可溶性酸性转化酶SAI基因在不同甘蔗基因型中表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(12): 2162−2170 / ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102604), 国家国际合作项目(2009DFA30820, 2013DFA31600), 广西自然科学基金项目(2011GXNSFF018002, 2013NXNSFAA019073), 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科产1123008-1, 桂科攻1222009-1B), 广西八桂学者特聘专家专项经费和广西农业科学院团队项目(桂农科2011YT01)资助。

*通讯作者(Corresponding authors): 杨丽涛, E-mail: liyr@; 李杨瑞, E-mail: liyr@第一作者联系方式: E-mail: tanqinliang06@Received(收稿日期): 2013-01-29; Accepted(接受日期): 2013-06-09; Published online(网络出版日期): 2013-09-29. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20130929.1537.008.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.02162甘蔗ABA 信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析谭秦亮1 李长宁1,2 杨丽涛1,2,* 李杨瑞1,2,*1广西大学农学院 / 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西南宁530005; 2中国农业科学院甘蔗研究中心 / 农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 / 广西作物遗传改良生物技术重点实验室 / 广西甘蔗遗传改良重点实验室, 广西南宁530007摘 要: 蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA 信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。

亚洲百合鳞茎发育和低温贮藏过程中蔗糖代谢机制研究蔗糖是高等植物光合作用的主要产物,是百合植株碳水化合物长距离运输至鳞茎的主要形态,系统研究蔗糖代谢机制对于明确百合鳞茎发育机理、生产优质种球具有重要意义。

本试验研究了不同缓冲液、pH值、时间及温度对百合鳞茎中SAI(可溶性酸性转化酶)活性的影响；研究了不同规格亚洲百合‘穿梭’鳞茎生长发育及低温贮藏过程的蔗糖代谢。

主要研究结果如下：首次建立了百合鳞茎SAI活性检测体系。

以百合外层鳞片为试材,研究了不同提取及反应缓冲液、pH值和反应时间、温度对百合鳞茎中SAI活性的影响。

结果表明,最适提取缓冲液为pH 8.0的Hepes-NaOH;最佳反应缓冲液为pH 4.8的HAc-K3PO4,最适反应温度为40℃,最适反应时间为30 min。

该结果与其他植物中的SAI活性检测方法有所不同,说明不同植物的SAI对外界因素的敏感度不同,也进一步表明了建立百合鳞茎SAI活性检测体系的重要性。

不同规格的百合鳞茎发育进程不同。

对鳞茎Ⅰ[m=(15±1)g]而言,鳞茎体积的膨大和重量的增加是从现蕾期开始的,植株现蕾期至花后20 d为其快速生长期；而鳞茎Ⅱ[m=(4.5-4-1)g]体积的膨大和重量的增加则是从出苗后20 d开始,其快速生长期为出苗后20 d至80 d且鳞茎Ⅱ迅速增长时期较鳞茎Ⅰ早。

在百合鳞茎生长发育过程中,鳞茎Ⅰ和鳞茎Ⅱ的淀粉、蔗糖含量变化趋势基本一致。

在发育前期(鳞茎Ⅰ栽种期至开花期,鳞茎Ⅱ栽种期至出苗后60 d)淀粉降解,蔗糖总体呈下降趋势；鳞茎发育后期(鳞茎Ⅰ开花期至枯萎期,鳞茎Ⅱ出苗后60 d至枯萎期)蔗糖上升,淀粉含量上升,说明淀粉与蔗糖代谢密切相关。

SAI和SuSy(蔗糖合成酶)是百合鳞茎蔗糖代谢关键酶。

在鳞茎发育期间,SuSy分解方向的活性远远小于合成方向的活性,说明SuSy主要起到分解蔗糖的作用。

SAI活性变化趋势与SuSy分解方向活性变化趋势基本一致,但其活性显著高于SuSy活性,一方面说明在百合鳞茎发育过程中SAI在蔗糖分解代谢上起主要作用,另外可以看出鳞茎中蔗糖代谢的分解酶类具有相同的变化趋势,协同作用参与蔗糖代谢过程。

