研究生免疫组织化学染色技术

免疫组织化学染色知识点摘要：一、免疫组织化学染色的概念二、免疫组织化学染色的原理三、免疫组织化学染色的方法四、免疫组织化学染色的应用五、免疫组织化学染色的优缺点正文：免疫组织化学染色是一种将免疫学原理应用于组织学的方法，通过化学反应使组织中的抗原与抗体结合，从而检测特定抗原在组织中的分布和表达情况。

该技术广泛应用于生物学、医学等领域，对疾病诊断、研究及治疗具有重要意义。

免疫组织化学染色的原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应。

首先，通过化学或物理方法暴露组织中的抗原，然后用特异性抗体与抗原结合，最后通过显色反应检测结合情况。

常用的显色方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光染色法等。

免疫组织化学染色方法包括以下几个步骤：1.组织处理：固定、脱水、透明、浸蜡等；2.抗原修复：去除组织中的封闭抗原，暴露目标抗原；3.免疫染色：用特异性抗体与抗原结合；4.显色：检测抗体与抗原结合后的显色反应；5.观察和分析：通过显微镜观察染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况。

免疫组织化学染色技术在生物学和医学领域具有广泛应用：1.疾病诊断：通过检测特定抗原的表达，辅助诊断疾病，如肿瘤、炎症等；2.疾病研究：研究抗原在疾病发生和发展过程中的作用机制；3.药物研发：检测药物对特定抗原的影响，评估药物疗效；4.肿瘤分期和预后评估：通过检测肿瘤组织中抗原的表达情况，评估肿瘤分期和预后。

免疫组织化学染色技术具有以下优缺点：优点：1.高敏感性：能够检测微量抗原；2.高特异性：特异性抗体与抗原结合，减少交叉反应；3.定位准确：显示抗原在组织中的分布和表达情况；4.易于操作：方法简单，仪器设备要求较低。

免疫细胞化学染色法的原理免疫细胞化学染色法是一种常用的实验技术，用于检测细胞中特定蛋白质的存在和定位。

其原理基于免疫学和细胞生物学的知识，可以通过以下步骤来解释：1. 抗原抗体反应，首先，我们需要选择一个特定的抗体，该抗体能够与我们感兴趣的蛋白质（即抗原）发生特异性的结合。

这个抗体可以是由动物免疫产生的多克隆抗体或单克隆抗体，也可以是经过重组技术获得的单克隆抗体。

2. 细胞固定，接下来，我们需要将待染色的细胞固定在载玻片上，通常使用甲醛或乙醛进行固定。

固定可以保持细胞的形态结构和蛋白质的空间位置。

3. 渗透化处理，为了使抗体能够渗透到细胞内部，我们需要对细胞进行渗透化处理。

一般常用的方法是使用洗涤剂（如TritonX-100）或酸性溶液（如盐酸）来破坏细胞膜，使抗体能够穿过细胞膜进入细胞内。

4. 抗体结合，将选择的抗体加入到载玻片上的细胞上，抗体会与细胞内的特定抗原结合。

这种抗原-抗体的特异性结合可以帮助我们检测和定位感兴趣的蛋白质。

5. 二抗结合，由于直接观察抗原-抗体结合并不容易，我们需要使用一个与第一抗体结合的二抗体。

这个二抗体通常是由动物免疫产生的，可以与多种不同种类的抗体结合。

二抗体通常被标记上一种可视化信号，如荧光染料或酶标记物。

6. 可视化信号检测，根据实验需要，我们可以选择不同的方法来检测二抗体的存在。

如果使用的是荧光染料，我们可以使用荧光显微镜来观察染色结果。

如果使用的是酶标记物，我们可以添加适当的底物，使其产生可见的色素反应。

通过以上步骤，免疫细胞化学染色法可以帮助我们检测和定位细胞中特定蛋白质的存在。

这种方法在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域具有广泛的应用。

免疫组织化学染色知识点
免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，简称IHC）是在组织切片或细胞制片的基础上，通过利用特异性抗体与细胞或组织中特定分子间的特异性结合反应，以染色或标记方式来检测目标抗原的一种检测技术。

