应用流式细胞技术快速定量检测UHT奶产品中的微生物

应用宏基因组测序技术检测UHT牛乳中的微生物黄卫强;张家超;张和平【期刊名称】《中国乳品工业》【年(卷),期】2015(043)007【摘要】以A和B两份国内不同品牌的成品超高温瞬时灭菌(Ultra High Temperature treated,UHT)牛乳为研究对象,通过基于宏基因组DNA 16SrRNA 基因V1-V3可变区的高通量测序手段对样品中微生物多样性丰度进行了研究.分类学门水平的微生物群落结构显示,两份UHT牛乳中的微生物主要隶属于厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)四个菌门.分类学属水平的微生物群落结构显示,两份UHT牛乳中的微生物多样性丰度存在一定的差异,但差异不显著.本研究虽无法准确定位导致差异的因素,但仍可为后续UHT乳的理论研究及原料乳和UHT牛乳产品处理工艺的提升提供一定的数据基础.同时,该研究也侧面反映宏基因组测序技术在UHT牛乳中微生物多样性的检测方面具有很大的优势,可作为相关实际生产中重要的配套技术进行应用推广.【总页数】4页(P55-58)【作者】黄卫强;张家超;张和平【作者单位】内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,呼和浩特010018【正文语种】中文【中图分类】TS252.7【相关文献】1.宏基因组测序技术在传统酿造食品微生物群落分析中应用研究进展 [J], 高航;张欣;赵燕;王文平;续丹丹;王鹏2.宏基因组测序技术在儿童急性淋巴细胞白血病化疗后感染病原体检测中的应用[J], 黎巧茹;李丽羽;赖文英;林春燕;朱蔼欣;陈琼;黄春辉3.宏基因组测序技术在不同年龄段儿童重症肺炎病原检测中的应用 [J], 姚仲伟;李美锦;林虹;苏淑芬;吴松;韩争争;郑亦男4.宏基因组的二代测序技术在初治失败社区获得性肺炎患者病原菌检测中的应用价值 [J], 林明珍;赵磊5.《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》解读[J], 罗越;胡洋洋;张兴;王亚东;赵彩彦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生鲜牛乳中体细胞的测定方法生鲜牛乳中体细胞的测定方法是评估乳品卫生质量的关键指标之一。

体细胞数量是衡量乳品是否存在炎症反应、感染或乳房损伤的重要指标。

以下是关于生鲜牛乳中体细胞的测定方法的详细描述：1. 显微镜法：将鲜乳样品制备成薄层，使用显微镜观察并计数乳中的体细胞数量。

这种方法需要专业操作人员具备显微镜技巧，并可能存在主观误差。

2. 流式细胞术：通过染色或其他标记技术，将乳中的细胞与其他成分分离开来。

然后使用流式细胞术仪器对分离出的细胞进行计数和分类。

这种方法精确度高，但设备和技术要求较高。

3. 冷光检测法：利用冷光法结合细胞特异性染色，可以快速精确地测定乳中体细胞数量。

这种方法需要专用的冷光检测仪器，并适用于批量样品处理。

4. 分光光度法：通过对乳中体细胞与其他成分的差异吸光度进行测定，推算出体细胞数量。

这种方法需要建立标准曲线并确保操作准确。

5. PCR法：利用聚合酶链反应（PCR）技术，可以扩增乳中体细胞所含的特定DNA序列，然后通过定量PCR进行体细胞数量的测定。

这种方法需要相应的基因分析设备和技术。

6. 培养方法：将乳样中的细胞进行培养，以促使其生长和分裂。

然后对培养后的细胞进行计数或进一步分析。

这种方法需要一定时间来完成培养和分析，且可能存在细胞失活或增殖的影响。

7. 图像处理方法：通过对乳中细胞的图像进行处理和分析，以获得体细胞的数量和特征。

这种方法需要图像处理软件和算法，并可能受到图像质量的限制。

8. 酶法：利用某些酶的反应特性，对乳中体细胞进行特异性检测并计数。

这种方法需要相应的酶试剂和仪器支持，并可能受到酶底物和反应条件的影响。

9. 免疫学方法：通过对乳中细胞进行特异性抗体检测，可以进行体细胞数量的测定。

这种方法需要合适的抗体选择和免疫技术支持。

10. 纳米技术方法：利用纳米材料、纳米探针等纳米技术手段，可以实现对乳中体细胞的快速、灵敏和准确的测定。

这种方法需要纳米技术的专业知识和设备支持。

流式细胞仪在检测食品中微生物的应用研究何方洋;万宇平;贾芳芳;吴小胜;罗晓琴【期刊名称】《山东畜牧兽医》【年(卷),期】2016(037)008【总页数】3页(P82-84)【作者】何方洋;万宇平;贾芳芳;吴小胜;罗晓琴【作者单位】北京勤邦生物技术有限公司北京昌平 102206;北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心;北京勤邦生物技术有限公司北京昌平 102206;北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心;北京勤邦生物技术有限公司北京昌平102206;北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心;北京勤邦生物技术有限公司北京昌平 102206;北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心;北京勤邦生物技术有限公司北京昌平 102206;北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心【正文语种】中文【中图分类】S811.6流式细胞仪（flow cytometer）是流式细胞术的商品化应用，它作为新型高科技仪器，已应用于临床医学、微生物学、海洋、渔业、酿酒、畜牧、体育科学、农业、林业、化工等领域，本文着重介绍了目前流式细胞仪在检测食品中微生物的应用研究。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一项细胞分析技术，不仅能够快速定量分析和分选液流系统中单个细胞或其它生物微粒，而且可以实现分类收集特定细胞或细胞器。

