hoechst33258染色原理

细胞染色方法总结Hoeｃｈst染色：ｈoｅｃhst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoecｈst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果。

ｈｏｅｃhst 有hｏｅchest33３42和hoechst3３2５8两种hｏｅchｓts33258，hoeｃｈst333４２二者区别不大,但是hｏeｃｈst33３42对细胞的毒性作用更小一些,所以一般来说hｏｅcｈsts3３2５8用于细胞固定后再染色，而hoechsｔ3３3４2则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI （Ｐroｐiｄium Ｉodide碘化丙啶）染色：是一种可对DＮＡ染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。

碘化丙啶（Ｐｒoｐidium Iｏdide, PI)是一种核酸染料（红色）,它不能透过完整的细胞膜,但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。

用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色)。

但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。

但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PＩ单一染色显然不够! annexin—v染色细胞凋亡早期，细胞膜标志发生改变.其中，磷脂酰丝氨酸(Annexin-V，PS）外翻,Annexin-Ｖ在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合．这样,Ａnnexin-v 染色阳性，表示细胞处于早期凋亡状态.Anneｘｉn－V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。

Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用ＰE标记就发红色荧光....文档交流仅供参考...JC-1染色ＪＣ－１是一种阳离子染料,可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体（monomer)存在,发射光以绿光(～52５nm）为主;而在高浓度时则可以形成多聚体（agｇregａｔioｎ）,发射光以红光(-590nm)为主.线粒体本身存在一定的极性（polarizaｔion),其外膜为负极，内膜为正极。

Hoechst33258 荧光染色法【试剂盒不同，固定染色时间不同。

】
①人肝癌细胞HepG2经常规传代培养至对数期，弃去旧培养液，用0.25%胰蛋白酶溶液消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为1× 106 /ml，接种于6孔培养板中。

置于37°C、5%CO2 恒温细胞培养箱中培养24h后，观察细胞贴壁情况。

②待贴壁细胞密度达到80%后，弃去培养液，用PBS小心冲洗细胞两遍，加入不同浓度的人参皂苷转化物溶液200μl，继续培养24h。

③24h后消化收集细胞，1000r/min离心5min，弃去上清液；用PBS重悬细胞，1000r/min离心洗涤2 次；
④第二次离心洗涤后留少许上清，用微量加样器吸取细胞在洁净载玻片上涂片，室温自然干燥；随即使用甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定15 min；
⑤晾干后于暗处用Hoechst 33258 染色工作液(10mg/l)避光染色10 min后用双蒸
水冲洗5min，抗淬灭封片液封片；
⑥置于激光共聚焦显微镜下，激发波长350nm，发射波长460nm，观察细胞凋亡情况并拍照。

①人肝癌细胞HepG2经常规传代培养至对数期，弃去旧培养液，用0.25%胰蛋白酶溶液消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，接种于6孔培养板中。

置于37℃、5%CO2 恒温细胞培养箱中培养24h后，观察细胞贴壁情况。

②待贴壁细胞密度达到80%后，弃去培养液，用PBS小心冲洗细胞两遍，一孔加入含10%胎牛血清的完全培养液，其余各孔分别加入高、中、低3个浓度的人参皂苷转化物溶液与顺铂溶液200μl，继续培养48h。

③倒置显微镜下观察各组细胞生长情况和形态变化。

本人收集的激光共聚焦常见荧光染料染色方法zuohy(2008-09-19 17:33:43)一、Hoechst 33258染色1、试剂盒组成固定液 50 mlHoechst 33258染色液 50 ml抗荧光淬灭封片液 5 ml说明书 1 份保存条件：4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。