以下是免疫组织化学染色的一些基本知识点：
1. 抗体选择：根据实验目的选择合适的抗体，一般选择单克隆或多克隆抗体。

抗体可以是来自同种或异种动物，也可以是人源化的。

2. 组织或细胞预处理：包括固定、脱脂、脱水和切片等步骤，目的是保持组织或细胞的形态和结构完整，同时提高抗体的进入性。

3. 抗原解表：染色前需进行抗原解表处理，去除组织或细胞中的内源性酶等物质，以提高抗体的结合效率。

4. 特异性抗体结合：将经过解表处理的组织或细胞与选择的特异性抗体反应，抗体与目标抗原结合形成免疫复合物。

5. 二抗结合：特异性抗体结合后，使用与该抗体结合的二抗（常为抗种属免疫球蛋白）进行结合，放大信号。

6. 染色反应：根据具体实验的需要，可以选择不同的染色反应方法。

常用的染色方法有酶标法（如辣根过氧化物酶染色法，碱性磷酸酶染色法等）和免疫荧光染色法。

7. 结果观察和分析：观察染色结果，可以通过显微镜观察染色位置和程度，分析目标抗原在组织或细胞中的分布情况。

8. 数据分析和结果解读：根据染色结果，进行数据统计和分析，并结合实验设计和背景知识进行结果解读和推断。

总结：免疫组织化学染色是一种用于检测组织或细胞中特定抗原的技术，通过选择合适的抗体、预处理样品、特异性抗体结合、染色反应等步骤，可以获得目标抗原的位置和分布情况，并通过数据分析和结果解读来获取有效的实验结果。

免疫组化的相关知识！一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。

二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

四、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。

另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。

细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。

细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。

一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。

骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。

以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。

（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。

（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。

（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。

（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。

“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。

免疫组织化学染色
免疫组织化学染色(Immunohistochemical Staining,IHC)是一种常见的组织学检测方法，用于确定细胞或组织中特定蛋白质的表达或位置。

这种技术实际上是将抗原源合成出抗体，利用免疫相互作用(两抗体一抗原)在细胞内或细胞外测定有无抗原物质。

这种技术有许多种变式，其中一种叫做实时双标定量免疫组织化学染色(RQ-IHC)，可以用来检测癌细胞内外的抗原表达。

染色十分具体：首先，切取患者的取样以供检测，然后将组织片放在真空显微镜的底部，将抗体滴在表面上并使其完全覆盖，然后将片子放置在一定温度的溶液中培养，以促成抗体和抗原之间的结合。

最后，借助细胞标记小分子，将抗原特异性滴在含抗体片上，以实现染色。

此外，还可以使用磁珠，是特殊磁性微球，将抗体带入抗原，从而改善抗体和抗原的结合，从而提高染色的特异性。

IHC 染色为临床检测提供了重要佐证，在临床组织活检及肿瘤监测中有着重要的作用。

它可以帮助医生的诊断和行医判断，帮助选择治疗方法，更好地控制肿瘤的发展，最大限度地减小病人的痛苦。

IHC 染色在其他方面也有重要应用，尤其是在器官移植和临床药物开发中，它能够有效提高细胞和组织质量，并帮助研究者准确地检测细胞和组织中蛋白质的表达。

通过IHC 染色，可以帮助我们准确了解细胞组织的结构和异常状态，从而改善对各种疾病的辅助检测、诊断和治疗。

这一技术为临床医生提供了坚实的诊断成果，给患者带来了良好的治疗效果。

免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence，简称IF）是两种常用的免疫细胞化学技术，用于在组织切片或细胞涂片上检测特定蛋白质或抗原的存在和分布。

这两种技术都依赖于抗体与抗原之间的特异性结合反应。

免疫组织化学是一种使用酶标记抗体来检测抗原的方法。

在这个过程中，首先将组织切片与特定的初级抗体（针对目标抗原的抗体）孵育，然后洗涤以去除未结合的抗体。

接下来，将切片与带有酶标记的次级抗体（针对初级抗体的抗体）孵育。

再次洗涤后，加入酶的底物，它会在酶的作用下产生颜色沉淀，使得抗原的位置在显微镜下可见。

常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。

这种方法的优点是可以产生永久性的记录，因为颜色沉淀是稳定的。

免疫荧光染色则涉及使用荧光染料标记的抗体来检测抗原。

在这个过程中，初级抗体和次级抗体都带有荧光标记。

当这些抗体与抗原结合时，它们发出的荧光可以在荧光显微镜下观察到。

这种方法的优点是可以同时使用多种颜色的荧光染料来检测多个不同的抗原，而且荧光信号通常比免疫组织化学的颜色反应更强。

两种技术都有其应用范围。

免疫组织化学常用于病理学诊断，因为它可以用于存档的组织样本，并且结果可以用常规显微镜观察。

而免疫荧光染色则更适合于研究目的，特别是在活细胞成像和多标记实验中，因为它可以提供更丰富的信息和更高的灵敏度。

总之，免疫组织化学和免疫荧光染色都是强大的工具，它们使得科学家能够在细胞和组织水平上可视化蛋白质的表达和定位。

选择哪种技术取决于实验的具体需求和可用的设备。

免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤展开全文1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。