㊀第45卷第2期2023年4月中国糖料Sugar Crops of China Vol.45,No.2Apr. 2023doi :10.13570/ki.scc.2023.02.007http :// 收稿日期:2022-06-17基金项目:2019年海南省基础与应用基础研究计划(自然科学领域)高层次人才项目(2019RC 301);国家重点研发计划项目(2018YFD 1000503);财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系(甜菜)建设项目(CARS -170301)资助㊂第一作者:赵婷婷(1983-),女,山西长治人,助理研究员,博士,研究方向为甘蔗基因工程,E -mail :zhaotingting @ ㊂通信作者:张树珍(1965-),女,云南楚雄人,研究员,博士,研究方向为甘蔗生物技术,E -mail :zhangsz 2007@ ㊂甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性及糖含量动态变化特征分析赵婷婷,杨本鹏,王俊刚,甘仪梅,张树珍(中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室/海南热带农业资源研究院海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室/中国热带农业科学院甘蔗研究中心,海口571101)摘㊀要:为研究甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性及糖含量变化,解析甘蔗 源-库 糖分积累调控机制,分别对分蘖期㊁拔节期㊁成熟期 新台糖22号 甘蔗成熟叶片中蔗糖磷酸合成酶㊁蔗糖合成酶㊁酸性转化酶㊁中性转化酶的活性及叶片中蔗糖和还原糖含量采用比色法进行测定㊂结果表明随着茎秆生长及糖分积累,甘蔗叶片中蔗糖磷酸合成酶活性从10.3μmol /(gFW ㊃h )逐渐升高至14.6μmol /(gFW ㊃h ),成熟期甘蔗叶片中蔗糖磷酸合成酶活性显著降低至5.3μmol /(gFW ㊃h );甘蔗叶片中蔗糖合成酶在茎秆中糖分积累时蔗糖合成活性由14.0μmol /(gFW ㊃h )降低至9.1μmol /(gFW ㊃h );分蘖期甘蔗叶片中蔗糖转化酶活性介于26.0~30.2μmol /(gFW ㊃h ),而成熟期甘蔗叶片中蔗糖转化酶活性显著降低至13.9~16.4μmol /(gFW ㊃h )㊂甘蔗叶片中蔗糖含量在茎秆中糖分积累时达到最高20.57mg /gFW ;分蘖期甘蔗叶片中还原糖含量2.1mg /gFW ,而拔节期㊁成熟期甘蔗叶片中还原糖含量分别升高至5.45mg /gFW 和7.15mg /gFW ㊂甘蔗叶片中蔗糖磷酸合成酶活性与蔗糖含量呈正相关,表明甘蔗叶片中蔗糖磷酸合成酶直接调控蔗糖合成㊂研究结果表明叶片中蔗糖磷酸合成酶及蔗糖含量积极响应茎秆中糖分积累信号,蔗糖磷酸合成酶是甘蔗 源-库 糖分积累调控的关键作用靶点,进一步解析甘蔗叶片中蔗糖磷酸合成酶调控网络可为甘蔗糖分性状改良提供理论依据㊂关键词:甘蔗;蔗糖代谢;蔗糖代谢酶;糖含量中图分类号:S 566.1㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A 文章编号:1007-2624(2023)02-0047-07赵婷婷,杨本鹏,王俊刚,等.甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性及糖含量动态变化特征分析[J ].中国糖料,2023,45(2):47-53.ZHAO Tingting ,YANG Benpeng ,WANG Jungang ,et al.The change characteristic analysis of enzymes for sucrose metabolism activity and sugar contents in sugarcane leaves [J ].Sugar Crop of China ,2023,45(2):47-53.0㊀引言甘蔗(Saccharum spp .)是一种高光效C 4植物,是世界上重要的糖料和能源作物,甘蔗产糖约占我国食糖总量的80%以上㊂甘蔗茎秆中糖含量直接决定甘蔗品种的经济价值㊂蔗糖是甘蔗光合同化物合成㊁运输㊁积累的主要形式[1]㊂甘蔗茎秆中积累的糖分来自于源端叶中光合作用合成的蔗糖,叶片中蔗糖含量决定韧皮部蔗糖装载的量,进一步影响库端茎秆中蔗糖的利用及积累㊂蔗糖代谢酶催化叶片中蔗糖的合成与分解,直接调控叶片中蔗糖含量和进入韧皮部装载的蔗糖量㊂对不同生长时期甘蔗叶片中催化蔗糖合成与分解的酶活性及糖84中国糖料2023含量动态变化特征进行分析,可以揭示甘蔗叶片中糖分合成对茎秆中糖分积累的响应及调控模式㊂甘蔗叶片中蔗糖含量受蔗糖合成相关酶和分解相关酶的动态调控㊂蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS;EC2.4.1.14)和磷酸蔗糖磷酸酶(Sucrose phosphate phosphatase,SPP;EC3.1.3.24)催化蔗糖合成,SPS是蔗糖合成调控的关键酶[2]㊂蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SS;EC2.4.1.13)既可以将蔗糖催化水解成UDP-葡萄糖(ADP-葡萄糖)和果糖,又可以将UDP-葡萄糖和果糖催化合成蔗糖[3]㊂蔗糖可以被转化酶(Invertase,INV;EC3.2.1.26)不可逆分解为葡萄糖和果糖,供给植物细胞的生长发育营养需求及细胞内己糖的积累㊂根据最适反应pH值,可以将INV分为酸性转化酶(Soluble acidic invertase,SAI)和中性转化酶(Neutral Invertase,NI),酸性转化酶包括细胞壁转化酶和液泡转化酶,中性转化酶存在于细胞质中㊂甘蔗叶片和茎秆中均存在SPS㊁SS㊁SAI㊁NI活性,蔗糖代谢酶活性共同决定植物中蔗糖含量和生物量的积累[3-6]㊂源叶中SPS直接调控蔗糖合成速率㊁蔗糖含量及蔗糖输出量,SS参与调控叶片生长发育,调节叶片中蔗糖和果糖含量,参与淀粉及纤维素等多糖的合成[7-9]㊂INV调节叶片中糖稳态㊁碳水化合物分配㊁响应细胞内外糖信号㊁激素信号,调控叶片的生长发育㊁衰老及对逆境的响应等生物学过程[10]㊂叶片中SPS㊁SS㊁SAI㊁NI分工协作,共同调控叶片中蔗糖和己糖含量,以不同方式响应细胞内糖信号,动态调节叶片中蔗糖合成输出及碳水化合物分配以维持细胞正常生长需要[3]㊂甘蔗生长早期,叶片中光合作用合成的蔗糖主要用于植株生长发育,后期主要用于糖分的积累㊂甘蔗中蔗糖合成㊁运输㊁积累形成一种 源-库 反馈平衡调节机制㊂源端叶片中蔗糖合成调节蔗糖供给,库端茎秆中蔗糖积累反馈调节源端蔗糖合成速率[11]㊂研究表明甘蔗中 源-库 平衡机制决定甘蔗茎秆中糖含量[11-12]㊂然而甘蔗中 源-库 反馈调节糖分分配,并最终决定茎秆中糖分积累水平的关键作用因子及分子调控机制还不清楚㊂蔗糖代谢酶控制甘蔗叶片中蔗糖含量并影响甘蔗茎秆中糖分积累,为了探讨甘蔗叶片中蔗糖代谢酶对 源-库 糖分合成与积累的响应机制,对甘蔗不同生长时期叶片中的四种蔗糖代谢酶活性和糖含量动态变化进行分析,以期解析甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性动态变化特征㊁酶活性差异㊁糖含量及对茎秆中糖分积累的响应方式,为进一步系统解析甘蔗中 源-库 糖分合成与积累反馈机制奠定基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料供试甘蔗品种 新台糖22 ,种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所临高试验基地㊂采用随机区组排列,设3个重复,株距0.35m,行距1.3m,每行10m,肥力中等㊂1.2㊀试验设计在甘蔗植株生长的分蘖期㊁拔节前期㊁拔节后期㊁成熟期,在光照充足条件下,取样时间上午9 11点,随机选取供试品种9株生长健壮甘蔗植株+1叶,剪取叶中部位置,去叶脉,将9片叶混合剪碎,各称取1g装入2mL离心管中,放入液氮中冻存备用㊂1.3㊀测定方法分别测定分蘖期㊁拔节前期㊁拔节后期㊁成熟期植株+1叶中的蔗糖㊁还原糖含量及蔗糖合成酶活性㊂将1g剪碎的叶片置于研钵中充分研磨成粉末,糖分提取按照Zhu等[13]的方法,蔗糖含量测定参考van Handel[14]的方法,还原糖含量测定参考王俊刚等[15]的方法㊂酶液提取方法及酶促反应体系参考Zhu等[13]的方法,蔗糖磷酸合成酶㊁蔗糖合成酶活性以37ħ最适pH条件下,反应1h合成的蔗糖量来表示,单位为μmol蔗糖/(gFW㊃h)㊂酸性转化酶㊁中性转化酶以37ħ最适pH条件下,反应1h生成的葡萄糖的量来表示,单位为μmol葡萄糖/(gFW㊃h)㊂1.4㊀数据分析利用Excel和SPSS软件对数据进行统计分析及作图㊂㊀第45卷,第2期赵婷婷,等:甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性及糖含量动态变化特征分析2㊀结果与分析2.1㊀不同生长时期甘蔗叶片中四种蔗糖代谢酶活性变化分析为解析甘蔗不同生长时期叶片中的蔗糖代谢酶活性变化(图1SPS ),分别测定分蘖期㊁拔节前期㊁拔节后期㊁成熟期甘蔗植株+1叶中的四种蔗糖代谢酶活性,结果表明从分蘖期到拔节期甘蔗叶片中SPS 酶活性逐渐升高,到拔节后期甘蔗叶片中SPS 酶活性显著升高(p <0.01),合成蔗糖活性达到最高值14.6μmol /(gFW ㊃h ),而在成熟期甘蔗叶片中SPS 酶活性显著降低(p <0.01),合成蔗糖活性降至5.3μmol /(gFW ㊃h ),表明随着甘蔗茎秆库中糖分快速积累,源叶中SPS 酶响应库中糖分积累需求促进源叶中蔗糖合成,在甘蔗茎秆库中糖分积累完成后,源叶中SPS 酶活性降低㊂从分蘖期到成熟期源叶中SS 酶活性变化趋势与SPS 活性变化趋势相反(图1SS ),从分蘖期到拔节后期SS 酶活性逐渐降低,在拔节后期SS 酶活性显著降低(p <0.01),合成蔗糖活性达到最低值9.1μmol /(gFW ㊃h ),成熟期时SS 酶活性较前一时期显著升高,合成蔗糖活性达到12.8μmol /(gFW ㊃h ),表明甘蔗叶片中SS 酶在甘蔗分蘖期和成熟期叶片蔗糖代谢过程中发挥重要作用,在甘蔗茎秆中糖分快速积累时期,叶片中低SS 酶活性可能有利于蔗糖的快速供给㊂对不同生长时期甘蔗叶片中的SAI 酶活性差异进行分析(图1SAI ),结果表明SAI 酶活性在分蘖期㊁拔节前期㊁拔节后期甘蔗叶片中的活性保持稳定没有变化,生成葡萄糖活性介于24.3~26.0μmol /(gFW ㊃h ),而在成熟期甘蔗叶片中SAI 酶活性显著降低,生成葡萄糖活性降低至16.4μmol /(gFW ㊃h ),表明在甘蔗快速生长及茎秆中糖分快速积累时期,叶片中SAI 酶活性都较高,参与调控叶片中蔗糖及己糖代谢,而在成熟期甘蔗叶片中低SAI 酶活性降低甘蔗叶片中蔗糖分解及己糖代谢㊂图1㊀不同生长时期甘蔗叶片中四种蔗糖代谢酶活性变化分析Fig.1㊀The activity change analysis of four sucrose metablismenzymes in leaves of sugarcane plants at different growth periods94中国糖料http :// 2023对不同生长时期甘蔗叶片中的NI 酶活性差异进行分析(图1NI ),结果表明在分蘖期甘蔗叶片中的NI 蔗糖转化酶活性最高,生成葡萄糖活性达到30.2μmol /(gFW ㊃h ),在拔节前期㊁拔节后期㊁成熟期甘蔗叶片中的NI 酶活性显著降低,生成葡萄糖活性分别为17.2μmol /(gFW ㊃h )㊁20.3μmol /(gFW ㊃h )㊁13.9μmol /(gFW ㊃h ),表明叶片中NI 蔗糖转化酶在分蘖期甘蔗生长过程中发挥重要作用,在拔节期和成熟期叶片中NI 酶活性降低可能有利于促进甘蔗茎秆中糖分积累㊂2.2㊀不同生长时期甘蔗植株叶片中蔗糖代谢酶活性差异分析对不同生长时期甘蔗叶片中的SPS ㊁SS ㊁SAI ㊁NI 酶活性差异进行分析,结果表明在分蘖期㊁拔节期甘蔗叶片中的SAI ㊁NI 转化酶活性显著高于SPS ㊁SS 酶活性(图2),在成熟期甘蔗叶片中SS ㊁SAI ㊁NI 酶活性显著高于SPS 酶活性(图2),分蘖期NI 活性高于SAI ,拔节期和成熟期SAI 活性高于NI ,表明不同生长甘蔗叶片中SPS ㊁SS ㊁SAI ㊁NI 共同调控蔗糖代谢,且蔗糖转化酶SAI ㊁NI 在不同生长时期甘蔗叶片生长发育过程中起重要作用㊂图2㊀甘蔗叶片中四种蔗糖代谢酶活性差异分析Fig.2㊀The activity differences analysis of four sucrose metabolism enzymes in sugarcane leaves2.3㊀不同生长时期甘蔗叶片中糖含量分析分别对分蘖期㊁拔节前期㊁拔节后期㊁成熟期甘蔗叶片中的蔗糖和还原糖含量进行测定,结果表明在甘蔗叶片中,与分蘖期相比,在拔节前期甘蔗茎秆中糖分开始积累时,叶片中蔗糖含量显著降低,表明可能由于茎秆库糖分需求增加而导致叶片中蔗糖快速输出,致使叶片中蔗糖含量降低;而在拔节后期甘蔗叶片中蔗糖含量显著升高,达到最高值,有利于促进茎秆中糖分积累;在成熟期甘蔗茎秆中糖分积累完成后,叶片中蔗糖含量显著降低(见表1)㊂从分蘖期到成熟期甘蔗叶片中还原糖含量变化趋势与蔗糖含量相反,拔节期蔗糖含量下降时还原糖含量上升,蔗糖含量升高时还原糖含量降低,成熟期甘蔗叶片中蔗糖含量下降时还原糖含量上升(见表1)㊂甘蔗叶片中蔗糖与还原糖含量变化趋势正好相反,表明当叶片中蔗糖含量降低时,部分蔗糖被转化为还原糖,用于叶片细胞自身生长发育需要㊂05㊀第45卷,第2期赵婷婷,等:甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性及糖含量动态变化特征分析表1㊀不同生长时期甘蔗叶片中蔗糖和还原糖含量(mg/gFW)Table1㊀The sucrose and reducing sugar contents in leaves of sugarcane