本试剂盒自订购之日起六个月内有效。

2、注意事项：需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

需PBS或0.9%NaCl溶液。

需盖玻片与载玻片。

荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。

在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。

3、使用说明：1）贴壁细胞A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。

也宜用摇床，或手动晃动数次。

E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。

使细胞接触封片液，切勿弄反。

G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。

2）悬浮细胞A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

洗涤期间手动晃动。

C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

细胞核荧光染料（PI DAPI Hoechst33342）Hoechest 33258 是膜透性的,因此在活细胞时候能轻松进入;DAPI是半透性的,有选择性的进入.因此Hoechest 33258 一般用来染活细胞,可以长驱直入;DAPI一般是染固定细胞.2、两者都可以用紫外看，参见以下的激发发射波长Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。

DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。

Hoechst 33342/PI双染色法1．悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml，37℃孵育7～10min。

2．4℃500～1000r/min离心弃去染液。

3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

??碘化丙啶染色???? 1．原理? 碘化丙啶(propidium iodide，PI)不能穿人完整的活细胞膜中，即正常细胞和凋亡细胞在不固定的情况下对PI拒染，而坏死细胞由于失去膜的完整性，PI可进入细胞内与DNA结合，根据此特点，使用PI染色可鉴别死细胞。

如果对活细胞染色必须在染色前进行固定，以增加细胞膜对染料的通透性。

???? 2．溶液配制? 使用0．01mol／LPBS(pH 7．4)配制终浓度为0．5mg／ml的PI工作液。

???? 3．染色程序??? (1)单层细胞培养标本经预冷70％乙醇固定1小时，4℃；??? (2)0．01mol／LPBS(pH 7．4)冲洗；??? (3)沥干后加入PI工作液，室温孵育15分钟；??? (4)冲洗后封片。

Hoechst 33258染色液简介：Hoechst 33258也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分子式为C 25H 24N 6O · 3HCl 。

Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst 33258也用于普通的细胞核染色、DNA 染色。

Leagene Hoechst 33258染色液可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色，也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。

组成：操作步骤(仅供参考)：(一)固定的组织细胞染色1、对于细胞或组织样品，固定后冲洗去除固定剂。

如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33258染色，如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33258染色。

2、室温放置，轻轻吸除Hoechst 33258染色液。

4、用无菌的PBS 或生理盐水清洗2～3次。

5、直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。

(二)活细胞染色1、取96、24、6孔板培养细胞至合适状态，按96孔板加入100μl 、24孔板加入500μl 、6孔板加入1ml 的比例，加入适当的Hoechst 33258染色液，染液必须充分覆盖细胞。

2、在适宜于细胞培养的条件下培养。

3、轻轻吸除Hoechst 33258染色液。

4、用无菌的PBS 或生理盐水清洗2～3次。

5、进行荧光检测。

注意事项：1、 Hoechst 33258染色液的浓度适用于大多数常规染色的需要。

2、 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

活细胞或组织染色后宜立即观察。

3、 为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。

编号 名称 DA0010 Storage Hoechst 33258 Staining Solution 10ml -20℃ 避光 使用说明书1份4、避免反复冻融，否则容易失效。

hoechst33258染色原理Hoechst 33258染色原理Hoechst 33258是一种广泛应用于细胞染色的荧光染料，其染色原理基于其特殊的荧光性质。

本文将介绍Hoechst 33258染色的原理以及其在生物学研究中的应用。

Hoechst 33258是一种DNA染料，可以通过与DNA的特异性结合来染色细胞核。

其结构中含有多个芳香环，并且具有两个亲水性基团。

这些特征使得Hoechst 33258能够与DNA的碱基发生作用，并形成稳定的染色复合物。

Hoechst 33258的染色原理可以分为两个步骤：细胞透过性和DNA结合。

Hoechst 33258可以通过细胞膜透过性进入细胞内。

细胞膜是由脂质双层组成的，具有一定的透过性，特别是对于小分子量的化合物。

Hoechst 33258具有较小的分子量和亲水性基团，因此可以通过细胞膜进入细胞。

Hoechst 33258与DNA的碱基发生作用，形成稳定的染色复合物。

DNA是由脱氧核苷酸组成的双链分子，在细胞核中起着储存和传递遗传信息的作用。

Hoechst 33258中的芳香环能够与DNA的碱基发生π-π堆积作用，特别是与腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）发生较强的结合。