如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。

1) 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm× 0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。

固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。

从而完好的保存抗原和组织细胞形态。

对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h 内，一般固定时间不应超过24小时。

随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。

2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。

掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。

免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。

缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。

试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。

2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。

3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。

5、马上用荧光显微镜观看。

观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。

留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。

2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。

免疫组织化学核染膜染色原理-概述说明以及解释1.引言1.1 概述免疫组织化学和核染色、膜染色是生物医学研究中常用的技术方法，它们的原理与应用在疾病诊断和治疗中起着重要的作用。

本文将从免疫组织化学、核染色和膜染色的基本原理、方法和应用等方面进行详细介绍。

免疫组织化学是一种利用免疫学原理来研究细胞和组织中特定分子的分布和表达的技术。

通过标记特定抗原与其对应的抗体结合，再通过染色或发光等方法来观察和检测抗原分子在细胞和组织中的位置、表达水平以及相关分子的相互作用等情况。

免疫组织化学可以帮助研究者更深入地了解分子的定位、表达和功能，为疾病的发生机制以及治疗方法的研究提供重要的依据。

核染色是一种通过染色剂将细胞核染色的技术，它可以帮助观察和分析细胞核的形态、结构和功能。

核染色的目的是获取细胞核的相关信息，如细胞核的数量、大小、形态以及细胞核中的核糖核酸（DNA和RNA）的含量和分布等。

核染色方法主要包括使用染色剂对细胞核进行染色、观察染色后的细胞核形态和颜色变化，并通过显微镜观察和分析细胞核的具体情况。

膜染色是一种用染色剂将细胞膜染色的技术，它可以帮助观察和分析细胞膜的形态、结构和功能。

细胞膜是细胞的外围结构，它具有维持细胞内外环境平衡、参与物质交换和信号传导等重要功能。

膜染色方法主要通过选择合适的染色剂对细胞膜进行染色，然后通过显微镜观察和分析染色后的细胞膜形态和颜色变化。

通过免疫组织化学、核染色和膜染色等技术的应用，我们可以更全面地了解细胞和组织的特点和功能，进一步探究生物体的内在机制，为疾病的诊断和治疗提供科学依据。

本文将详细介绍免疫组织化学、核染色和膜染色的原理、方法和应用，以期为相关研究者提供一定的参考和指导。

文章结构部分的内容应该包括对整篇文章各个章节的简要介绍和组织安排，以帮助读者更好地理解全文的逻辑和组织。

在本文中，文章结构如下：1. 引言1.1 概述：对免疫组织化学、核染色和膜染色进行简单介绍，突出它们在生物医学研究中的重要性和应用。

十五、免疫组化流程
1、65℃烤片1-2h
2、从65℃烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min。

3、自来水冲洗5min。

4、蒸馏水冲洗3遍。

5、高压修复（先将修复液煮沸后，将片子放入煮沸溶液中，将压力锅盖盖好，当气阀冒气时，开始计时2分40秒，此时将温度调至140℃）。

6、将电磁炉电源关闭，用自来水冲洗压力锅锅盖，至气阀自然落下，将锅盖打开，自然降至室温（约40min左右）。

7、PBS浸泡5min*3次。

8、3%的H2O2封闭30min。

9、蒸馏水冲泡2次。

10、PBS浸泡5min*3次。

11、加Ⅰ抗8张片子，每片80μl8*80=640μl
配700μl700μl（释液）+7μl（Ⅰ抗）
12、室温放置30min，放4℃过夜。

13、第二天拿至室温平衡30min（提前准备PBS）
14、PBS洗5min*3次
15、加Ⅱ抗 50-100μl张37℃ 30min，或室温1小时
16、PBS洗5min*3次
17、DAB显色（2min）。

18、流水中止，流水冲洗5min。

19、苏木素复染（2min），流水中止，流水冲洗5min。

20、梯度酒精脱水各5min（从无水乙醇拿出风干片子，再放入二甲苯中）。

21、二甲苯透明各15min。

22、用中性树胶封片。

盐酸酒精500ml无水乙醇+250ml蒸馏水+6ml盐酸
氨水600ml蒸馏水+2m氨水
氨水作用：返蓝。