流式细胞仪（ flow cytometer）是流式细胞术的商品化应用，它作为新型高科技仪器，已应用于临床医学、微生物学、海洋、渔业、酿酒、畜牧、体育科学、农业、林业、化工等领域，随着科学技术的发展，流式细胞仪在检测食品中微生物方面应用发展起来［1］。

检测食品中微生物是评价食品卫生的一个重要指标，目前发布的国家标准、行业标准以及地方标准中涉及到的食品中微生物的检测方法主要有：交叉引物恒温扩增检测方法、环介导恒温核酸扩增（LAMP）法、免疫磁珠法、分子分型SPA基因分型方法、荧光PCR法、Baird-parker琼脂培养基计数法、电泳和免疫印迹法、免疫色谱反应法、酶联免疫法等［2-10］。

新技术在食品微生物检验检测中的应用分析食品安全是人们关注的热点问题之一，食品微生物检验检测是确保食品安全的重要手段。

随着科技的发展，新技术在食品微生物检验检测中的应用越来越广泛，有效提高了食品安全水平。

本文将对新技术在食品微生物检验检测中的应用进行分析。

PCR技术是目前微生物检验检测中最常用的新技术之一。

PCR技术通过扩增DNA片段来检测微生物的存在与否。

相比传统的培养法，PCR技术具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优点。

利用PCR技术可以快速检测到微生物的存在，并且能够同时检测多种微生物，提高了检测的效率和准确性。

流式细胞术（Flow cytometry）是近年来在食品微生物检验检测中广泛应用的新技术。

流式细胞术通过激光照射将微生物分离并计数，可以快速实现对微生物的检测。

与传统的培养法相比，流式细胞术具有检测速度快、操作简便等优点。

流式细胞术还可以对微生物进行分型，从而更准确地判断是否为有害微生物。

基于基因测序的技术也逐渐应用于食品微生物检验检测中。

通过基因测序，可以明确微生物的基因序列，进一步了解微生物的种类和属性。

这可以帮助鉴别食品中存在的微生物是否有害以及危害程度。

通过基因测序，可以为食品安全提供更为精准的判断依据，有助于减少风险。

生物芯片技术也被应用于食品微生物检验检测中。

生物芯片技术通过将微生物的靶标DNA与芯片上的探针结合，可以同时检测多种微生物。

与传统的培养法相比，生物芯片技术可以提高检测速度和准确性。

通过微阵列的形式，可以在同一芯片上检测多种微生物，大大提高了检测效率。

新技术在食品微生物检验检测中的应用对提高食品安全水平起到了积极的作用。

通过PCR技术、流式细胞术、基因测序技术和生物芯片技术等新技术的应用，可以快速、准确地检测食品中的微生物，为食品安全提供更有效的保障。

随着新技术的不断发展，相信在未来会有更多的新技术应用于食品微生物检验检测中，进一步提高食品安全水平。

牛奶中嗜冷菌危害及其检测方法摘要: 虽然低温保藏及冷链技术限制了牛奶中微生物的繁殖与代谢, 但是在低温环境中恰恰非常适合嗜冷菌的生长代谢, 并影响牛奶质量。

生产中通常用巴氏杀菌和超高温灭菌来杀灭牛奶中的嗜冷菌, 却无法消除由嗜冷菌所分泌的较高的耐热性的脂肪酶和蛋白酶, 进一步影响乳及乳制品风味质地。

因此快速检测牛奶中的嗜冷菌, 对于控制生牛奶中嗜冷菌繁殖、提高乳制品产品质量、延长货架期等都具有重要的现实意义。

本文主要总结与讨论了牛奶中嗜冷菌的危害以及几种常见的对原料奶中嗜冷菌快速检测的方法, 包括直接荧光过滤技术、电阻抗法、酶联免疫吸附法、流式细胞计数法、氨肽酶法、聚合酶链反应结合酶联免疫吸附法, 并将它们在工业应用上的优缺点进行了比较。

关键词: 嗜冷菌; 原料乳; 快速检测; 危害ABSTRACT: The techniques of cryopreservation and cold chain limit the microbial reproduction and metabolism in milk. However, a low temperature environment is very suitable for the growth and metabolism of psychrophilic bacteria. Pasteurized and ultra high temperature sterilization is usually used to kill psychrophile, but they are unable to remove the heat-resistant lipase and protease produced by the psychrophile, finally to affect the flavor and texture of dairy products. Therefore, rapid detection of milk psychrophile in raw milk is important for microbial control, quality improvement and shelf-life extending. This paper summarizes and discusses the hazards of psychrophile in milk, as well as several common rapid detection methods for psychrophile in raw milk. These methods include direct fluorescence filtering technology, electrical impedance method, enzyme- linked immunosorbent assay, flow cytometry,aminopeptidase enzyme,. The advantages and disadvantages in industrial application are also compared.KEY WORDS: psychrophilic bacteria; raw milk; rapid detection; hazard引言嗜冷菌是一类菌的总称, 这类菌一般是在0℃～20℃之间最适宜生长, 由于这个温度范围与其他菌的最适生长温度范围相比要低很多, 故此得名嗜冷菌。

