感受态制作

1>细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/mL左右，这时比较合适。

密度过高或不足均会影响转化效率。

2>所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。

3>经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）4>化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）5>所使用的器皿必须干净。

少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率; 首要问题就是操作是防止污染，因为这个是最容易影响感受态制作的因素。

其次，就是悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮，如果用移液器，把枪头前面剪掉一部分，然后再吹，这样吹的比较柔和感受态制备及转化的方法很多，效率最高的是电转化，可达到10次方，普通的化学转化只能达到8次方，一般自己做也就是6-7次方，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管即开始转化，但效率也最低，只能满足环形质粒的转化（某些公司也有现成试剂盒）要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。

以下是一些制备感受态的注意事项：1、所用器具的洁净程度。

这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。

2、培养基的装量。

培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。

感受态细胞的制备：1.以1:100的比例吸取过夜菌液（250ul）加入25ml LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右（OD600范围0.4-0.6）。

2.将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。

3.于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

5.每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。

6.于4℃，以4000rpm 离心10min，回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

8.每50ml初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀。

9.在冰上将细胞分装成小份，100ul/份，防御-70℃冻存。

10.如果当天要用，最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用，效果较好。

制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用，不影响效果。

感受态细胞制备流程图：过夜菌250ul加入25ml LB液体培养基37℃，200r/min 振荡培养2-3h OD600测达0.5左右转移至50ml聚丙烯离心管冰上放置30min 培养物到0℃4℃，4000rpm ，离心10min 回收细胞弃培养液倒置放置1min 加入5ml 0.1mol/LCaCl2悬浮细胞沉淀，冰上放30min 4℃，4000rpm ，离心10min 回收细胞弃培养液倒置放置1min 加入1ml预冷0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）悬浮细胞沉淀冰上分装，10ul/份70℃冻存（当天实验4℃放置4h，最多可放置48h）转化1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。

感受态细胞制备流程1、准备好制备感受态所用的菌株（一般是甘油菌）2、用准备好的菌株在对应抗性的平板上换线，生长12-16小时3、挑取划线平板上的单菌落至对应抗性的LB液体培养基中活化6-8小时（建议接种时间为早上9-10点）4、将活化好的菌液接种至培养基中（一般体系为3瓶250ml液体LB培养基分别接种2ml、4ml、8ml，3瓶50ml液体LB培养基分别接种400ul、800ul、1200ul；需要使用的培养基需要提前放置在摇床中37o C培养3小时以上以确保无杂菌）5、摇床培养接种液，温度控制在18-25o C之间，转速为200RPM（粘板摇床为140RPM）6、测量接种液的OD600，当OD600达到0.5-0.6时（0.55最佳，OD600的对照为LB培养基）即可开始后续步骤（一般培养时间为晚上8点接菌，18oC培养，第二天早上9点半至10点OD600可达到0.5以上，备注：冬天，建议冬天多制备一些，因为冬天制备的感受态效率会别夏天制备的感受态转化效率高一些）后续步骤必须在无菌条件下进行！！！7、将菌液转置至离心瓶或离心管中（视制作体积而定，离心瓶或离心管必须经过灭菌处理），冰上静置10min8、2500g（RCF），4oC，10min离心收集菌体（离心机需要提前开始预冷）9、弃上清，加入Inoue Buffer重悬菌体（轻柔振荡，不可太剧烈，如有菌体沉淀无法轻柔振荡下来，可忽略该沉淀）10、2500g（RCF），4oC，10min离心收集菌体（离心机需要提前开始预冷）11、弃上清，加入Inoue Buffer重悬菌体（轻柔振荡，不可太剧烈，如有菌体沉淀无法轻柔振荡下来，可忽略该沉淀）12、加入DMSO轻轻旋均匀（DMSO在冬季会凝固，请在烘箱中预热使其融化），冰上静置10min（加入比例为250ml的菌液加入1500ul，50ml菌液加入300ul）13、开始分装（分装使用的EP管架用液氮预冷，每管分装120ul，分装须迅速；分装完毕后将感受态细胞速冻于液氮中以提高其转化效率）（分装时需小心谨慎，以防液氮冻伤）14、暂存于-80oC中，检测合格后，存于指定区域，并登记感受态细胞检测流程1、从制备好的感受态细胞中随机取出2管，并准备好对应质粒（一般使用pUC19）2、将随机取出的2管感受态细胞混合于一管中（如果感受态细胞未解冻，请置于手中握化），准备好需要转化的EP管，每管分装60ul感受态细胞，并加入对应质粒（加入后需要混匀），做好标记（加入质粒）；剩余感受态作为control3、冰上静置25min（此时，可将要使用的平板在37o C培养箱中正置培养至需要使用时）4、42o C热激1min5、冰上静置5min6、每管转化的感受态加入500ul的无抗液体LB培养基7、37oC，100RPM摇床孵育60min8、涂平板，转化质粒涂对应抗性的平板，control涂K、Amp、Chl、（无抗）9、看结果（为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μg DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率.计算公式：转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。

2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。

5。

注意:接种比例不得大于1:１0。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。

4、4℃５000g离心５分钟。

用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。

分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。

含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。

28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。

感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。

感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。

(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。