这种结合使得Hoechst 33258能够选择性地染色细胞核，而不影响其他细胞结构。

Hoechst 33258的染色特点使其成为生物学研究中广泛应用的染料之一。

通过Hoechst 33258染色，可以直观地观察细胞核的形态和数量变化，进而研究细胞增殖、凋亡和分化等生物学过程。

此外，Hoechst 33258还可以用于检测DNA的含量和DNA损伤，以及细胞周期的研究。

在实验中，Hoechst 33258的使用方法相对简单。

首先，将Hoechst 33258溶解在适当的溶液中，再将其加入含有待染细胞的培养基中。

随后，将细胞与Hoechst 33258溶液共孵育一段时间，使其充分染色。

最后，使用荧光显微镜观察细胞，并通过荧光信号的强度和分布来分析细胞核的状态。

Hoechst是一种膜通透性的荧光染料，故正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核Hoechst染色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而调亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状，边集。

常用Hoechst33258和Hoechst33342，前者渗透性不如后者好，多用于活细胞染色，而后者活细胞和死细胞均可。

Hoechst33342 能透过胞膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA ,使之发出明亮的蓝色荧光。

凋亡的细胞核染色增强,荧光更为明亮,呈圆状或固缩状、团块状结构。

非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。

二者形态迥然相异,很易判别。

Hoechst 染色方法：1. 贴壁细胞A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D. 加入终浓度为10μg/ml的Hoechst染色液，染色5分钟。

也宜用摇床，或手动晃动数次。

E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍。

F. 将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上，尽量避免气泡。

切勿弄反。

G. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。

2. 悬浮细胞A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50μl液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

E. 均匀滴加Hoechst染色液，染色5分钟。

支原体检测(DNA荧光染色法-贴壁细胞爬片法)实验原理：利用荧光试剂二苯甲酰胺(Hoechst33258),结合到细胞和支原体DNA,A-T富含区域的特点，在紫外激发束（波长为330～380nm）激发下产生黄绿色荧光的原理，利用荧光显微镜检测细胞中是否存在支原体污染。

实验基本材料准备：（1）实验仪器：荧光显微镜（莱卡激发波长330～380nm紫外光UV-2A滤光片）；（2）实验耗材：盖玻片（12×12mm）；载玻片（76×26mm）；甲醇；冰乙酸；荧光染料Hoechst33258；封片液；吸管；六孔板；细胞培养液（MEM完全培养基和五抗生素MEM培养基）；1xPBS；细胞消化液（0.25%胰蛋白酶液）（3）待检细胞：将待检细胞传1～2代，每次培养3～5d，作为待检样品（4）盖玻片准备：盖玻片处理同载玻片，擦净后干燥用无菌去离子水2～8℃保存待用。

（5）载玻片准备：玻片置于自来水中加洗涤剂煮20min，然后用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗3次，放入去离子水中2～8℃待用实验试剂试液配制：(1)固定液配制:甲醇:冰乙酸（3:1）混匀，现配现用；(2)二苯甲酰胺荧光染料(3)封片液；(4)1×PBS细胞样品制备及实验步骤（1）待检细胞处理：①将长成致密单层的细胞用0.25%的胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，800～1000r/min离心5min，弃上清胰蛋白酶混合液，所沉淀的细胞用1×PBS洗1次，离心条件相同；用细胞生长液按实验要求稀释至 1×105/ml，加入3ml/孔至6孔板中（6孔板中事先加入盖玻片），在5%CO2，37℃孵箱中培养3～5天；（2）固定：用枪头吸出六孔板中的培养液，用1×PBS清洗六孔板5ml，吸出，加入新配制的固定液5ml，放置5min，吸出；再加新固定液到六孔板中放置10min，用枪头吸出；（3）清洗细胞：加入5ml蒸馏水至六孔板，3min，清洗三次；（4）染色：每孔加入33258荧光染料工作液2ml，室温避光放置30min。