乳制品中快速微生物检测技术分析文段潇潇澳优乳业（中国）有限公司伴随着人们生活水平的提升，乳制品已变成大家生活起居的必需品，促进了乳制品制造业的发展。

殊不知，在现如今乳制品制造业的发展过程中，消费者越来越关心乳制品生产的环境卫生和安全性，这也是乳制品制造业的一个难题。

因为微生物会严重损害乳制品的品质，因而必须对乳制品中的微生物进行检测。

传统式的微生物检测方法是微生物取样和工程施工检测，可是工程施工时间都较长，对工作人员实际操作过程中的专业能力明确提出了要求。

对此，乳制品企业需要对乳制品中微生物的检测方法进行改善，促进检测技术的发展。

本文对乳制品中快速微生物检测技术进行分析，希望能够对我国乳制品企业有所帮助。

1. ATP生物荧光快速检测技术如果想要快速、准确地获取乳制品中的微生物含量，乳制品企业可以使用ATP生物荧光快速检测技术。

ATP 生物荧光快速检测技术可以迅速得到定量的结果，被我国企业广泛应用。

在使用ATP生物荧光快速检测技术时，需要使用到一些检测的设备，如A TP荧光检测仪，大体分为两种：手持型的A TP荧光检测仪与商业无菌型的A TP 荧光检测仪。

两者相比较来说，手持的A TP荧光检测仪较为低端，利用手持型的A TP荧光检测仪进行检测的过程中，只需要相关人员进行取样操作，A TP荧光检测仪就可以对已经取到的样品中所含的A TP进行提取并在提取的过程中对法和间接阻抗法。

间接阻抗检测法大多用于乳制品在生产过程中的检测。

直接阻抗法检测时由于所检测的样品会干扰阻抗的测量，这种情况一直未得到处理，因此对乳制品进行检测后所得到的数据可靠性很低。

因此，乳制品企业在采用电阻抗法技术时大多使用间接阻抗检测法。

3. 流式细胞计数法流式细胞计数法可以对细胞进行具体的检测，并且可以同时进行多个参数的测量，它所得到的信息主要来自特异性荧光信号以及非荧光散射信号。

因此，运用流式细胞计数法主要是通过对细胞的各项参数进行检测和分析，从而得出乳制品中微生物的含量。

微生物检测技术中的流式细胞术的应用教程流式细胞术是一种广泛应用于微生物检测技术的高效、准确的方法。

它利用流式细胞仪对微生物细胞进行快速而准确的检测和分析，为微生物学研究、病原体诊断和环境监测等领域提供了重要的工具。

本文将为读者介绍流式细胞术的基本原理、实验步骤和常见应用。

流式细胞术的基本原理是利用流式细胞仪的光学系统将待测样品中的微生物细胞逐个通过一个狭窄的流道，并通过激光束照射细胞，然后测量经过细胞的散射和荧光信号。

利用这些信号，流式细胞仪可以快速确定微生物细胞的数量、大小、形态以及特定标记物的表达情况，从而对样品进行定性和定量分析。

在进行流式细胞术前，首先需要准备样品。

样品可以是来自培养基中生长的微生物细胞、环境样品（如水、土壤）中的微生物细胞，或者是体内组织、血液等样品中的微生物细胞。

样品通常需要进行处理，如细胞固定、细胞染色或荧光标记等，以便流式细胞仪可以准确识别和测量细胞。

接下来是样品的处理和染色步骤。

在流式细胞术中，常用的样品处理方法包括离心、过滤等，以获得单个细胞的悬浮液。

然后，可以通过荧光染色或标记物标记细胞，以便流式细胞仪可以进行荧光检测。

染色既可以针对整个样品中的细胞，也可以特异性染色，以检测感兴趣的微生物细胞。

样品处理和荧光染色完成后，就可以开始使用流式细胞仪进行细胞检测和分析了。

将样品注入流式细胞仪的进样室中，仪器会将细胞逐个引入流道，并通过激光照射细胞。

细胞与激光相互作用后，产生的信号会被流式细胞仪捕捉和测量。

流式细胞术常用的参数有三个：前向散射光（forward scatter, FSC）、侧向散射光（side scatter, SSC）和荧光信号。

前向散射光与细胞的大小和形态相关，侧向散射光与细胞的复杂度和颗粒含量相关，而荧光信号则与标记物的特异性结合情况相关。

通过测量和分析这些参数，可以获得关于细胞数量、大小、形态和特定标记物表达的信息。

除了基本的细胞检测和分析，流式细胞术还可以进行更加复杂的功能性分析和分选操作。

流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展流式细胞术是一种通过分析单个细胞的物理和化学特性来研究细胞群体的技术。