plants at different growth stages糖含量Sugar content分蘖期Tillering stage拔节前期Early elongation stage拔节后期Late elongation stage成熟期Maturation stage蔗糖含量Sucrose content17.64ʃ0.08Aa 6.53ʃ0.11Bb20.57ʃ0.28Cc17.86ʃ0.18aADd还原糖含量Reducingsugar content2.1ʃ0.1Aa9.86ʃ0.05Bb 5.45ʃ0.14Cc7.15ʃ0.1Dd2.4㊀甘蔗叶片中糖含量与蔗糖代谢酶活性相关性分析SPS蔗糖磷酸合成酶是甘蔗叶片中蔗糖合成的关键调控酶,对SPS酶活性与叶片中蔗糖含量相关性进行分析,结果表明在分蘖期㊁拔节后期㊁成熟期甘蔗叶片中,SPS酶活性与蔗糖含量呈正相关(r=0.804),进一步分析分蘖期㊁拔节后期㊁成熟期甘蔗叶片中SS㊁SAI㊁NI酶活性与蔗糖含量相关性,结果表明SS酶蔗糖合成活性与蔗糖含量呈负相关(r=-0.986),SAI㊁NI酶活性与蔗糖含量相关性低㊂对分蘖期㊁拔节后期㊁成熟期甘蔗叶片中SPS㊁SS㊁SAI㊁NI酶活性与还原糖含量相关性进行分析表明, SAI和NI酶活性与叶片中还原糖含量呈负相关(r=-0.857,r=-0.998),SPS和SS酶活性与叶片中还原糖含量相关性低㊂3㊀讨论甘蔗作为一种国内外重要的糖料作物,其糖分性状改良一直是甘蔗研究目标与热点㊂经过C14同位素标记分析表明甘蔗叶片中合成的蔗糖直接装载进入韧皮部进行长距离运输至茎秆储藏薄壁细胞中积累,绝大部分没有经过蔗糖水解及重新合成的过程[1]㊂因此甘蔗茎秆中积累的蔗糖量直接受叶片中光合作用蔗糖合成速率及韧皮部中蔗糖输出量的调控㊂已有研究表明甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性高低与甘蔗品种糖含量差异相关[13-14,16-18],本研究主要解析甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性和糖含量动态变化特征及叶片中蔗糖代谢酶活性变化是否响应茎秆中糖分积累进行探讨㊂SPS是植物调控蔗糖合成的关键酶,影响植物中糖分积累及最终产量㊂对6个不同糖含量印度甘蔗品种叶在240 420天的SPS酶活动态分析发现,从240天至360天SPS活性逐渐升高,到420天SPS活性显著下降[19]㊂本研究对甘蔗品种 新台糖22 分蘖期到成熟期叶片中SPS酶活性进行分析表明,从分蘖期到拔节期酶活性升高,成熟期时显著降低,研究结果与Kalwade[19]一致㊂这些研究表明甘蔗源叶中SPS活性高低与库中蔗糖积累呈正相关㊂当库中蔗糖含量升高时,源端蔗糖合成活性也升高,在甘蔗生长后期,蔗糖积累完成后,源叶中SPS活性显著降低㊂这表明叶片中SPS酶活性变化响应茎秆中糖分积累,是 源-库 间糖分输出与积累调控的关键靶点,进一步揭示甘蔗叶片中调控SPS的分子作用网络,挖掘调控甘蔗糖分积累的关键因子,有利于促进甘蔗糖分性状改良㊂Kalwade[19]研究表明不同印度甘蔗品种叶片中SS酶活性变化趋势与SPS酶活性趋势一致,随着甘蔗茎秆中糖分积累SS酶活性逐渐升高,在茎秆中糖分积累完成后SS酶活性显著下降,并提出叶片中SPS和SS 共同调控甘蔗茎秆中糖分积累㊂而在本研究中不同生长时期 新台糖22 甘蔗叶片中SS酶活性变化与SPS 酶活性变化趋势不一致,表明甘蔗叶片中SS酶活性变化调控机制与叶片自身的生长发育进程更为密切㊂已有研究表明,不同甘蔗品种叶片中转化酶活性,随着茎秆中糖分积累及甘蔗的成熟转化酶活性逐渐降低[13,19],本研究中 新台糖22 甘蔗叶片中SAI和NI活性也是随着甘蔗生长及成熟逐渐降低,成熟期叶片中SAI㊁NI酶活性最低㊂进一步对不同生长时期中甘蔗叶片中的SPS㊁SS㊁SAI㊁NI酶活性差异进行比较分析,发现在甘蔗叶片中SAI㊁NI蔗糖转化酶活性高于SPS㊁SS酶活性,表明甘蔗叶片中SAI和NI参与调控甘蔗叶片生长发育,甘蔗生长早期活性高有利于己糖的快速利用,成熟期活性低有利于促进甘蔗茎秆中糖分1525中国糖料2023积累㊂对甘蔗叶片中的糖含量变化特征进行分析表明,叶片中蔗糖含量响应茎秆中糖分积累信号,叶片中蔗糖合成受茎秆中糖分积累的反馈调节㊂同时研究表明在分蘖期㊁拔节后期㊁成熟期甘蔗叶片中:SPS活性变化与蔗糖含量变化呈正相关,表明SPS直接调控叶片中蔗糖含量;SS蔗糖合成酶活性与叶片中蔗糖含量负相关,可能与SS多参与调控植物中多糖合成有关[7];SAI和NI水解蔗糖产生还原糖,而SAI和NI酶活性变化与还原糖含量呈负相关,表明SAI和NI水解产生的己糖被叶细胞大量吸收利用㊂目前对重要作物如水稻㊁玉米㊁小麦等的蔗糖代谢酶相关研究,无论是从基因水平还是酶学活性调控等方面的研究已经较为深入,而对甘蔗中蔗糖代谢酶相关家族成员的研究,无论是基因功能㊁转录水平还是蛋白水平的调控研究相对滞后㊂今后甘蔗的优良品种选育尤其在糖分改良方面,如果想从常规育种进入分子设计育种或生物育种,必需解析甘蔗品质性状改良的关键基因和蛋白作用网络才能促进甘蔗品种的更新迭代,进一步解析甘蔗中SPS调控机制并挖掘调控SPS关键作用因子,势必促进甘蔗的糖分性状改良,从根本上进一步提升甘蔗品质㊂4　结论甘蔗叶片中SPS活性和蔗糖含量响应茎秆中蔗糖积累信号,在茎秆中糖分快速积累时期叶片中蔗糖磷酸合成酶活性和蔗糖含量达到峰值,蔗糖磷酸合成酶是甘蔗 源-库 间蔗糖合成与积累调控关键靶点;叶片中SS㊁SAI㊁NI活性变化响应叶片自身生长发育需要,调控甘蔗整个生长发育进程㊂参考文献1HARRT C E KORTSCHAK H H P.Sugar gradients and translocation of sucrose in detached blades of sugarcane J .Plant Physiology 1964393460-474.2RUAN Y L.Sucrose metabolism Gateway to 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Biochem 1968222280-283.15王俊刚张树珍杨本鹏等.35-二硝基水杨酸 DNS 法测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量 J .甘蔗糖业20085 45-49.35㊀第45卷,第2期赵婷婷,等:甘蔗叶片中蔗糖代谢酶活性及糖含量动态变化特征分析16牛俊奇黄静丽赵文慧等.甘蔗工艺成熟期SS和SPS酶活性与糖分积累的相关性研究 J .生物技术通报201531 9105-110.17牛俊奇苗小荣王道波等.高㊁低糖甘蔗品种伸长期糖分积累特征及代谢相关酶活性分析 J .江苏农业学报2019 353537-543.18VERMA A K UPADHYAY S K VERMA P C et al.Functional analysis of sucrose phosphate synthase SPS and sucrose synthase SS in sugarcane Saccharum cultivars J .Plant Biology 2011132325-332.19KALWADE S B DEVARUMATH R M.Functional analysis of the potential enzymes involved in sugar modulation in high and low sugarcane cultivars J .Applied biochemistry and biotechnology 201417241982-1998.The Change Characteristic Analysis of Enzymes for Sucrose Metabolism Activity andSugar Contents in Sugarcane Leaves ZHAO Tingting,YANG Benpeng,WANG Jungang,GAN Yimei,ZHANG Shuzhen (Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops,Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory for Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Hainan Province,Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources/Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Ministry ㊀㊀㊀of Agriculture,Haikou571101)Abstract:To analyze the changing features of sucrose metabolism enzymes and sugar contents in sugarcane leaves at different growth stages and clarify the source-sink sugar accumulation mechanism in sugarcane,the activities of sucrose phosphate synthase(SPS),sucrose synthase(SS),soluble acidic invertase(SAI)and neutral invertase(NI)and sugar contents in mature leaves from ROC22 sugarcane plants at tillering, elongation and mature growth stages were measured with colorimetric methods.The results showed that the sucrose synthesis activity of SPS were increased from10.3μmol/(gFW㊃h)to14.6μmol/(gFW㊃h)in leaves of sugarcane plants from tillering stage to elongation stage and reached the maximum at the sucrose rapid accumulation stage.The SPS activity in sugarcane leaves was decreased greatly to5.3μmol/(gFW㊃h)in plants at maturation stage.The sucrose synthesis activities of SS in sugarcane leaves were decreased from 14.0μmol/(gFW㊃h)to9.1μmol/(gFW㊃h)the plants at the sugar accumulation growth stage.The activities of SAI and NI ranged from26.0to30.2μmol/(gFW㊃h)in sugarcane plants at tillering growth stage and decreased to13.9~16.4μmol/(gFW㊃h)at mature stage.The sucrose content reached the highest of 20.57mg/gFW in sugarcane leaves from plants at sugar accumulation elongation growth stage.The reducing sugar content was2.1mg/gFW in leaves at tillering growth stage and increased to5.45mg/gFW and 7.15mg/gFW at elongation and maturation growth stages,respectively.The SPS activity changes were positive correlation with sucrose content changes in leaves of sugarcane plants.It indicated that SPS directly regulated the sucrose content in sugarcane leaves.These results showed that the SPS activity and sucrose content in sugarcane leaves actively responded to the sugar accumulation signals in sugarcane stalks.It indicates that SPS in sugarcane leaves is the key regulation target during source-sink sugar synthesis and accumulation.The SPS activity and sucrose content in sugarcane leaves reaches the maximum during sugar rapid accumulation in sugarcane stalks. Further clarifying the molecular network regulating SPS activity in sugarcane leaves will provide theoretical basis for improvement of sugar content in sugarcane.Key words:sugarcane;sucrose metabolism;sucrose metabolism enzyme;sugar content。