利用无标记的分子信标及核酸染料Hoechst 33258检测特定序列核酸向东山;翟琨;向文军;王联芝【摘要】利用无标记的分子信标及核酸染料Hoechst 33258建立了一种高灵敏、高选择性的特定序列核酸检测方法,并以野生型乙型肝炎病毒的一段寡核苷酸序列为目标DNA,对这种方法进行了验证。

在此体系中,分子信标的茎完全设计成C/G 碱基对。

在没有目标DNA时,Hoechst 33258与分子信标作用较弱,其荧光信号很弱；当有目标DNA存在时,分子信标与目标DNA杂交形成双链,Hoechst 33258与双链DNA作用后荧光信号显著增强。

在优化条件下,目标DNA浓度在2×10-10~2×10-8 mol/L 范围内时,Hoechst 33258的荧光强度(△I)与目标DNA的浓度(C)之间具有良好的线性关系,回归方程为△I=3.3439C﹢18.6949(R2=0.9982),方法检出限(3σ)为9×10-11 mol/L。

此方法操作简单、检测速度快、灵敏度高、重现性好、检出限低。

%A highly sensitive and selective method for specific DNA sequence detection is developed using a non-labeled molecular beacon (MB) and a nucleic acid dye Hoechst 33258. It is demonstrated by a specific DNA sequence of wild-type HBV as a model system. In this strategy, the stem of MB is completely designed as C/G base pairs. In the absence of target DNA, the interaction between Hoechst 33258 and the MBs is very weak,and the fluorescence signals of Hoechst 33258 is very low. In the presence of target DNA, the MBs hybridize with the target DNA and form double-stranded structure. Hoechst 33258 binds to dsDNA, and the fluorescence intensity is significantly enhanced. Under the optimum conditions, the fluorescence intensity of Hoechst 33258 exhibits goodlinear dependence on target DNA concentration in the range of 2 × 10-10-2 × 10-8 mol/L. The fitted regression equation is △I=3. 3439C(10-10 mol/L) ﹢18. 6949(R2=0. 9982) with a correlation coefficient of 0. 9982 (R2), and the detection limit is 9 × 10-11 mol/L (3σ). The proposed method has good precision, simple operation, fast detection speed, low detection limit, high accuracy and high sensitivity.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】5页(P1211-1215)【关键词】无标记分子信标;Hoechst 33258;单链核酸;荧光【作者】向东山;翟琨;向文军;王联芝【作者单位】湖北民族学院生物资源保护与利用湖北省重点实验室，恩施445000; 湖北民族学院化学与环境工程学院，恩施445000;湖北民族学院化学与环境工程学院，恩施445000;四川文理学院化学化工学院，达州635000;湖北民族学院化学与环境工程学院，恩施445000【正文语种】中文1 引言特定序列单链核酸(DNA)的特异性检测在临床诊断、基因治疗、环境调查、食品安全及生物医学研究等领域都具有十分重要的意义［1～5］。

