高等植物中维生素C合成及其相关酶研究进展1尚增振，马锋旺*，李威西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌（712100）E-mail：fwm64@摘要：维生素C即抗坏血酸（AsA），是一种重要的抗氧化物质，在植物和动物的代谢方面发挥着重要作用。
自1998年拟南芥AsA缺乏突变体VTC1的鉴定和L-半乳糖途径的提出，高等植物中AsA代谢研究发展较快。
合成相关新基因的鉴定与克隆，检测到其他的合成途径，表达动物AsA合成基因后，不可预知的生物表型观察等表明植物AsA合成的复杂性。
本文根据相关文献对植物中维生素C的合成途径和相关酶基因的研究进行了综述。
关键词：高等植物，维生素C，生物合成途径，合成相关酶维生素C（Vc）,又称抗坏血酸（ascorbic acid, AsA），是普遍存在于植物组织中的高丰度小分子抗氧化物质。
某些动物如人类由于缺乏其合成关键酶L-古洛糖内酯氧化酶不能自身合成维生素C，并且其在人体内不能长久贮存，只能不断从食物中获取AsA，而作为主要Vc 来源的水果和蔬菜其AsA水平差异较大。
因此AsA 含量已成为衡量农产品品质的重要指标。
此外，植物中的AsA 还在抗氧化和清除自由基、光合作用和光保护、细胞的生长和分裂以及参与某些次生代谢物和乙烯的合成等诸多方面起着非常重要的生理功能。
同时有关AsA生物合成和调控的研究也取得重要进展。
本文综述了近来年人们在AsA生物合成及其相关酶方面的研究进展。
1．植物AsA合成途径1.1 与动物合成途径类似的古洛糖途径Isherwood 等[2]最早提出的类似于动物合成途径的高等植物AsA生物合成途径，该途径认为植物由D-半乳糖经D-半乳糖醛酸和L-半乳糖内酯(L-GalL)等重要中间物质最终形成AsA，其间发生了类似动物的碳链倒位。
支持该途径的证据为在植物体内确实存在天然L-GalL并可通过半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)氧化生成AsA，同时D-半乳糖醛酸(甲酯)也可作为AsA合成的底物。
但随后的同位素放射性示踪证明植物合成AsA的过程并未发生碳链的倒位[3]。
虽然有证据显示L-GalL是植物合成AsA的底物，但D-半乳糖醛酸并不是植物合成AsA 的主要物质[10,12]。
1.2 邻酮醛糖途径为符合同位素放射性示踪实验结果，Loewus等[28]提出的一条非倒位途径即临酮醛糖途径。
在该途径中D-葡萄糖首先在C-2位上被氧化生成D-葡萄糖醛酮然后在C-5位经表异构酶催化形成L-山梨糖醛酮，并进一步在山梨糖醛酮脱氢酶作用下被氧化为AsA。
此途径虽然没有碳骨架的倒位，但至今还没有明确的实验证据支持这一途径[29]。
因为尚未发现催化前两步反应的酶。
Conklin 等[30]对拟南芥AsA缺乏的突变体vtc1的研究表明增加D-葡萄糖醛酮和L-山梨糖醛酮并不能导致AsA的积累。
L-山梨糖醛酮也未能明显增加拟南芥悬浮细胞内源AsA含量. Saito et al 利用14C标记实验发现，前体培养的24h后，D-(14C)-葡糖醛酮有4.1%的转化成AsA；D-(14C)-葡萄糖有0.6 %转化成AsA，而且没标记的D-葡糖醛酮抑制了D-(14C)-1本课题得到西北农林科技大学“拔尖人才支持计划”和西北农林科技大学国家生命科学与技术人才培养基地科技创新基金的资助。
葡萄糖向(14C)-AsA的转化[31]。
尽管如此，由于葡糖醛酮能在一定程度上对植物产生毒害，使这种抑制现象不能成为D-葡糖醛酮作为AsA合成前体物的证据.1.3 L-半乳糖途径基于生物化学证据，1998年Wheeler等[5]在无碳链倒位途径和L-半乳糖-1，4-内酯是AsA 合成的直接前体下，提出了植物中AsA合成的L-半乳糖途径。
