHT 相比，要强于BHT ，而清除DPPH 自由基的能力不如BHT 。
在1 mg 提取物中测得的酚类物质含量为10.5μg ，因此松针抗氧化性可能还与其他多种物质有关。
长期食用含有人工合成抗氧化剂的食品，可以影响人体健，植物来源的食品添加剂因对人体无害而越来越受到青睐。
因此马尾松松针可以作为功能食品的素材添加到食品中去，制成功能食品。
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