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(３):１１~１８ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０３.００２收稿日期:２０２３－０３－２７基金项目:枣庄学院山东省石榴精深加工工程技术研究中心/山东省石榴资源综合开发工程实验室开放课题(ＳＬＫＦ２０２１００１)ꎻ山东省重点研发计划项目(２０２２ＴＺＸＤ００９)ꎻ山东省农业科学院农业科技创新工程项目(ＣＸＧＣ２０２３Ａ１２)ꎻ山东省农业科学院揭榜科技难题项目(ＳＨＪＢ２０２２－４２)作者简介:冯立娟(１９８２ )ꎬ女ꎬ山东聊城人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要研究方向为石榴种质资源评价与创新利用研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｆｅｎｇｌｊ１２３０＠１２６.ｃｏｍ通信作者:郭琳(１９７３ )ꎬ女ꎬ山东郓城人ꎬ高级农艺师ꎬ主要研究方向为果树栽培技术推广ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｚｙｃｎｙｚｆ＠１６３.ｃｏｍ谭伟(１９８５ )ꎬ女ꎬ山东聊城人ꎬ副教授ꎬ主要研究方向为石榴果实品质形成机理ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｔａｎｗｅｉｓｄｕ＠１６３.ｃｏｍ石榴蔗糖代谢相关酶ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族鉴定与表达分析冯立娟１ꎬ２ꎬ李英朋３ꎬ王传增４ꎬ尹燕雷２ꎬ郭琳５ꎬ谭伟１(１.枣庄学院山东省石榴精深加工工程技术研究中心/山东省石榴资源综合开发工程实验室ꎬ山东枣庄㊀２７７１６０ꎻ２.山东省果树研究所ꎬ山东泰安㊀２７１０００ꎻ３.冠县店子镇农林水技术服务站ꎬ山东冠县㊀２５２５００ꎻ４.山东省农业科学院ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ５.郓城县农业农村局ꎬ山东郓城㊀２７４７００)㊀㊀摘要:蔗糖磷酸合成酶(ＳＰＳ)和蔗糖转化酶(ＩＮＶ)是蔗糖代谢的关键调控酶ꎬ在植物生长发育过程中起重要作用ꎮ本研究利用生物信息学和荧光定量ＰＣＲ等分子手段ꎬ鉴定石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员ꎬ分析其理化性质㊁保守结构域㊁保守基序㊁二级结构㊁亚细胞定位㊁系统进化关系和表达模式ꎮ结果表明ꎬ从石榴基因组中鉴定出４个ＳＰＳ基因和１１个ＩＮＶ基因ꎬ其编码蛋白均为不稳定蛋白ꎬ具有典型的保守结构域ꎬ家族成员间特征ｍｏｔｉｆ数量和种类大致相同ꎬ蛋白结构高度保守ꎻ这些蛋白不均匀地分布在染色体上ꎬ均定位于叶绿体中ꎬ二级结构主要由α－螺旋和无规则卷曲组成ꎮ石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员间存在不同程度的亲缘关系ꎬ与巨桉同源性较高ꎻ不同ＳＰＳ和ＩＮＶ基因在石榴果实不同发育时期的表达模式存在差异ꎬＰｇＩＮＶ３在９月１５日(果实增大期)表达水平最高ꎬ显著高于其他时期ꎮ本研究结果对解析石榴果实中蔗糖代谢的分子机理具有重要意义ꎮ关键词:石榴ꎻＳＰＳ基因ꎻＩＮＶ基因ꎻ生物信息学分析ꎻ基因表达中图分类号:Ｓ６６５.４:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０３－００１１－０８ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｕｃｒｏｓｅＰｈｏｓｐｈａｔｅＳｙｎｔｈａｓｅ(ＳＰＳ)ａｎｄＩｎｖｅｒｔａｓｅ(ＩＮＶ)ＧｅｎｅＦａｍｉｌｉｅｓｉｎＰｏｍｅｇｒａｎａｔｅＦｅｎｇＬｉｊｕａｎ１ꎬ２ꎬＬｉＹｉｎｇｐｅｎｇ３ꎬＷａｎｇＣｈｕａｎｚｅｎｇ４ꎬＹｉｎＹａｎｌｅｉ２ꎬＧｕｏＬｉｎ５ꎬＴａｎＷｅｉ１(１.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｏｍｅｇｒａｎａｔｅＤｅｅｐＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒꎬＺａｏｚｈｕａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ/ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＰｏｍｅｇｒａｎａｔｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＥｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙꎬＺａｏｚｈｕａｎｇ２７７１６０ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈａｎｄｏｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｏｍｏｌｏｇｙꎬＴａｉａｎ２７１０００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＤｉａｎｚｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｅｒｖｉｃｅＳｔａｔｉｏｎｏｆＧｕａｎｘｉａｎＣｏｕｎｔｙꎬＧｕａｎｘｉａｎ２５２５００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ５.ＹｕｎｃｈｅｎｇＢｕｒｅａｕｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＹｕｎｃｈｅｎｇ２７４７００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｓｕｃｒｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ(ＳＰＳ)ａｎｄｓｕｃｒｏｓｅｉｎｖｅｒｔａｓｅ(ＩＮＶ)ａｒｅｋｅｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｎｚｙｍｅｓｏｆｓｕｃｒｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄｆｌｕｏｒｅｓ￣ｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅＳＰＳａｎｄＩＮＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｏｆｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅａｎｄａｎａ￣ｌｙｚｅｔｈｅｉｒｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓꎬｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｓꎬｃｏｎｓｅｒｖｅｄｍｏｔｉｆｓꎬｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｓｕｂ￣ｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎꎬｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ４ＳＰＳｇｅｎｅｓａｎｄ１１ＩＮＶｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｆｒｏｍｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅꎬｗｈｏｓｅｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅａｌｌｕｎｓｔａｂｌｅｏｎｅｓｗｉｔｈｔｙｐｉｃａｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｓ.Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒａｎｄｔｙｐｅｓｏｆｍｏｔｉｆｓａｍｏｎｇｔｈｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｗｅｒｅｒｏｕｇｈｌｙｔｈｅｓａｍｅꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ.Ｔｈｅｓｅｍｅｍｂｅｒｓｗｅｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｕｎｅｖｅｎｌｙｏｎｃｈｒｏｍｏ￣ｓｏｍｅｓａｎｄｌｏｃａｔｅｄｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ.Ｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓｍａｉｎｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆα￣ｈｅｌｉｃｅｓａｎｄｒａｎｄｏｍｃｕｒｌｓ.ＴｈｅＳＰＳａｎｄＩＮＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｏｆｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅｈａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｇｒｅｅｓｏｆｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐꎬａｎｄｈａｄｈｉｇｈｅｒｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｔｈｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｏｆＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｇｒａｎｄｉｓ.ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆＳＰＳａｎｄＩＮＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｉｎｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅｗｅｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｕｉｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓ.Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＰｇＩＮＶ３ｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｏｎＳｅｐｔｅｍｂｅｒ１５(ｆｒｕｉｔｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔｓｔａｇｅ)ꎬｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｔｈｅｒｐｅｒｉｏｄｓ.Ｔｈｅｓｔｕｄｙｒｅｓｕｌｔｓｈａｄｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｔｏｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｓｕｃｒｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅｆｒｕｉｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＰｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍＬ.ꎻＳＰＳｇｅｎｅꎻＩＮＶｇｅｎｅꎻＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓꎻＧｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀石榴(ＰｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍＬ.)是我国重要的特色果树之一ꎬ果实营养价值高ꎬ保健功能强ꎬ越来越受到消费者青睐[１－２]ꎮ山东石榴栽培历史悠久ꎬ种质资源丰富ꎬ发展面积日益增加ꎬ成为山东省打造乡村振兴齐鲁样板的良好选择ꎮ果实品质提升是提高石榴市场竞争力的重要途径[３－４]ꎮ蔗糖积累是决定石榴果实风味和品质的重要因子ꎬ在其生长发育和产量形成过程中起重要作用[５－６]ꎮ研究石榴果实蔗糖代谢机理对其果实品质调控具有重要的理论意义ꎮ蔗糖磷酸合成酶(ｓｕｃｒｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅꎬＳＰＳ)催化尿苷二磷酸葡糖(ＵＤＰＧ)和果糖－６－磷酸(Ｆ６Ｐ)生成蔗糖－６－磷酸(Ｓ６Ｐ)ꎬＳ６Ｐ在蔗糖磷酸酯酶(ＳＰＰ)作用下不可逆形成蔗糖[７－８]ꎮＳＰＳ是植物体内控制蔗糖合成的关键酶ꎬ由多基因家族编码ꎬ在不同物种中的成员数量不同ꎬ且同一物种中不同家族成员调控蔗糖合成的能力也不相同[９]ꎮ目前已在柑橘[７]和甜樱桃[９]中鉴定出４个ＳＰＳ基因ꎬ在苹果[１０]和梨[１１]中鉴定出８个ＳＰＳ基因ꎮ蔗糖转化酶(ｉｎｖｅｒｔａｓｅꎬＩＮＶ)不可逆地催化蔗糖裂解为果糖和葡萄糖ꎬ分为酸性细胞壁转化酶(ＣＷＩＮ)㊁酸性液泡转化酶(ＶＩＮ)和碱性/中性转化酶(Ａ/Ｎ－Ｉｎｖ)[１２－１３]ꎮ在草莓中鉴定出８个Ｆａ.