此后，在光合组织中用分子生物学手段证实该途径为植物AsA合成的主要途径[11,12,13]。
在该途径中，以D-甘露糖-6-磷酸、L-半乳糖和L-GalL等作为主要中间物质，既符合同位素放射性示踪实验结果，又避免了以前争议较大的炭链倒位。
还把L-GalL等重要物质纳入其中。
支持该途径的证据主要有(1)当用[14C]甘露糖喂饲拟南芥叶片时4 h后就有约10%被标记的[14C]在AsA中被检测到[11]；(2)在豌豆胚提取物中加入[ 14C]GDP-甘露糖可以形成[ 14C]L-GalL并可进一步生成AsA[12]；(3)用L-半乳糖和L-半乳糖内酯等直接前体物喂饲拟南芥叶片和豌豆苗可以相同的效率增加 AsA含量，同时GDP-甘露糖可通过GDP-D-甘露糖-3,5-表异构酶的作用形成L-半乳糖[13,32]；(4)该途径中所涉及的酶多数已被检测纯化或克隆;(5)特别是对从拟南芥获得的AsA缺失突变体的相关研究也证实了这一途径。
该途径把AsA的生物合成融入植物碳水化合物的主要代谢过程并高等植物中抗坏血酸可能的合成途径Proposed biosynthetic pathways of AsA in higher plants与多糖合成和蛋白质的糖基化之间建立联系已被公认为是高等植物合成AsA的主要途径[27]。
1.4 糖醛酸转变途径虽然同位素放射性示踪实验结果已经证明植物不能通过碳链倒位途径合成AsA，但最近对拟南芥悬浮培养细胞的研究发现除L-半乳糖和L-半乳糖内酯以外，D-半乳糖醛酸甲酯、L-古洛糖内酯、D-葡萄糖醛酸甲酯和D-葡萄糖醛酸内酯等也能提高细胞内AsA水平[11,32]。
然而这4种物质并不包含于L-半乳糖途径之中，特别是对于L-古洛糖内酯及其氧化酶的研究使人们相信植物可能还存在另外的AsA合成途径。
当Jian 和Nessler[19]把从鼠肝脏细胞克隆的古洛糖内酯氧化酶基因导入烟草和莴苣中时，转基因植株AsA的含量比对照提高了7倍。
但是要清楚地阐明糖醛酸转变途径的过程、生理作用以及与L-半乳糖途径之间的关系为时尚早。
它可能是植物在特殊环境条件下于特定组织中合成AsA的途径。
1.5 可能的肌醇途径在动物AsA合成途径中，中间产物D-葡萄糖醛酸可由肌醇通过肌醇氧化酶催化而产生，但这种可能以前在植物中没有报道。
拟南芥的全部基因组序列的利用允许研究者去寻找植物与动物在肌醇氧化酶基因上的同源性[7]，发现该基因编码区位于4号染色体上。
后来，细菌表达的该酶重组蛋白具有肌醇氧化酶活性。
在拟南芥中的过量表达显著增加了AsA水平[7]。
通过猕猴桃和苹果EST序列分析，在苹果和猕猴桃果实中存在肌醇-1-磷酸化酶。
但是在离体下还没有检测到肌醇在植物AsA合成中的作用。
2. AsA合成相关酶的研究2.1 GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-D-Mannose pyrophosphorylase , GMPase)GMPase是 L-半乳糖途径中第1步反应所需要的酶,催化 D-甘露糖 -1-P生成 GDP-D-甘露糖,已从烟草(AB066279)[36]、土豆(AF022716)[37]、拟南芥 (AF076484)、番茄（AY605668）获得了编码 GMPase的基因。
对拟南芥维生素C突变体Vtc1的研究表明突变位点正是该基因位点[12]。
1999年 Keller等[37]对马铃薯GMPase基因进行反义表达，导致转基因马铃薯中维生素C含量的下降,这证明了L-半乳糖途径在植物维生素C合成中占主导地位。