hoechst染色原理Hoechst染色原理。

Hoechst染色是一种常用的核酸染色方法，它可以将细胞核内的DNA染成蓝色，对于细胞核的观察和分析具有重要意义。

Hoechst染色原理的了解对于科研工作者和临床医生都具有重要的意义。

下面我们就来详细了解一下Hoechst染色的原理。

Hoechst染色的原理主要是利用Hoechst染料与DNA结合的特性。

Hoechst染料是一类荧光染料，它可以与DNA中的腺嘌呤结合形成复合物，从而发出蓝色荧光。

Hoechst染料有Hoechst 33342和Hoechst 33258两种，它们在DNA中的结合方式略有不同，但都能够有效地染色细胞核。

在进行Hoechst染色时，首先需要将Hoechst染料溶解在适当的溶剂中，制备成一定浓度的染色液。

然后将待染细胞放置在含有Hoechst染色液的培养基中，经过一定时间的孵育，细胞核内的DNA就会被Hoechst染料染成蓝色。

之后，可以通过荧光显微镜观察染色效果，细胞核会发出蓝色荧光，从而可以清晰地看到细胞核的形态和数量。

Hoechst染色的原理非常简单，但是它在细胞生物学和分子生物学研究中有着广泛的应用。

通过Hoechst染色，可以清晰地观察细胞核的形态和数量，对于细胞周期的研究和细胞凋亡的检测都非常有帮助。

此外，Hoechst染色还可以用于细胞分选和细胞核的提取等实验操作中。

在临床医学领域，Hoechst染色也具有重要的应用价值。

通过Hoechst染色，可以对肿瘤细胞进行染色观察，帮助医生进行癌细胞的鉴定和分类。

同时，Hoechst染色还可以用于临床病理学的检测中，对于一些细胞核异常的疾病具有辅助诊断的作用。

总的来说，Hoechst染色原理简单易懂，但是在科研和临床中具有非常重要的应用价值。

通过Hoechst染色，可以清晰地观察细胞核的形态和数量，对于细胞生物学和分子生物学研究有着重要的意义。

希望大家能够充分了解Hoechst染色的原理和应用，为科研工作和临床诊断提供更多的帮助。

Hoechst 33258染色一、原理Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的非嵌入性蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

它们在细胞DNA聚AT富集区域的小沟处与DNA结合。

活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料，从而使细胞核着色，故又把此类染料称为DNA探针。

在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。

Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察细胞核形态或流式细胞仪检测，也可以用于常规的DNA染色。

用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。

二、操作步骤1. 凋亡细胞活染：⑴接种适量细胞于培养板中，诱导细胞凋亡后，吸尽培养板中的培养基，PBS漂洗5分钟；⑵加入Hoechest 33258荧光染料工作液，室温或37℃孵育15~30分钟；⑶PBS洗两遍，每次2~3分钟（选做步骤）；⑷荧光显微镜下观察。

2. 细胞固定染色：⑴接种适量细胞于培养板中，细胞诱导凋亡后，吸尽培养基，PBS漂洗5分钟；⑵甲醇：冰乙酸（3：1）固定15分钟，PBS漂洗5分钟；⑶加入Hoechest 33258（荧光染料工作液，室温或37℃孵育15~30分钟；⑷PBS洗两遍，每次2~3分钟（选做步骤）；⑸荧光显微镜下观察。

三、结果判断：该染料为DNA的特异性荧光探针，细胞核呈亮蓝色荧光1．形态学观察：凋亡细胞由于染色质固缩，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

2、凋亡率计算：计数至少10个含染色10-50细胞视野的细胞，细胞总数不少于300个。

凋亡细胞数凋亡率（%）=总细胞数四、注意事项：⑴Hoechst 33258对人体有害，请戴一次性手套操作。

Hoechst染料：Hoechst 33258、Hoechst 33342 和Hoechst 34580编号：Hoechst 染料是用于染色DNA 的蓝色荧光染料家族的一部分。