Ａ/Ｎ－Ｉｎｖ基因家族成员ꎬ其中４个不仅具有组织特异性ꎬ还具有果实发育阶段特异性和品种特异性表达特点ꎬ受细胞分裂素㊁赤霉素和生长素诱导[１４]ꎮ过表达ＳｏＳＰＳ１基因可提高转基因甘蔗叶片的ＳＰＳ活性和蔗糖含量ꎬ提高可溶性酸性转化酶(ＳＡＩ)活性及葡萄糖和果糖水平[１５]ꎮ目前ꎬ国内外在石榴蔗糖代谢方面的研究甚少ꎬＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员鉴定与表达方面的研究尚未见报道ꎮ因此ꎬ本研究基于全基因组测序结果对石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员进行鉴定ꎬ分析其理化性质㊁保守结构㊁二级结构及系统进化关系等生物信息学特性ꎬ并解析其在果实发育过程中的表达模式ꎬ以期为深入研究石榴果实蔗糖积累的分子机制提供理论依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员鉴定从ＮＣＢＩ数据库中下载ＰｇＳＰＳ和ＰｇＩＮＶ蛋白序列ꎬ与石榴全基因组(ＡＳＭ７６５５１３ｖ２)数据库进行同源比对ꎬ初步获得ＳＰＳ和ＩＮＶ候选序列ꎮ通过Ｐｆａｍ在线数据库(ｈｔｔｐ://ｐｆａｍ.ｘｆａｍ.ｏｒｇ)进行进一步的蔗糖合成结构域(ＰＦ００８６２)㊁糖基转移结构域(ＰＦ００５３４)和蔗糖－６－磷酸磷酸水解酶结构域(ＰＦ０５１１６)验证ꎮ利用ＳＭＡＲＴ(ｈｔｔｐ://ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ￣ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ)进行蛋白结构域分析ꎬ去除结构不完整的序列ꎬ最终确定目的基因ꎮ１.２㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员生物信息学分析利用在线软件ＰｒｏｔＰａｒａｍ预测石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白分子量㊁等电点㊁脂肪系数等理化性质ꎮ利用ＣＤＤ和ＭＥＭＥ软件分析保守结构域和保守基序ꎮ利用ＳＯＰＭＡ和Ｐｌａｎｔ－ｍＰＬｏｃ软件预测二级结构和亚细胞定位ꎮ１.３㊀系统进化树构建使用ＭＥＧＡ６.０软件ꎬ采用ＮＪ法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ)对石榴㊁苹果㊁葡萄和巨桉的ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白进行系统进化树构建ꎮＢｏｏｔｓｔｒａｐ值设为２１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀１０００ꎬ去除Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ支持率低于５０％的节点ꎬ显示各分支长度ꎮ１.４㊀荧光定量表达分析２０２２年７月１５日开始采集 泰山红 石榴果实ꎬ分别在７月３０日㊁８月１５日㊁８月３０日㊁９月１５日㊁９月３０日采１次ꎬ直至果实成熟(１０月１５日)ꎮ利用ＲＮＡｐｒｅｐＰｕｒｅＰｌａｎｔＫｉｔ试剂盒提取籽粒总ＲＮＡꎬ反转录成ｃＤＮＡꎮ使用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂盒㊁利用ＢＩＯ－ＲＡＤＩＱ５实时荧光定量ＰＣＲ仪进行ｑＲＴ－ＰＣＲ分析ꎮ每个样品设３次生物学重复ꎮ采用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５.０软件设计引物(表１)ꎮ以石榴Ａｃｔｉｎ(ＧＵ３７６７５０.１)为内参ꎬ默认条件下读取Ｃｔ值ꎬ相对表达量用２－ΔΔＣｔ法计算ꎮ１.５㊀数据处理与分析利用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０进行数据处理及作图ꎬ用ＳＰＳＳ１９.０软件进行差异显著性分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员鉴定从石榴中鉴定出４个ＳＰＳ基因和１１个ＩＮＶ基因ꎬ分别命名为ＰｇＳＰＳ１ ＰｇＳＰＳ４和ＰｇＩＮＶ１ ＰｇＩＮＶ１１(表２)ꎮ通过分析蛋白理化性质可知ꎬ４个ＳＰＳ蛋白的氨基酸数量在１０２９~１０６７之间ꎬ相对分子量在１１４８１６.８０~１１９３３７.１４Ｄａ范围内ꎻ等电点在６.２６~６.７２之间ꎬ均在酸性范围内ꎻ脂肪系数在８４.８７~８７.９２之间ꎬ不稳定系数在４２.６０~４９.６５范围内ꎬ均为不稳定蛋白ꎮ１１个ＩＮＶ家族成员的氨基酸数量在５３１~６７９范围内ꎬ等电点在５.６２~７.５８之间ꎻ脂肪系数为７９.４８~９４.８０ꎬ不稳定系数介于４３.６２~５５.１６之间ꎬ也均为不稳定蛋白ꎮ表１㊀荧光定量引物基因名称正向引物(５ᶄ－３ᶄ)反向引物(５ᶄ－３ᶄ)ＰｇＳＰＳ２ＣＧＡＴＴＴＣＡＧＧＣＣＣＴＡＡＧＧＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＧＴＡＧＴＣＰｇＳＰＳ４ＧＧＡＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＰｇＩＮＶ２ＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＰｇＩＮＶ３ＣＡＡＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＰｇＩＮＶ４ＴＧＡＡＡＧＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＴＧＣＴＡＴＣＧＴＧＧＴＡＧＣＴＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＴＴＣＰｇＩＮＶ７ＣＴＣＡＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＧＴＣＰｇＩＮＶ９ＣＡＧＧＡＴＧＧＧＴＧＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＴＡＧＰｇＩＮＶ１１ＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＡＣＴＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＡＣＧＡＴＣＴＣＧＣＣＴＴＣＴＡｃｔｉｎＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴ表２㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员特性基因名称基因ＩＤ蛋白ＩＤ氨基酸数相对分子量/Ｄａ等电点脂肪系数不稳定系数ＰｇＳＰＳ１ＸＭ＿０３１５２０９３２.１ＸＰ＿０３１３７６７９２.１１０４７１１６７７６.１１６.５７８６.８６４９.６５ＰｇＳＰＳ２ＸＭ＿０３１５２０９３３.１ＸＰ＿０３１３７６７９３.１１０２９１１４８１６.８０６.７２８６.１０４９.０４ＰｇＳＰＳ３ＸＭ＿０３１５２３５７６.１ＸＰ＿０３１３７９４３６.１１０６７１１９３３７.１４６.４１８７.９２４５.０８ＰｇＳＰＳ４ＸＭ＿０３１５２４８３６.１ＸＰ＿０３１３８０６９６.１１０５７１１８６６９.９７６.２６８４.８７４２.６０ＰｇＩＮＶ１ＸＭ＿０３１５２１８９０.１ＸＰ＿０３１３７７７５０.１６３６７１５００.３５５.６２７９.４８５３.２３ＰｇＩＮＶ２ＸＭ＿０３１５２４４８０.１ＸＰ＿０３１３８０３４０.１６５２７３４７６.０５６.０６８９.０３４３.６２ＰｇＩＮＶ３ＸＭ＿０３１５３０７３７.１ＸＰ＿０３１３８６５９７.１５５９６３６３７.２０６.２６８５.１７４７.９５ＰｇＩＮＶ４ＸＭ＿０３１５３７５９９.１ＸＰ＿０３１３９３４５９.１５６５６４８３９.５５６.４１８１.６５５５.１６ＰｇＩＮＶ５ＸＭ＿０３１５３７６１２.１ＸＰ＿０３１３９３４７２.１５５４６３０９５.４１６.３０８４.０１５０.１１ＰｇＩＮＶ６ＸＭ＿０３１５４１１７０.１ＸＰ＿０３１３９７０３０.１６７１７６３３０.４９６.０５８４.９９４３.８６ＰｇＩＮＶ７ＸＭ＿０３１５４５１８７.１ＸＰ＿０３１４０１０４７.１６３７７２０４３.７０７.５８９２.０３４９.６１ＰｇＩＮＶ８ＸＭ＿０３１５４５１８８.１ＸＰ＿０３１４０１０４８.１５３１６０４６２.５４６.１５９４.８０４８.４６ＰｇＩＮＶ９ＸＭ＿０３１５４７８７３.１ＸＰ＿０３１４０３７３３.１５６９６５１１７.５６６.５８８３.４８５０.１２ＰｇＩＮＶ１０ＸＭ＿０３１５５１５９０.１ＸＰ＿０３１４０７４５０.１６７９７６４６６.３４６.５３８５.０１４６.４９ＰｇＩＮＶ１１ＸＭ＿０３１５５１５９１.１ＸＰ＿０３１４０７４５１.１６７２７５６２４.３２６.５３８５.３１４６.２２２.２㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白保守结构域分析ＰｇＳＰＳ１㊁ＰｇＳＰＳ２和ＰｇＳＰＳ３蛋白属于ＰＬＮ００１４２超级家族成员ꎬ其中ＰｇＳＰＳ１和ＰｇＳＰＳ３包含糖基转移酶(Ｇｌｙｃｏｓ＿ｔｒａｎｓｆ＿１)保守结构域ꎬＰｇＳＰＳ２含Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ＿ＧＴ保守结构域ꎻＰｇ￣ＳＰＳ４也含有Ｇｌｙｃｏｓ＿ｔｒａｎｓｆ＿１保守结构域(图１)ꎮＰｇＩＮＶ５和ＰｇＩＮＶ１０含有Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ＿１００糖基水解酶结构域ꎮ除ＰｇＩＮＶ５外ꎬ其余１０个ＩＮＶ蛋白均含有ＧＤＢ１结构域ꎮ２.３㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白保守基序分析由图２可见ꎬ４个ＳＰＳ家族成员的保守基序数量均为７ꎬ且均为Ｍｏｔｉｆ２㊁Ｍｏｔｉｆ９㊁Ｍｏｔｉｆ１１㊁Ｍｏ￣ｔｉｆ１２㊁Ｍｏｔｉｆ１３㊁Ｍｏｔｉｆ１４和Ｍｏｔｉｆ１５基序ꎮ１１个ＩＮＶ家族成员均包含１２个保守基序ꎬ分别为Ｍｏｔｉｆ１㊁３１㊀第３期㊀㊀㊀㊀冯立娟ꎬ等:石榴蔗糖代谢相关酶ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族鉴定与表达分析图１㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白保守结构域分析图２㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ家族蛋白保守基序分析４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀Ｍｏｔｉｆ２㊁Ｍｏｔｉｆ３㊁Ｍｏｔｉｆ４㊁Ｍｏｔｉｆ５㊁Ｍｏｔｉｆ６㊁Ｍｏｔｉｆ７㊁Ｍｏ￣ｔｉｆ８㊁Ｍｏｔｉｆ９㊁Ｍｏｔｉｆ１０㊁Ｍｏｔｉｆ１１和Ｍｏｔｉｆ１２ꎮ同一基因家族成员间的保守基序数量和种类大致相同ꎮ２.４㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ各成员蛋白的二级结构与亚细胞定位由表３可见ꎬ石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白二级结构主要由α－螺旋㊁β－转角㊁延伸链和无规则卷曲组成ꎬ以α－螺旋和无规则卷曲占比较高ꎻ其中ꎬＰｇ￣ＳＰＳ３及ＰｇＩＮＶ１㊁ＰｇＩＮＶ２㊁ＰｇＩＮＶ６㊁ＰｇＩＮＶ７㊁Ｐｇ￣ＩＮＶ１１各组分占比表现为无规则卷曲>α－螺旋>延伸链>β－转角ꎬ其他蛋白则均表现为α－螺旋>无规则卷曲>延伸链>β－转角ꎮ亚细胞定位预测表明ꎬ石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ家族成员均定位于叶绿体中ꎮ染色体分布显示ꎬＰｇＳＰＳ１和ＰｇＳＰＳ２位于Ｃｈｒ１ꎬ其余两个ＳＰＳ基因位于Ｃｈｒ２ꎮＰｇＩＮＶ１㊁ＰｇＩＮＶ６㊁Ｐｇ￣ＩＮＶ１０㊁ＰｇＩＮＶ１１位于Ｃｈｒ１ꎬＰｇＩＮＶ４和ＰｇＩＮＶ５位于Ｃｈｒ４ꎬＰｇＩＮＶ７和ＰｇＩＮＶ８位于Ｃｈｒ６ꎬＰｇＩＮＶ２㊁ＰｇＩＮＶ３和ＰｇＩＮＶ９分别位于Ｃｈｒ２㊁Ｃｈｒ３和Ｃｈｒ７ꎮ２.５㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因系统进化树分析用４个石榴ＳＰＳ蛋白㊁５个巨桉ＳＰＳ蛋白㊁９个苹果ＳＰＳ蛋白和１０个葡萄ＳＰＳ蛋白构建系统进化树(图３Ａ)ꎬ可将其分为两大类ꎮＰｇＳＰＳ１㊁ＰｇＳＰＳ２和ＰｇＳＰＳ４聚为一类ꎬ其中ＰｇＳＰＳ１和Ｐｇ￣ＳＰＳ２聚为一小类ꎮＰｇＳＰＳ３则与ＥｇＳＰＳ２㊁ＭｄＳＰＳ２和ＭｓＳＰＳ２聚为一类ꎬ亲缘关系较近ꎮ１１个石榴ＩＮＶ蛋白㊁９个巨桉ＩＮＶ蛋白㊁７个苹果ＩＮＶ蛋白和１０个葡萄ＩＮＶ蛋白的系统进化树如图３Ｂ所示ꎬ也主要分为两大类ꎮ在第一大表３㊀石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白二级结构㊀㊀㊀㊀组成和亚细胞定位蛋白二级结构组成成分占比/％α－螺旋β－转角延伸链无规则卷曲亚细胞定位染色体分布ＰｇＳＰＳ１４０.