2.2 GDP-甘露糖-3,5-表异构酶(GDP-D-Mannose-3,5-epimerase)在 L-半乳糖途径中将 GDP-甘露糖转变为L-半乳糖的关键酶。
Wheeler等[5]首先从豌豆、拟南芥等植物中分离鉴定出GDP-甘露糖-3,5-表异构酶。
Wolucka等[6]从拟南芥的悬浮培养细胞中克隆获得了编码GDP-甘露糖-3,5-表异构酶的基因。
该酶是一个分子量约84kD的二聚体,由2个能够明显区分的亚基组成;其基因编码377个氨基酸,推导的分子量为42.759kD,pI为5.85,它对拟南芥合成维生素C具有调控作用。
研究发现该酶至少催化2个显著的表异构化反应,而且表异构化物量会发生变化,变化规律似乎与该酶的分子构型有关,并发现了一个新产物GDP-L-古洛糖[14]。
他们推测热激蛋白Hsp70分子伴侣参与了该酶的分子折叠或调控。
GDP-甘露糖-3,5-表异构酶可以根据细胞的氧还状态、环境胁迫、细胞壁或糖蛋白对GDP-糖需求量等来控制进入维生素C合成途径中碳源的量,并且外源的GDP-L-古洛糖和L-古洛糖-γ-内酯可以作为植物细胞维生素C合成的主要前体物质,在此基础上一个类似于动物的植物维生素C合成途径被提出。
2.3 L-半乳糖-1-磷酸酯酶( L-galactose-1-phosphate phosphatase)在 L-半乳糖途径中将L-半乳糖-1-P转变成L-半乳糖的酶。
该酶分子量约为65kD,对L-半乳糖-1-P具有高度的底物特异性，说明L-半乳糖途径在植物体内占有主导地位。
在植物体中L-半乳糖主要用于维生素C的生物合成，故L-半乳糖-1磷酸酶的活性高低对植物体内维生素C 含量影响很大[15]。
Chen等[40]从美味猕猴桃里获得了编码L-半乳糖-1磷酸酯酶的cDNA基因序列。
2.4 L-半乳糖脱氢酶（L-galactone dehydrogenase, GalDH）在L-半乳糖途径中， GalDH直接催化L-半乳糖形成L-半乳糖内酯，起着关键酶的作用。
从美味猕猴桃海沃德叶片[23]和苹果[42]中分离纯化到L-半乳糖脱氢酶并克隆到该基因cDNA，登录号分别为AY176585和AY264803。
该酶分子量为34.2kD，凝胶电泳显示为单体。
当pH 值由6.5到9时，对半乳糖和NAD的Km值下降。
在果实、叶片发育过程中，GalDH酶活性下降，mRNA表达量作出相应的变化[23]。
Gatzek S等[13]在拟南芥中对该基因进行反义表达，叶片AsA含量下降，并且受光调控。
2.5 L-半乳糖内酯脱氢酶( L-Galactono-lactone dehydrogenase, GalLDH)从植物中分离GalLDH基因已有不少文章报道,目前已从花椰菜[40]、甘薯[33]、烟草[26]、拟南芥、草莓、刺梨等植物中获得了编码GalLDH的cDNA克隆。
该酶是L-半乳糖合成途径最后一步反应的催化酶,完成由L-半乳糖-1,4-内酯到维生素C的转化。
GalLDH定位于线粒体内膜外侧,分子量为56kD,分析得知GalLDH中半胱氨酸残基的数目对GalLDH的活性影响重大[40]。
该酶对L-半乳糖内酯具有很高的底物专一性,并且需要细胞色素C(Cytc)作酶反应的电子受体[40]。
多数植物的GalLDH蛋白氨基酸序列具有3个可预测的跨膜区域和一个位于膜外侧FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)结合域,这使得其作用底物能够像其它小分子溶质一样不需要载体介导而穿过外膜,同时其反应产物维生素C也不需要载体作用就能运出合成部位[1]。
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