这些双苯亚胺最初是由Hoechst AG 开发的，该公司对其所有化合物进行了编号，比如染料Hoechst 33342 是该公司生产的第33342 种化合物。

激发/发射光谱：有三种相关的Hoechst 染料：Hoechst 33258、Hoechst 33342 和Hoechst 34580。

三种染料都可被大约350 nm 的紫外光激发，并且都在461 nm 的最大发射波长附近发出蓝色/靛色荧光。

染料Hoechst 33258 和Hoechst 33342 是最常用的染料，激发/发射光谱也比较接近。

未结合染料在510-540 nm 范围内具有最大荧光发射。

差异：Hoechst 33342 的额外乙基使其更具亲脂性，渗透膜的能力比Hoechst 33258 更强。

可以向Hoechst 33258 中添加氯乙基，溴乙基，氯丙基等基团制备一系列Hoechst 33258 的氨基甲酸酯衍生物作为潜在的抗癌药。

溶解和储存：Hoechst染料可溶于水和有机溶剂，如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

浓度最高可达10 mg/mL 。

避光时，水溶液在2-6°C 下可稳定至少六个月。

对于长期储存，溶液需在≤-20 °C 下冷冻。

工作液：使用PBS 或者其他合适缓冲液将母液稀释成0.5-10 μg/mL 工作液。

工作液浓度可根据自身实验需要进行调整。

染料与双链DNA 的小沟结合，优先选择富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的序列。

尽管染料可以与所有核酸结合，但富含AT 的双链DNA 链可显着增强荧光。

Hoechst 染料具有细胞渗透性，可以与活细胞或固定细胞中的DNA 结合，通常用作另一种核酸染色剂（DAPI）的替代物。

因此，这些着色通常被称为超活体，这意味着细胞在这些化合物的处理下存活下来。

SOP13广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡●基本原理:Hoechst 33258，也称bisBenzimide H33258或HOE33258。

分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。

Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。

Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。

Hoechst 33258 为特异性DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经 70% 冷乙醇固定的细胞可立即染色。

而活细胞的着色是渐进性的，在 10min 内可达饱和。

在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。

Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。

Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。

●试剂与器材1. Hoechst 33258 贮存液：称取 Hoechst 33258 试剂1mg ，用 20ml 蒸馏水溶解后，滤过，4℃ 避光保存。

用时蒸馏水 10 倍稀释成染色液。

2. 封片液（ pH5.5 ）： 20mmol/L 柠檬酸； 50mmol/L 磷酸氢二钠； 50% 甘油，3. 细胞固定液 4%多聚甲醛，现配。

操作步骤1. 将贴壁细胞以5×105 /ml或其他适宜的密度接种于用35mm培养皿或其他培养器具中，35mm培养皿每孔1.5- 2ml，37℃ 、 5%CO 2孵箱中培养至细胞贴壁，加入实验药物，继续培养过夜。

hoechst染色原理
目前最常用的染色方法是荧光染色法。

这种染色法利用荧光标记的染料与待测样品中的目标分子特异性结合，从而实现对目标分子的检测。

在荧光染色法中，常用的染料有荧光素（Fluorescein）、罗丹明（Rhodamine）以及具有更高荧光强度的荧光素衍生物，如荧兴蓝（FluoroX blue）和荧兴绿（FluoroX green）等。

这些染料具有荧光物质的特点，可以吸收特定波长的光，然后发射出特定波长的荧光。

在荧光染色法中，待测样品首先与染料进行孵育反应，使染料与目标分子特异性结合。

随后，通过荧光显微镜或荧光探针对结合后的染料进行观察和检测。

荧光显微镜可以通过特定的滤光片选择性地观察染料激发和发射的荧光信号，从而实现目标分子的定位和定量分析。

总的来说，荧光染色法利用荧光标记染料与目标分子的特异性结合，通过观察和检测染料的荧光信号来实现目标分子的定位和定量分析。

这种方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，因此在生物医学领域的研究和临床应用中得到了广泛应用。

SOP13广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡●基本原理:Hoechst 33258，也称bisBenzimide H33258或HOE33258。

分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。

Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。

Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。

Hoechst 33258 为特异性DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经 70% 冷乙醇固定的细胞可立即染色。

而活细胞的着色是渐进性的，在 10min 内可达饱和。

在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。

Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。

Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。

●试剂与器材1. Hoechst 33258 贮存液：称取 Hoechst 33258 试剂1mg ，用 20ml 蒸馏水溶解后，滤过，4℃ 避光保存。

用时蒸馏水 10 倍稀释成染色液。

2. 封片液（ pH5.5 ）： 20mmol/L 柠檬酸； 50mmol/L 磷酸氢二钠； 50% 甘油，3. 细胞固定液 4%多聚甲醛，现配。

操作步骤1. 将贴壁细胞以5×105 /ml或其他适宜的密度接种于用35mm培养皿或其他培养器具中，35mm培养皿每孔1.5- 2ml，37℃ 、 5%CO 2孵箱中培养至细胞贴壁，加入实验药物，继续培养过夜。