８８７.３５１４.４２３７.３４叶绿体Ｃｈｒ１ＰｇＳＰＳ２４０.７２６.３２１４.０９３８.８７叶绿体Ｃｈｒ１ＰｇＳＰＳ３３９.９３６.４７１３.５９４０.０２叶绿体Ｃｈｒ２ＰｇＳＰＳ４４２.０１６.７２１３.７２３７.５６叶绿体Ｃｈｒ２ＰｇＩＮＶ１３８.８４５.５０１２.７４４２.９２叶绿体Ｃｈｒ１ＰｇＩＮＶ２３６.６５６.４４１６.４１４０.８０叶绿体Ｃｈｒ２ＰｇＩＮＶ３４１.６８６.８０１４.６７３６.８５叶绿体Ｃｈｒ３ＰｇＩＮＶ４４０.５３６.５５１４.８７３８.０５叶绿体Ｃｈｒ４ＰｇＩＮＶ５４２.６０６.６８１３.００３７.７３叶绿体Ｃｈｒ４ＰｇＩＮＶ６３７.２６５.９６１５.６５４１.１３叶绿体Ｃｈｒ１ＰｇＩＮＶ７３９.４０５.９７１５.０７３９.５６叶绿体Ｃｈｒ６ＰｇＩＮＶ８４２.３７６.２１１３.９４３７.４８叶绿体Ｃｈｒ６ＰｇＩＮＶ９４１.８３６.３３１２.６５３９.１９叶绿体Ｃｈｒ７ＰｇＩＮＶ１０３９.６２６.９２１７.３８３６.０８叶绿体Ｃｈｒ１ＰｇＩＮＶ１１３６.９０７.２９１７.５６３８.２４叶绿体Ｃｈｒ１５１㊀第３期㊀㊀㊀㊀冯立娟ꎬ等:石榴蔗糖代谢相关酶ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族鉴定与表达分析Ｐｇ:石榴(Ｐｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍ)ꎻＥｇ:巨桉(Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓｇｒａｎｄｉｓ)ꎻＭｄ:苹果(Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ)ꎻＭｓ:野生苹果(Ｍａｌｕｓｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ)ꎻＶｖ:葡萄(Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ)ꎻＶｒ:河岸葡萄(Ｖｉｔｉｓｒｉｐａｒｉａ)ꎮ图３㊀石榴ＳＰＳ(Ａ)和ＩＮＶ(Ｂ)基因家族系统进化树类中ꎬＰｇＩＮＶ２㊁ＰｇＩＮＶ７和ＰｇＩＮＶ８聚为一类ꎬ其中ＰｇＩＮＶ２与ＥｇＩＮＶ２聚为一小类ꎬＰｇＩＮＶ７和Ｐｇ￣ＩＮＶ８聚为一小类ꎻＰｇＩＮＶ６㊁ＰｇＩＮＶ１０和ＰｇＩＮＶ１１聚为一类ꎬ其中ＰｇＩＮＶ６与ＥｇＩＮＶ５亲缘关系较近ꎬＰｇＩＮＶ１０和ＰｇＩＮＶ１１亲缘关系较近ꎮ在第二大类中ꎬＰｇＩＮＶ１与ＥｇＩＮＶ４聚为一类ꎬＰｇＩＮＶ３与ＰｇＩＮＶ５亲缘关系较近ꎮＰｇＩＮＶ４与ＰｇＩＮＶ９聚为一类ꎬ其中ＰｇＩＮＶ４与ＥｇＩＮＶ３㊁ＥｇＩＮＶ６聚为一小类ꎬＰｇＩＮＶ９与ＥｇＩＮＶ８亲缘关系较近ꎮ２.６㊀ＰｇＳＰＳｓ和ＰｇＩＮＶｓ基因表达分析本研究选用２个ＳＰＳ基因(ＰｇＳＰＳ２和ＰｇＳＰＳ４)㊁６个ＩＮＶ基因(ＰｇＩＮＶ２㊁ＰｇＩＮＶ３㊁Ｐｇ￣ＩＮＶ４㊁ＰｇＩＮＶ７㊁ＰｇＩＮＶ９㊁ＰｇＩＮＶ１１)ꎬ均以７月１５日的表达量为１ꎬ分析其在石榴果实发育期的表达模式ꎬ结果(图４)显示ꎬ两个ＳＰＳ基因均下调表达ꎬ但随着石榴果实发育进程的推进ꎬ其变化趋势存在差异ꎬＰｇＳＰＳ２表现为降ң升ң降ң升ң降ң升的较规律波动变化ꎬＰｇＳＰＳ４则表现为降ң升ң降ң升ꎬ均以９月１５日的表达水平较高ꎮＰｇＩＮＶ２整体下调表达ꎬ随着生育进程的推进呈先降低后升高的变化趋势ꎻＰｇＩＮＶ３在７月３０日㊁９月１５日和１０月１５日上调表达ꎬ以９月１５日的相对表达量最高ꎬ８月３０日的相对表达量最低ꎻＰｇＩＮＶ４㊁ＰｇＩＮＶ７和ＰｇＩＮＶ９在石榴果实发育期间的表达水平较低ꎬ除ＰｇＩＮＶ７在８月１５日下调表达较少外ꎬ其余时期均明显下调表达ꎻＰｇＩＮＶ１１的变化趋势与ＰｇＩＮＶ３相似ꎬ但仅在９月１５日明显上调表达ꎮ６１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀图４㊀石榴不同发育期ＳＰＳ和ＩＮＶ㊀㊀基因家族成员表达模式３㊀讨论与结论蔗糖是植物体内光合产物从 源器官 运输到 库器官 的主要形式ꎬ是影响产量和果实品质形成的重要因素[１６－１７]ꎮＳＰＳ和ＩＮＶ是蔗糖代谢的关键调控酶ꎬ影响植物生长发育过程中的生物量形成和糖分积累[１８－２０]ꎮ本研究从石榴中鉴定出４个ＳＰＳ基因ꎬ其编码蛋白均为不稳定的酸性蛋白ꎬ与柑橘[７]和甜樱桃[９]中的数量一致ꎻ鉴定出１１个ＩＮＶ基因家族成员ꎬ均为不稳定蛋白ꎬ数量少于无籽蜜柚[２１]而多于草莓[１４]ꎮ通过对蛋白保守结构域和保守基序分析发现ꎬ石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白均具有典型的保守结构域ꎬ家族成员间特征ｍｏｔｉｆ数量和种类大致相同ꎬ蛋白结构高度保守ꎬ这表明石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族在进化上具有保守性ꎬ这与苹果[２２]和猕猴桃[２３]上的研究结果一致ꎮ其中ꎬＰｇＩＮＶ５和Ｐｇ￣ＩＮＶ１０具有中碱性蔗糖转化酶典型的Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ＿１００糖基水解酶结构域[２１]ꎬ等电点分别为６.３０和６.５３ꎬ有可能是中碱性蔗糖转化酶ꎬ这与黑皮果蔗[２４]和南瓜[２５]中的研究结果相似ꎮ蛋白质二级结构的预测与空间结构分析对了解其功能具有重要意义[２６－２７]ꎮ石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白二级结构主要由α－螺旋和无规则卷曲组成ꎬ延伸链和β－转角所占比例较低ꎬ说明α－螺旋和无规则卷曲在石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ蛋白结构中起重要作用ꎬ这与甘蔗[２８]中的研究结果相似ꎮ本研究发现ꎬ石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ家族成员不均匀地分布在染色体上ꎬ均定位于叶绿体中ꎬ其精确定位和调控功能还需深入研究ꎮ系统进化树分析表明ꎬ石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员间存在不同程度的亲缘关系ꎬ石榴与巨桉㊁苹果的ＳＰＳ基因家族成员同源性较高ꎬ与巨桉的ＩＮＶ基因家族成员同源性较高ꎮ这进一步证实了石榴与巨桉的亲缘关系较近[２９]ꎬ为深入研究石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族成员的生物学功能奠定了理论基础ꎮ本研究进一步对２个ＳＰＳ基因和６个ＩＮＶ基因在石榴果实不同发育时期的表达模式进行了分析ꎬ发现其在不同时期的表达量存在差异ꎮ在９月１５日(果实增大期)ꎬＰｇＳＰＳ２和ＰｇＳＰＳ４的相对表达量较高ꎬＰｇＩＮＶ３和ＰｇＩＮＶ１１的相对表达量显著高于其他时期ꎮ说明石榴ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族不同成员调控蔗糖代谢的功能具有特异性ꎬ这与甘蔗[３０]和萱草[３１]中的研究结果一致ꎮ综上ꎬ不同ＳＰＳ和ＩＮＶ基因调控石榴果实蔗糖代谢的机理存在差异ꎬ具有发育时期表达特异性ꎬ后续将从转录调控㊁功能鉴定㊁蛋白互作等方面深入研究石榴ＳＰＳ㊁ＩＮＶ基因家族成员调控蔗糖代谢的分子机理ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀刘司瑜ꎬ林艺灵ꎬ王令宇ꎬ等.石榴ＡＴＧ基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析[Ｊ].植物资源与环境学报ꎬ２０２２ꎬ３１(５):３７－４９.[２]㊀冯立娟ꎬ李英朋ꎬ王嘉艳ꎬ等.果袋类型对石榴果实发育期品质的影响[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２１ꎬ５３(１２):６９－７３. [３]㊀Ａｌ￣ＳａｉｆＡＭꎬＭｏｓａＷＦＡꎬＳａｌｅｈＡＡꎬｅｔａｌ.Ｙｉｅｌｄａｎｄｆｒｕｉｔｑｕａｌｉｔｙｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ(Ｐｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍ)ｔｏｆｏｌｉａｒｓｐｒａｙｏｆｐｏｔａｓｓｉｕｍꎬｃａｌｃｉｕｍａｎｄｋａｏｌｉｎ[Ｊ].Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅꎬ２０２２ꎬ８:９４６.[４]㊀ＴａｒａｎｔｉｎｏＡꎬＤｉｓｃｉｇｌｉｏＧꎬＦｒａｂｂｏｎｉＬꎬｅｔａｌ.Ｏｒｇａｎｏｍｉｎｅｒａｌｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓｉｎｃｒｅａｓｅｓｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｙｉｅｌｄａｎｄｑｕａｌｉｔｙｐａ￣ｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅｃｖ.Ｗｏｎｄｅｒｆｕｌｆｒｕｉｔｓ[Ｊ].Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕ￣ｒａｅꎬ２０２３ꎬ９:１６４.[５]㊀ＬｉｕＬＢꎬＺｈｅｎｇＪ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ(ＰｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍＬ.)[Ｊ].ＰｅｅｒＪꎬ２０２２ꎬ１０:ｅ１２８１４.[６]㊀曾德雯ꎬ朱龙英ꎬ冯岩ꎬ等.高等植物蔗糖磷酸合成酶(ＳＰＳ)的研究进展[Ｊ].植物生理学报ꎬ２０２０ꎬ５６(５):９３１－９３８.７１㊀第３期㊀㊀㊀㊀冯立娟ꎬ等:石榴蔗糖代谢相关酶ＳＰＳ和ＩＮＶ基因家族鉴定与表达分析[７]㊀魏清江ꎬ马张正ꎬ勒思ꎬ等.柑橘磷酸蔗糖合酶基因ＣｓＳＰＳ的鉴定和表达[Ｊ].园艺学报ꎬ２０２０ꎬ４７(２):３３４－３４４. [８]㊀Ｂｉｌｓｋａ￣ＫｏｓＡꎬＭｙｔｙｃｈＪꎬＳｕｓｋｉＳꎬｅｔａｌ.Ｓｕｃｒｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＳＰＳ)ꎬｓｕｃｒｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＳＵＳ)ａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆＭｉｓｃａｎｔｈｕｓˑｇｉｇａｎｔｅｕｓａｎｄＺｅａｍａｙｓａｔｌｏｗｔｅｍ￣ｐｅｒａｔｕｒｅ[Ｊ].Ｐｌａｎｔａꎬ２０２０ꎬ２５２:２３.[９]㊀齐希梁ꎬ刘聪利ꎬ宋露露ꎬ等.甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因ＰａｖＳＰＳ的功能分析[Ｊ].园艺学报ꎬ２０２１ꎬ４８(８):１４４６－１４５６.[１０]李会霞ꎬ祝令成ꎬ张钊ꎬ等.苹果中磷酸蔗糖合酶家族基因的表达特性及其与蔗糖含量的关系[Ｊ].西北植物学报ꎬ２０１７ꎬ３７(５):８７２－８７８.[１１]吕佳红ꎬ王英珍ꎬ程瑞ꎬ等.梨蔗糖合成相关酶ＳＵＳ和ＳＰＳ基因家族的鉴定与表达分析[Ｊ].园艺学报ꎬ２０１８ꎬ４５(３):４２１－４３５.[１２]铁原毓ꎬ田洁.大蒜蔗糖转化酶基因ＡｓＩＮＶ的克隆及其响应低温和干旱胁迫的表达分析[Ｊ].植物生理学报ꎬ２０２１ꎬ５７(１２):２２５８－２２７０.[１３]ＺｈａｎｇＳＬꎬＺｈａｎｇＺꎬＳｕｎＸꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃ￣ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｖｅｒｔａｓｅｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｒｅｖｅａｌｔｈｅｉｒｒｏｌｅｓｉｎｖａｃｕｏｌａｒｓｕｃｒｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｕｒｉｎｇＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉＲｅｈｄ.ｆｒｕｉｔｄｅ￣ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２１ꎬ１１３(３):１０８７－１０９７. 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实验四蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定参考一、实验意义和目的 (2)二、实验原理 (2)三、材料、设备与试剂 (3)四、实验步骤 (3)1.蔗糖合成酶活性测定实验 (3)2.转化酶活性测定 (4)五、实验结果与分析 (4)1.蔗糖合成酶活性测定.................................................................... 错误!未定义书签。