在食品微生物检测领域，流式细胞术具有很大的潜力和应用前景。

本文将介绍流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展。

流式细胞术可以实现对食品中微生物的快速检测。

传统的微生物检测方法通常需要对样品进行预处理，如培养和分离，这会花费很长时间。

而流式细胞术可以直接对复杂样品进行检测，不需要复杂的处理步骤，因此可以大大缩短检测时间。

可以直接对食品样品中的细菌进行快速计数和鉴定，从而及时检测出可能存在的致病微生物。

流式细胞术可以提供更精确的微生物分析结果。

传统的微生物检测方法通常是通过培养细菌并进行可视化观察来鉴定微生物种类。

一些微生物在培养条件下可能有较低的生长率或不易培养，导致其未能被正确鉴定。

而流式细胞术可以通过测量细胞的物理和化学特性，如大小、形状、荧光等来鉴定微生物，可以避免这些问题。

流式细胞术还可以同时检测多个指标，如菌落形成单位和细胞活力等，从而提供更全面的微生物分析结果。

流式细胞术还可以结合其他分析技术进行综合分析。

流式细胞术可以提供细胞群体水平的信息，但对于单个细胞的详细分析有限。

而其他分析技术，如基因测序和质谱等，可以提供更详细的单个细胞分析结果。

流式细胞术与其他技术的结合可以实现对微生物的更全面和深入的分析。

流式细胞术在食品微生物检测领域具有研究进展。

未来，需要进一步优化流式细胞术的方法和技术，以提高其检测效率和准确性。

还需要加强流式细胞术与其他分析技术的结合，实现对微生物的更全面和深入的研究。

相信随着技术的不断发展，流式细胞术在食品微生物检测领域的应用前景将会更加广阔。

基金项目:上海市优秀技术带头人计划(编号:２０X D １４３０１００);上海乳业生物工程技术研究中心(编号:１９D Z ２２８１４００)作者简介:祁岩,女,光明乳业股份有限公司研究员,博士.通信作者:游春苹(１９８２ ),女,光明乳业股份有限公司正高级工程师,博士.E Ｇm a i l :y o u c h u n p i n g ＠b r i g h t d a i r y．c o m 收稿日期:２０２２Ｇ０８Ｇ１８㊀㊀改回日期:２０２２Ｇ１０Ｇ１４D O I :１０．１３６５２/j ．s p jx ．１００３．５７８８．２０２２．８０６９９[文章编号]１００３Ｇ５７８８(２０２３)０２Ｇ０２２１Ｇ０６流式细胞术在乳品微生物检测中的应用A p p l i c a t i o no f f l o wc y t o m e t r y i nm i c r o b i a l d e t e c t i o no f d a i r ypr o d u c t s 祁㊀岩１,２,３Q IY a n １,２,３㊀游春苹１,２,３Y O UC h u n Ｇp i n g１,２,３(１．乳业生物技术国家重点实验室,上海㊀２００４３６;２．上海乳业生物工程技术研究中心,上海㊀２００４３６;３．光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海㊀２００４３６)(１．S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f D a i r y B i o t e c h n o l o g y ,S h a n g h a i ２００４３６,C h i n a ;２．S h a n g h a iE n g i n e e r i n gR e s e a r c hC e n t e r o f D a i r y B i o t e c h n o l o g y ,S h a n g h a i ２００４３６,C h i n a ;３．D a i r y R e s e a r c hI n s t i t u t e ,B r i gh t D a i r y a n dF o o dC o ．,L t d ．,S h a n g h a i ２００４３６,C h i n a )摘要:阐述了流式细胞仪的工作原理㊁结构及流式细胞术在乳品微生物检测中的方法和应用,并展望了未来的研究方向.关键词:流式细胞术;乳品;微生物;检测A b s t r a c t :T h e p r i n c i p l e sa n ds t r u c t u r e so f f l o w c y t o m e t e r ,t h e m e t h o d s a n d a p p l i c a t i o n s o f f l o wc y t o m e t r yi nm i c r o b i a l d e t e c t i o n o f d a i r yp r o d u c t sw e r e i n t r o d u c e d i nt h i s r e v i e w ,a n dt h e f u t u r e r e s e a r c hd i r e c t i o nw a s p r o s p e c t e d ．