2.转化酶活性测定............................................................................ 错误!未定义书签。

六、误差分析........................................................................................... 错误!未定义书签。

一、实验意义和目的蔗糖作为植物体内主要的光合产物和运输物质，其代谢强弱对许多生理活动都会产生显著影响。

蔗糖合成酶(SuSy)是植物进行蔗糖代谢的关键酶之一,与植物细胞组织和骨架的构建、植株的生长发育和果实的成熟以及植物对逆境胁迫的响应等方面密切相关，在植物的生长发育和代谢活动中具有重要作用。

转化酶也是催化蔗糖降解的重要酶类，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，还是控制淀粉合成的关键酶，测定转化酶活性对了解光合产物的贮存、转运及累积都有重要意义。

通过本实验要掌握三种酶的作用、酶活力测定的原理和方法、学习酶活力的计算方法，了解糖类水解。

二、实验原理1.蔗糖合成酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+UDP 果糖+UDPG。

2.转化酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+H2O—►葡萄糖+果糖。

根据催化反应所需的最适PH,可将转化酶分为两种：一种称为酸性转化酶，主要分布在液泡和细胞壁中，另一类转化酶称为碱性或中性转化酶，主要分布在细胞质中。

甘蔗蔗糖转化和转运相关基因的克隆、表达及其与蔗糖积累相关性的研究甘蔗是世界上最重要的糖料和能源作物,具有光合效率高,宿根性好和增产潜力大等特点。

提高甘蔗的产量和蔗糖分有利于提高蔗农的收入,促进蔗糖业的健康发展。

培育高产高糖抗逆性强的甘蔗新品种,是现阶段甘蔗育种工作中面临的重大挑战。

对甘蔗不同生育期叶中蔗糖合成和运输、茎中蔗糖代谢相关酶活性进行研究,明确其变化规律及其与糖分积累的相关性,对高产高糖甘蔗品种培育和栽培都有重要意义。

本研究采用RT-PCR和RACE-PCR技术,从甘蔗品种GT28中克隆与蔗糖代谢密切相关的转化酶(INV)、转化酶抑制子(InvInh)和蔗糖转运蛋白(SUT)家族基因,通过转基因技术对SoInvInh2进行功能鉴定;同时通过HPLC技术测定大田栽培甘蔗品种ROC22和GT28成熟期以及桶栽甘蔗品种高糖GT35和低糖B8苗期、伸长期和成熟期中叶片和蔗茎中的糖分含量,以探讨甘蔗蔗糖代谢酶活性与糖分积累的关系。

主要结果如下:1、克隆到转化酶基因SoSAI1、SoCIN1和SoNIN,它们分别编码685 aa、576 aa和603 aa。

SoSAI1和SoCIN1是糖基化蛋白,属于GH32家族基因,SoN1N1为非糖基化蛋白,属于GH100家族基因。

SoNIN1具有6个外元和5个内元结构,其5’UTR区存在一个268 bp内含子序列。

SoCIN1为7个外元和6个内元结构。

利用染色体步移技术克隆到的3个转化酶基因的启动子序列,都含有生物和非生物胁迫相关元件。

3个转化酶都是组成型表达基因。

而且,在15%PEG、100 mmol.L-1NaCl和4℃胁迫下,它们在根和叶中的表达模式不尽相同。

2、克隆到2个转化酶抑制子基因:SoInvInh1为678 bp,编码176aa;SoInvInh2为927 bp,编码216aa。

它们都不含内含子序列。

SoInvInh1和SoInvInh2的GC含量分别为66.8%和70.05%,属于高GC含量基因。

中国农业科学 2010,43(19):3937-3944Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.19.005 利用cDNA-SRAP分析赤霉素诱导甘蔗节间伸长的差异表达 吴建明1，2，3，4，李杨瑞1，2，3，4，王爱勤3，4，杨 柳1，2，3，4，杨丽涛3，4 （1广西甘蔗研究所，南宁 530007；2广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁 530007；3广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，南宁 530004；4中国农业科学院甘蔗研究中心，南宁 530007）摘要：【目的】探寻赤霉素诱导甘蔗节间伸长基因表达差异的分子基础，为分离节间伸长相关基因奠定基础。

【方法】以新台糖22号为材料，在伸长初期以浓度为200 mg·L-1的赤霉素进行叶面喷施，以喷施清水为对照，分别提取总RNA进行等量混合，获得2种不同处理的样品池，采用cDNA-SRAP技术进行基因差异表达分析。

【结果】700对引物组合共扩增到约15 000条、大小在50—750 bp的cDNA片段。

在GA3处理组和对照组中，甘蔗幼茎中的转录水平具有很大的差异，获得134条差异条带。

从反向Northern杂交结果阳性的S-TDFs中选取24个片段进行克隆和序列分析，按照功能可以将24个差异表达基因片段S-TDFs（cDNA-SRAP transcript derived fragments）分为6类，分别为能量与代谢相关基因（4条，占总数的16.67%）、未知功能蛋白基因（6条，占总数的25%）、未知基因（10条，占总数的41.66%）、细胞壁生物合成与修饰相关基因（1条，占总数的4.17%）、信号传导相关基因（2条，占总数的8.33%）和转录因子相关基因（1条，占总数的4.17%）。

【结论】cDNA-SRAP完全适用于差异表达分析，从中获得一些与甘蔗节间伸长相关的差异基因片段，这些基因可用于甘蔗节间伸长的分子机理研究。

甘蔗工艺成熟期转化酶及其抑制子与蔗糖积累的相关性研究牛俊奇;Phan Thi Thu;邵敏;杨丽涛;李杨瑞【摘要】以工艺成熟期2个甘蔗品种不同节间为材料,分析转化酶及其抑制子与蔗糖积累的关系.结果表明,节间SAI酶活性与节间蔗糖含量负相关,NI在+6节～+31节中酶活性显著低于+1节中酶活性.节间CIN酶活性与节间蔗糖含量正相关,CIN 酶活性在GT28中低于ROC22中酶活性,而SoInvInh2基因相对表达量在GT28中高于ROC22,相关性分析表明SoInvInh2基因表达量与CIN酶活性呈显著负相关.基于以上结果,认为在甘蔗工艺成熟期蔗茎SAI和NI酶活性降低有利于蔗糖积累,而节间CIN酶活性提高,可能有利于蔗糖从低浓度节间向高浓度蔗节间的运输.SoInvInh2基因可能是节间CIN酶活性重要调节因子,能抑制其酶活性.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2015(028)004【总页数】6页(P1606-1611)【关键词】甘蔗;转化酶;转化酶抑制子;蔗糖积累;相关性分析【作者】牛俊奇;Phan Thi Thu;邵敏;杨丽涛;李杨瑞【作者单位】广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁530005;广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁530005;广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁530005;广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁530005;中国农业科学院甘蔗研究中心/广西农业科学院甘蔗研究所/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室/广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,广西南宁530007;广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁530005;中国农业科学院甘蔗研究中心/广西农业科学院甘蔗研究所/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室/广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,广西南宁530007【正文语种】中文【中图分类】S566.1甘蔗是重要的糖料和经济作物，我国甘蔗糖产量占全国食糖总产量的比例高达90%以上，在国民经济中占有重要地位[1]。