K e y w o r d s :f l o w c y t o m e t r y ;d a i r y p r o d u c t s ;m i c r o o r g a n i s m ;d e t e c t i o n乳是理想的天然食品之一.它包括多种品类,例如液态乳㊁发酵乳制品(如酸奶和奶酪)和经干燥提炼后的乳制品(如奶粉和炼乳)[１].乳品中可能存在多种微生物,有影响产品质量和消费者健康的腐败菌和致病菌,也有可以改善乳品发酵工艺和功能性的益生菌.鉴于微生物对乳品的影响,目前乳品微生物检测越来越受到关注.现阶段,常用的乳品微生物检测技术包括传统计数法㊁免疫分析检测技术㊁P C R 技术㊁A T P 生物荧光技术和基因芯片技术等[２－３].这些技术在乳品微生物检测方面各有优势,也各有不足之处,如传统计数法检测成本低㊁操作简单,但检测时效长.传统P C R 技术快速㊁简单,但无法区分死活细胞.流式细胞术是应用流式细胞仪,对悬浮单细胞进行快速定量分析和分选,是集电子技术㊁激光技术和计算机技术于一体的先进的生物学测定技术,具有高灵敏度㊁高通量㊁高精确度和多参数检测等多个功能特征[４－５].流式细胞术起初应用在医学临床检验领域,随着科技的发展和仪器不断的改进与完善,目前该技术已被应用于分子生物学㊁免疫学㊁病毒学㊁癌症生物学㊁传染病监测和食品检测等多个学科[４,６].近年来,流式细胞术在乳品微生物检测领域发挥了广泛的作用.文章拟结合国内外相关研究,探讨流式细胞术在乳品微生物检测方面的进展,旨在为流式细胞术在乳品领域中进一步的开发提供参考.１㊀流式细胞术１．１㊀流式细胞术的发展流式细胞术最早可追溯到２０世纪３０年代.１９３４年,M o l d a v e n 提出了流式细胞仪的概念原型,他设想让细胞检测自动化,并使光电记录仪记录通过单根毛细管的细胞数量.１９４９年,C o u l t e r 提出了在悬液中计数粒子的方法.１９５３年,P a r k e r 和H u t c h e o n 描述了全血细胞计数装置,是流式细胞仪的雏形.１９６７年,K a m e m t s k y 和M e l a m e d 提出了细胞分选方法.１９６９年,V a n D i l l aF u l w y l e r 等发明了第一台荧光检测细胞仪.２０世纪７０年代,流式细胞术开启了商业化进程,一批生产流式细胞仪的公司如B e c t o nD i c k i n s o n 和B e c k m a nC o u l t e r 逐渐涌现;９０年代开始,流式细胞术迈向了低成本㊁易操作㊁多用途㊁高精尖的发展历程.迄今为止,流式细胞术的发展已日臻完善,研究人员越来越侧重于检测样品的制备㊁软件开发等方面,以扩大流式细胞术在不同领域的应用范围[７－８].F O O D &MA C H I N E R Y 第３９卷第２期总第２５６期|２０２３年２月|１．２㊀流式细胞仪的工作原理和结构流式细胞仪的基本工作原理是利用激光对鞘液中的染色细胞标志物进行测量,并记录其荧光宽度㊁荧光强度和散射光强度等参数[８].传统的流式细胞仪主要由液流系统㊁光学系统和电子系统三部分组成(图１).液流系统包括液流驱动系统和流动室.液流驱动系统主要提供压力和进行压力调节.细胞悬液在压力作用下进入流动室,同时被加压后的鞘液也自鞘液管进入流动室,在鞘液的包被下,细胞悬液由流动室的喷嘴喷出形成细胞液柱.光学系统包括激发光源和光束收集系统.细胞液柱在激发光的照射下,产生荧光信号和散射光信号,之后,光束收集系统中的滤光片将荧光信号引导至特定检测器.电子系统将来自检测器的信号经过放大和模数转换使其成为计算机可以读取的数字信号,该信号被送至计算机,经过数据处理和分析得出结果.值得一提的是具有分选功能的流式细胞仪还包括了分选系统.细胞的分选是指将待测液滴给予不同电荷,使其在高压电场作用下发生偏转,落入指定的收集容器内,实现细胞的分离[６,１０－１２].图流式细胞仪结构示意图９F i g u r e１㊀S c h e m a t i c d i a g r a mo f f l o wc y t o m e t e r２㊀流式细胞术检测乳品微生物的方法应用流式细胞术检测乳品中微生物需要经过样品前处理㊁样品染色㊁流式细胞仪测定等过程.样品前处理方法㊁缓冲液的选择㊁荧光染料的选择等都会影响检测结果的准确性.２．１㊀样品前处理乳及乳制品中含有丰富的乳蛋白和乳脂肪等物质,在使用流式细胞仪检测前,需要经过一定的样品前处理以减少背景干扰.针对非液态乳品,需要将其转化为液体基质进行后续研究.W a n g等[１３]将奶粉溶于缓冲蛋白胨水中制成液相.Y a n a c h k i n a等[１４]采用液压奶酪压榨机将磨碎的奶酪挤出奶酪汁备用.针对液态乳品,通常的做法是将样品用纱布过滤去除杂质,用蛋白酶降解蛋白质,加入T r i t o n XＧ１００以破碎牛乳体细胞,通过离心实现脂肪分离[１５－１７].除了用通常的样品前处理方法,刘思渊等[１６]还采用牛奶中微生物快速纯化试剂盒处理样品,该试剂盒可直接去除牛奶中的脂肪和蛋白质颗粒,使样品纯化时间由传统的３０m i n缩短至１５m i n.２．２㊀缓冲液的选择样品经过前处理后得到细胞悬液.细胞悬液需要用缓冲液稀释,缓冲液中的阳离子含量可影响染色质量和检测结果.S a h a l a n等[１８]和K a t h r i n等[１９]均发现缓冲液阳离子缺乏可影响大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i)细胞膜的稳定性和活力,进而影响荧光信号,因此,建议用M g２＋和C a２＋来补充缓冲液.H a r u t a等[２０]研究表明使用标准缓冲液,经过流式细胞仪分析仅可检测到低于３０％的大肠杆菌和低于４０％的鼠伤寒沙门氏菌(S a l m o n e l l a T y p h i m u r i u m)阳性信号,而向标准缓冲液中添加C a２＋后,大肠杆菌阳性信号检出可达９０％以上,鼠伤寒沙门氏菌阳性信号检出可达８０％以上.K a t h r i n等[１９]还用磷酸缓冲盐溶液㊁M９缓冲盐溶液和T r i sＧH C l分别培养大肠杆菌,应用流式细胞仪进行检测,对比３种缓冲液对荧光信号的影响,发现磷酸缓冲盐溶液更适宜用于稀释.目前在乳品微生物检测中大多应用未补充阳离子的磷酸缓冲盐溶液,可建议在缓冲盐溶液中适当添加阳离子以提高检测质量.２．３㊀荧光染料的选择流式细胞术对乳品中微生物的定量以及活性的检测依赖于荧光染料.染料稳定性㊁染色强度等均影响染料作用效果[２１].表１列举了乳品微生物检测时常用的染料种类及原理.根据不同检测目的,可选择不同染料品类.孙芝杨等[１５]选用P I染料定量乳品的细菌总数.刘思渊等[１６]用偶联有荧光染料F I T C的细菌单克隆抗体对大肠杆菌O１５７:H７进行特异性标记,通过流式检测方法,快研究进展A D V A N C E S总第２５６期|２０２３年２月|表１㊀乳品微生物检测常用的荧光染料T a b l e １㊀F l u o r e s c e n t d y e c o mm o n l y u s e d f o rm i c r o b i a l d e t e c t i o no f d a i r ypr o d u c t s 染料名称原理用途参考文献碘化丙啶(P I)不能通过活细胞膜,仅能对膜受损的细胞进行染色７氨基放线菌素(７ＧA A D )与P I 作用相似,但发射波谱较P I 窄,是一种核酸染料,可发出红色荧光,不能透过正常质膜,随着细胞受损程度的增加,荧光强度越大噻唑橙二聚体Ｇ１(T O T O Ｇ１)核酸染料,不能通过正常细胞质膜,可发出黄绿色荧光信号溴化乙锭(E B )核酸染料,不能通过正常细胞质膜,可发出橙红色荧光信号单独使用可定量受损细胞;可以与S Y T O ９等染料双色联用,定量活细胞和死细胞[１５][２２][２３][２４]绿色荧光染料S Y T O ９/２４核酸染料,可对活和死细菌进行染色;染色效果可能由于不同细胞种类略有差异,因此研究者需要视情况选用不同型号的绿色荧光染料绿色荧光染料S Y B R G r e e n 可结合双链D N A 分子发出绿色荧光可与P I 等染料联用,用于定量活细胞和死细胞[２５－２６][２７－２８]吖啶橙(A O )染料可渗透入活细胞和死细胞中,并通过嵌入或静电吸引与D N A 和R N A 相互作用,结合单链D N A /R N A 可发出红色荧光,双链D N A 可发出绿色荧光可以准确检测革兰氏阴性菌和真菌,可定量活细胞和死细胞[２９]羧基荧光素双乙酸酯(c F D A )本为非荧光分子,扩散到细胞内,与胞内酶结合,产生荧光物质聚集于活细胞生成荧光产物,可在活细胞内进行积累.易受细胞种类的影响,可能由于胞内酶差异所致用于活细胞定量,可与P I 等染料联用[３０ ３１]异硫氰酸荧光素(F I T C )可与抗体蛋白结合作用于待检测细菌,并释放出绿色荧光对检测物质进行特异性标记,快速定量检测污染物质[１６]速定量牛乳中的大肠杆菌O １５７:H ７.H e 等[２５]采用S Y T O ９和P I 两种染料双色联用研究乳品中乳酸菌(L a c t i c a c i db a c t e r i a )的存活情况.经过染色后,流式细胞仪可通过检查荧光信号强度定量细胞总数或对细胞的死活以及损伤状态等方面进行判断.３㊀流式细胞术在乳品微生物检测中的应用３．１㊀乳品质量安全方面的应用目前乳品行业发展迅速,微生物引发的乳品质量安全问题也愈发凸显.微生物检测是监控乳品质量安全不可缺少的一个环节.现阶段,在乳品工业中,乳品微生物检测一般采用计数法,该方法需要对细菌进行增菌㊁培养等一系列步骤,耗时较长.多数乳品的保质期较短,需要尽快销售,所以当在实验室完成检测时,产品可能已经销售掉了.因此,需要进行乳品中微生物的快速且准确检测,帮助生产者对乳品质量实施在线控制并及时规避风险.流式细胞术可对乳品中的细菌总数及活菌数进行快速定量和鉴定.孙芝杨等[１５]用流式细胞术可在１h 内测得液态乳中细菌总数.L i u 等[３２]应用流式细胞仪通过高选择性荧光标记抗体和P I 定量奶粉和液态奶中金黄色葡萄球菌(S t a p h yl o c o c c u s a u r e u s )活菌数,可在６h 内(包括５h 增菌过程)检测出金黄色葡萄球菌,在奶粉和液态奶中的检出限分别为８．３０,７．