甘蔗糖化过程中不同酶的比较研究甘蔗糖化是一种将甘蔗中的淀粉转化为蔗糖的生物化学过程。

该过程涉及到多个酶的参与，它们在催化反应中起着关键作用。

本文将对甘蔗糖化过程中不同酶的功能、催化效率以及应用前景进行比较研究。

甘蔗糖化过程中主要涉及的酶包括淀粉酶、葡萄糖异构酶和蔗糖酶。

淀粉酶能够将甘蔗中的淀粉分解成葡萄糖单元，是甘蔗糖化过程的关键酶之一。

而葡萄糖异构酶则将葡萄糖分子在催化作用下转化为异构体分子，为后续反应提供了必要的底物。

最后，蔗糖酶能够催化蔗糖的水解反应，将蔗糖分解成两个葡萄糖分子。

第一，淀粉酶是甘蔗糖化过程中的关键酶。

在实际应用中，主要有α-淀粉酶和β-淀粉酶两类。

这两类淀粉酶在催化作用上略有不同。

α-淀粉酶主要作用于淀粉颗粒内部的α-1,4-糖苷键，能够将淀粉中的支链分解为可溶性糖。

而β-淀粉酶主要作用于淀粉颗粒的表面，可将淀粉颗粒表面上的α-1,4和α-1,6糖苷键水解成糊化淀粉。

通过比较研究发现，α-淀粉酶在低温下具有较高的催化活性，而β-淀粉酶在高温下催化效率更高。

因此，在甘蔗糖化过程中，合理选择合适的淀粉酶类型和温度条件，可以提高甘蔗糖化反应的效率和产量。

第二，葡萄糖异构酶在甘蔗糖化过程中也发挥着重要的作用。

葡萄糖异构酶主要将葡萄糖分子转化为异构体分子，为后续步骤提供底物。

葡萄糖异构酶具有高催化活性和选择性，能够在不同温度和pH条件下稳定地进行催化反应。

此外，葡萄糖异构酶还能够耐受高浓度的葡萄糖和其他抑制物质，具有较好的抗抑制能力。

因此，在糖化过程中加入适量的葡萄糖异构酶，能够提高酶促反应的效果。

第三，蔗糖酶是甘蔗糖化过程中的最后一道工序。

蔗糖酶能够将蔗糖分解成两个葡萄糖分子，进一步促进糖化反应的进行。

蔗糖酶具有较高的酶活性和稳定性，可以在相对较低的温度和pH条件下进行催化反应。

在甘蔗糖化过程中，蔗糖酶可以作为一种辅助酶，提升酶促反应的速率和产物得率。

通过比较不同蔗糖酶的催化效率和稳定性，可以选择合适的蔗糖酶类型和使用条件，以达到最佳的糖化效果。

甘蔗各家族SPS基因表达特性分析桂意云;汪淼;秦翠鲜;陈忠良;廖青;李杨瑞;黄东亮【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2016(047)002【摘要】[目的]通过时空表达特性分析,初步推测甘蔗各家族蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因在甘蔗蔗糖积累途径中的功能,为研究甘蔗各家族sPs基因的生物学功能奠定基础.[方法]采用荧光定量PCR分析甘蔗4个家族SPS基因在高、中、低糖甘蔗品种未成熟叶片、成熟叶片和茎中的时空表达特性.[结果]在甘蔗伸长期、蔗糖积累前期和蔗糖积累后期,SofSPSDⅢ基因在所有甘蔗品种的未成熟叶片、成熟叶片和茎中均高水平稳定表达,相对表达量在5.3～8.1;SofSPSB基因在成熟叶片中几乎不表达,而以茎中表达量最高.在伸长期,SofSPSC和SofSPSA基因表达较强,相对表达量分别为7.3～14.2和1.5～4.4;在蔗糖积累前期,SofSPSC基因表达稍有降低,但仍处于较高水平,相对表达量达为4.6～8.9,而SofSPSA基因表达加强,相对表达量达3.8～6.9;在蔗糖积累后期,SofSPSC基因在成熟叶片中的表达量比蔗糖积累前期下降4.0～7.2倍,且均比未成熟叶和茎中下降约6.0倍,而SofSPSA基因在不同组织中的表达量比蔗糖积累前期下降1.8～5.7倍.各家族SPS基因在不同糖分甘蔗品种间的表达趋势一致.[结论]甘蔗D家族SPS基因维持甘蔗蔗糖合成的基本功能,通过调控C、A家族SPS基因的表达来调控蔗糖合成的强度,B家族SPS基因不参与甘蔗源叶中蔗糖合成而参与蔗糖的积累与利用.【总页数】6页(P174-179)【作者】桂意云;汪淼;秦翠鲜;陈忠良;廖青;李杨瑞;黄东亮【作者单位】广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007;广西农业科学院,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室,南宁530007【正文语种】中文【中图分类】S566.1【相关文献】1.甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅢ基因表达分析 [J], 黄诚梅;杨翠芳;魏源文;邓智年;吴凯朝;曹辉庆;李杨瑞2.甘蔗各家族SPS基因表达特性分析 [J], 桂意云;汪淼;秦翠鲜;陈忠良;廖青;李杨瑞;黄东亮;3.甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建 [J], 汪淼;李双喜;桂意云;秦翠鲜;陈忠良;廖青;李杨瑞;黄东亮;4.甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅢ基因表达的初步研究 [J], 杨翠芳;黄诚梅;潘有强;魏源文;邓智年;秦新民;李杨瑞5.甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅢ基因表达的初步研究 [J], 杨翠芳;黄诚梅;潘有强;魏源文;邓智年;秦新民;李杨瑞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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可溶性酸性转化酶（Soluble acid invertase, SAI）是蔗糖代谢途径中的关键酶，主要存在于细胞液泡或自由空间中，最适pH为4.5~5.0，通过降解液泡中蔗糖，
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奉晚与奉节72-1脐橙的蔗糖代谢相关酶基因表达及其在糖分差异中的作用1刘永忠12 唐鹏2 熊晶晶12 向可术3 邓秀新12*(1华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，2华中农业大学园艺林学学院，武汉，430070,3奉节县农业局，重庆，404600)*通讯作者e-mail：xxdeng@摘 要:本文采用RT-PCR技术分析了果实成熟过程中两个品种可食部位蔗糖代谢相关酶的表达状况，同时测定了对应时期它们的糖组分含量变化，结果表明在果实成熟过程中酸性转化酶（AI）基因在奉节72-1脐橙和奉晚脐橙间出现表达差异，而蔗糖合成酶（SS）基因都能够检测到的表达，但是都没有检测蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因的表达。

分析对应时期两个品种的各糖组分（包括蔗糖、葡萄糖和果糖）变化发现，奉节72-1脐橙果实的蔗糖积累在11月份就达到较高水平，葡萄糖和果糖含量在12月中旬达到最高水平，然后在果实挂树后期各糖组分表现下降趋势。

而奉晚脐橙的各糖组分在果实成熟过程中一直保持上升趋势，各糖组分在元月份前的成熟过程中多数情况都显著低于对照品种的各糖组分含量。

因此AI表达差异可能是造成奉晚脐橙与奉节72-1脐橙糖分差异的主要原因之一。

关键词：脐橙；晚熟芽变；蔗糖代谢酶；RT-PCR植物组织中糖分的含量不仅受到环境因素的影响，在体内还受到蔗糖代谢相关酶的协调调控。

有关糖分代谢直接相关的酶包括蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase, SPS），蔗糖合成酶（Sucrose synthase, SS）和转化酶（Invertase）。

转化酶因其存在部位和对PH值的要求不同可以分为中性转化酶，细胞壁转化酶和酸性转化酶（AI）[1]。

Sturm等(1999)认为与蔗糖降解相关的酶对植物的生长发育和碳素分配起到关键作用[2]。

对柑橘果实糖分和相关代谢酶的活性关系研究表明相关代谢酶在果实发育过程中糖分积累起到重要作用[3-7]。

货号：QS2506 规格：50管/24样可溶性酸性转化酶（Soluble acid invertase, S-AI）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。

根据最适 pH，Ivr分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。

AI的最适pH为3～5。

AI分为可溶性AI(S-AI)和细胞壁不溶性AI（B-AI）两种类型。

S-AI 主要存在于细胞液泡或自由空间中，最适 pH 为 4.5~5.0（酸性），通过降解液泡中蔗糖，调节液泡中蔗糖的利用和果实内糖类的积累。

测定原理：S-AI催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定范围内510nm光吸收增加速率与S-AI活性成正比。

自备实验用品及仪器：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存;试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存;试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入25mL试剂一充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存;试剂三：液体30mL×1瓶，4℃避光保存；粗酶液提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。

12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

处，蒸馏水调零，记录各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)，ΔA=A测定-A对照。

S-AI活性计算：标准条件下测定的回归方程为y = 0.0016x -0.001；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。

（1）按蛋白浓度计算：第1页，共2页单位的定义：37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

铁皮石斛酸性蔗糖转化酶基因家族鉴定及低温下表达分析刘博婷;唐演儿;李琳;林一帆;李学诗;于白音;刘羽佳【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2022(50)24【摘要】为了探究DcAI家族基因的生物学特性及其在逆境响应中的潜在功能,基于已公布的铁皮石斛基因组数据,对铁皮石斛DcAI基因家族进行鉴定和生物信息学分析,并用RNA-Seq(转录组测序)技术分析其在低温胁迫下的表达模式。

结果表明,DcAI基因家族共有4个成员,其中液泡蔗糖转化酶编码基因和细胞壁蔗糖转化酶编码基因各2个,在数量上与其他物种间的差异较大,存在基因丢失现象。

DcAIs 具有相似的内含子/外显子结构,且不均匀地分布在染色体上,其蛋白质结构高度保守,具有酸性蔗糖转化酶特有的氨基酸保守基序。

DcAIs启动子含有多种顺式作用元件,涉及光响应、胁迫响应、激素响应、发育调节等多种生理生化过程;DcAIs在铁皮石斛不同组织中的表达丰度不同,具有明显的组织表达特异性;DcAIs在低温胁迫下呈现不同的表达模式,以同工酶形式在不同组织中对低温胁迫采取不同的响应机制,推测DcAIs可能通过调节自身基因的表达以提高细胞内可溶性多糖含量,从而增强铁皮石斛对低温的耐受能力。

研究结果可为DcAIs基因的利用及铁皮石斛优良种质的分子遗传改良提供参考借鉴。

【总页数】10页(P33-42)【作者】刘博婷;唐演儿;李琳;林一帆;李学诗;于白音;刘羽佳【作者单位】韶关学院英东生物与农业学院;广东省粵北食药资源利用与保护重点实验室(韶关学院);韶关市石斛工程技术开发中心【正文语种】中文【中图分类】S567.239.01【相关文献】1.铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析2.酸性转化酶基因家族在番茄果实发育及逆境胁迫下的表达分析3.铁皮石斛DoTIFY基因家族全基因组鉴定及在原球茎发育过程中的表达4.菜心酸性蔗糖转化酶基因家族的鉴定及表达分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

不同甘蔗品种基因组DNA甲基化分析的开题报告1.研究目的甘蔗是世界上重要的经济作物之一，具有广泛的应用价值，如食品、饮料、燃料等。

甘蔗品种间存在着千差万别的遗传差异。

甘蔗基因组DNA甲基化是一种起调控表观遗传变化的重要作用的修饰方式。

本研究旨在探究不同甘蔗品种的基因组DNA甲基化差异，为甘蔗良种选育和遗传变异机制的研究提供理论基础。

2.研究内容和方法2.1 研究内容本研究将采用BS-Seq（Bisulfite sequencing）技术，对不同甘蔗品种的基因组DNA甲基化进行分析。

首先，收集不同品种的甘蔗叶片样本，提取全基因组DNA并进行测序；然后，将测序数据进行预处理，如去除低质量序列和过滤接头。

接着，将预处理后的测序数据与甘蔗基因组序列比对，利用BS-Seq数据分析工具进行甲基化位点鉴定和统计分析。

最后，通过基因组DNA甲基化分析结果，比较不同品种间的甲基化模式和水平。

2.2 研究方法（1）甘蔗样本收集：从不同地区采集6种常见甘蔗品种（抗109、GCT-720、 ROC-22、 ROC-25、 ROC-44、 NL21）的叶片样本。

每个品种收集3个样本，共18个样本。

（2）DNA提取和建库：从叶片样本中提取全基因组DNA，进行自由基梅切割，并修复DNA末端，接上A尾，连接测序接头，然后进行甲基化处理，并进行PCR扩增。

（3）测序和数据预处理：将建立好的文库进行Illumina HiSeq4000平台高通量测序，得到原始测序数据。

对原始测序数据进行去除低质量序列和过滤接头处理，得到高质量的数据。

（4）数据分析：将预处理后的测序数据与甘蔗基因组序列比对，并进行甲基化位点鉴定和统计分析。

利用基因组DNA甲基化软件包例如Bismark、Bis-SNP等，对数据进行处理和分析。

3.研究意义甘蔗品种间存在着不同的遗传差异。

通过基因组DNA甲基化分析，可以揭示不同品种之间的甲基化模式和水平，对甘蔗遗传变异机制进行深入研究具有很重要的意义。