５０m L －１.W n u k 等[２９]应用成像流式细胞仪(I m a g i n g f l o wc y t o m e t r y ,I F C )结合A O 染料,同时应用多个I F C 参数进行表征,成功且快速地筛选出牛奶中的８种细菌.表２为应用流式细胞仪快速检测乳品中微生物的相关参数,对比费时耗力的平板计数法,运用流式细胞术检测效率得到了极大提高,有助于乳品质量的保障.㊀㊀在乳品的有害菌中,还存在着一类活的非可培养态(V i a b l eb u t n o n Ｇc u l t u r a b l e ,V B N C )微生物,其引发的安全风险不容忽视.V B N C 意为微生物在不良环境下进入异常的生理状态,它们具有代谢活性,却不能被培养或进行繁殖,但在某些特殊复苏条件下,可恢复正常生理状态[３５－３６].在乳品加工中,存在着诸多环境胁迫因素,例如低p H ㊁低水分活度和抗生素,它们都可以诱导微生物进入V B N C 状态,使其在常规微生物检测中不能被发现.同时,还有研究[３７]表明V B N C 态的微生物比可培养态的微生物对抑菌物质具有更大的耐受性.因此,鉴别V B N C 态微生物在乳品质量安全领域具有实用价值.运用流式细胞术可通过细胞形态或生理情况等判断乳品中的V B N C 态微生物[３８－３９].Z h a n g 等[３９]应用流式细胞术等方法研究了用于奶牛疾病治疗的氨苄青霉素诱导阪崎|V o l ．３９,N o ．２祁㊀岩等:流式细胞术在乳品微生物检测中的应用表２㊀乳品微生物流式检测的相关系数T a b l e２㊀C o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t o fm i c r o b i a l f l o wc y t o m e t r y i nd a i r yp r o d u c t s 研究对象样品检测时间检出限参考文献沙门氏菌㊀㊀㊀奶粉＜７h(包括６h增菌)１(２５g)－１[１３]牛奶＜７h(包括６h增菌)２０C F U/m L[３３]金黄色葡萄球菌超高温瞬时灭菌奶４５~５５m i n１０３C F U/m L[３３]牛奶约３０m i n１０３C F U/m L[３４]大肠杆菌㊀㊀㊀超高温瞬时灭菌奶４０~６０m i n１０４C F U/m L[３３]牛奶６０m i n１０３C F U/m L[３３]单增李斯特菌㊀牛奶３０m i n１．３ˑ１０３C F U/m L[３３]克罗诺杆菌(C r o n o b a c t e r s a k a z a k i i)进入V B N C态的能力.阪崎克罗诺杆菌是污染奶粉的主要病原菌之一,它可对免疫力低下人群尤其是婴幼儿健康产生危害. Z h a n g等[３９]研究发现了１０４~１０５m L－１不可培养的活细菌,这些细菌可以在适宜条件下复苏,其形态较正常细胞不同,具有呼吸链活性,判断细菌进入了V B N C状态,及时避免了抗生素诱导的V B N C态阪崎克罗诺杆菌可能造成的健康风险.目前,国内外应用流式细胞仪评估乳品中V B N C态有害微生物的研究相对较少,仍需要进一步丰富.流式细胞术还可以通过检测乳品中有害微生物的生理状态快速评估加工工艺和抑菌物质的抑菌效果.L i 等[４０]应用流式细胞术和平板计数法对比了微波容积加热与传统的管式换热对脱脂牛奶中原生细菌和地衣芽孢杆菌(B a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s)及其内生孢子的灭活作用.两种检测方法均证明了微波容积加热与管式换热以相似的程度灭活了细菌和内生孢子.相比平板计数法,运用流式细胞仪检测速度较快,还可提供细胞渗透性等一系列生理数据,这些数据可以整合到未来乳品质量控制和风险评估策略中.M i e s z k i n等[４１]使用乳酸菌作为生物保护培养物防止发酵乳中酵母的腐败,应用流式细胞术评估了酵母活力㊁膜电位㊁细胞内p H和活性氧的产生,提供了乳酸菌抗真菌机制的信息,为防止乳制品真菌腐败的栅栏技术选取提供更多理论依据.３．２㊀乳品发酵方面的应用对乳酸菌进行定量分析是评估发酵剂和发酵乳制品质量的重要因素.中国制定了G B１９３０２ ２０１０«食品安全国家标准㊀发酵乳»,规定乳酸菌数ȡ１ˑ１０６C F U/m L (或C F U/g).益生菌常被加入发酵乳及乳饮料中,其菌种的生长和存活可以改善乳品发酵工艺和提高乳品的功能性.２０１５年１２月,国际标准化组织(I n t e r n a t i o n a l S t a n d a r dO p e r a t i o n,I S O)制定了标准化方法I S O１９３４４:２０１５,介绍了用流式细胞仪分析乳制品发酵剂中乳酸菌和益生菌的活性和总量.目前,已有研究人员采用流式细胞术对乳酸菌和益生菌展开了活细胞快速定量分析.杜耿记等[４２]采用流式细胞仪对２９种市售酸奶中的乳酸菌进行了快速定量检测,与传统的国标检测方法(G B ４７８９．３５ ２０１０)数据相近,且培养时间由４８h缩短至１３m i n,极大提高了检测速度.王杰等[４３]通过流式细胞术对发酵乳饮料和发酵乳中的乳酸菌快速检测,检测结果与平板计数法具有较好的相关性,且单样品检测时间不超过１０m i n.C h i r o n等[４４]应用流式细胞术结合多克隆抗体针对５种不同物种的益生菌进行了计数㊁鉴定和活力评估研究,该检测方法仅耗时２h.除了对发酵菌种进行快速定量检测外,流式细胞术还可检测发酵细菌的生理状态.Y a n a c h k i n a等[１４]采用流式细胞仪研究了不同盐分和脂肪含量在切达奶酪成熟过程中对发酵剂中细菌生理状态的影响,发现盐和脂肪水平的变化会影响发酵剂中细胞的自溶㊁透化以及细胞内酶释放等性能.P o u d e l等[２７]运用流式细胞仪研究了奶酪发酵剂中细菌在奶酪贮藏过程中的存活情况,发现奶酪中约５％的总发酵剂培养细胞在贮藏６d后死亡,另外３％~１９％的细胞被认定为具有半透性的活细胞,它们具备代谢活性,可释放细胞内酶进入奶酪,促使奶酪贮藏中风味物质的形成,由此可见,鉴定发酵菌细胞的生存状态对于评估乳制品的风味具有重要意义.４㊀结语与展望流式细胞术在乳品微生物检测领域已有一定的应用与发展,但仍存在一些不足.检测方法方面:①流式细胞仪价格昂贵,检测样品的制备和数据的分析都需要专业人员完成.目前,流式细胞仪大多在科研机构和医学领域应用,较难在工业界推广.②乳品样品的前处理方法仍有待开发和完善.液态乳㊁发酵乳㊁奶粉和奶酪已有相关前处理方法,但主要是针对蛋白质和脂肪的去除,消除其他乳品成分造成的背景信号干扰的相关研究仍较为缺乏.检测项目方面:检测项目较为单一,目前,多数研究围绕乳品中微生物快速定量或生理状态展开,研究内容有待进一步拓展.针对上述不足,流式细胞术可以从以下方面发展.检测方法方面:①使流式细胞仪便携化,目前智能手机类研究进展A D V A N C E S总第２５６期|２０２３年２月|似于微型计算机,具有通信㊁拍照㊁信息处理和加工等功能,可将智能手机上设定检测分析程序,远程对检测结果进行分析.②开发新型的智能化算法,使数据分析更为方便,同时也节约了人员培训的成本.③进一步挖掘样品前处理技术,尽最大可能减少不同种类乳品造成的背景干扰.检测项目方面:①应用流式细胞仪检测乳品加工管道中生物膜.生物膜可附着于管道㊁机械等地方,它可以对抗菌物质进行理化防御,降低抑菌效率.与浮游细菌相比,细菌生物膜更难以应付[４５－４６].因此,寻求快速量化该类菌体的方法显得至关重要.目前运用流式细胞仪检测乳品微生物的研究仍基本围绕浮游微生物展开,乳品管道内生物膜检测仍需补充.②进一步开发特异性抗体,鉴别不同种类甚至不同品系的菌种,为乳品中微生物的快速溯源提供有效支持.③将流式细胞术与组学技术相结合,通过流式细胞术可获得细菌表现型信息,组学技术可获得基因相关信息,更加清晰地了解乳品中微生物的生理状态.总之,乳品微生物检测一直是乳品工业界关注的热点.流式细胞术具有检测速度快,可鉴定细胞存活状态等优点,在乳品领域应用越来越广泛.随着时代的进步,流式细胞术也在不断地更新迭代,流式细胞术在检测中存在的问题也将会被一一解决.参考文献[1]郭本恒.乳品安全[M].北京:化学工业出版社,2015:3,179Ｇ195.GUO B H.Dairy safety[M].Beijing:Chemical Industry Press,2015: 3,179Ｇ195.[2]陈嘉惠,陈沁,钮冰.乳品中有害微生物检测技术的研究进展[J].中国乳品工业,2019,47(5):32Ｇ36.CHEN J H,CHEN Q,NIU B,et al.Research progress on detection techniques of harmful microorganisms in dairy products[J].China Dairy Industry,2019,47(5):32Ｇ36.[3]韩利慧.乳制品中快速微生物检测技术分析[J].中国标准化, 2018(24):185Ｇ186.HAN L H.Analysis of rapid microbial detection in dairy products [J].China Standardization,2018(24):185Ｇ186.[4]刘婷婷,于靓,孟冬青,等.流式细胞术在液体基质食品检测中的应用研究进展[J].上海师范大学学报,2020,49(6):630Ｇ636.LIU T T,YU J,MENG D Q,et al.Progress on the application of flow cytometry in the detection of liquid matrix foods[J].Journal of Shanghai Normal,2020,49(6):630Ｇ636.[5]夏天爽.流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展[J].食品安全导刊,2019(34):62Ｇ64.XIA T S.Research progress of flow cytometry in the detection of food microorganisms[J].China Food Safety,2019(34):62Ｇ64. 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