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单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。
为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。
本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。
实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。
2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。
3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。
4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。
5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。
生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。
若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。
2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。
若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。
3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。
若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。
结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。
EMA实时荧光PCR技术检测食品中单核增生李斯特活菌方法研究张俊彦;梅玲玲;徐昌平;占利;陈鸿鹄;张云怡;陈建才;张政;杨勇【摘要】目的利用叠氮溴化乙錠(EMA)实时荧光PCR技术,建立直接检测食品中单增李斯特活菌的方法.方法根据单核李斯特菌inlA基因设计特异性引物和探针.用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品前处理条件.用平板计数法验证该方法的检出限及对死菌的抑制率.用35株单增李斯特菌、25株非单核李斯特菌、92株非李斯特菌验证该方法特异性.用添加了不同剂量的单增李斯特死菌、活菌及金黄色葡萄球菌的15件饮料,15件熟肉制品进行模拟实样检测.结果单增李斯特活菌EMA实时荧光PCR方法的Ct=(38.46-3.30)×log(菌量)(R2 =0.999).最低检测的活菌浓度为55 cfu/反应.对死菌DNA抑制效率≥99.98％.35株单增李斯特菌Ct 值最低16.21,最高29.38,而25株非单单增李斯特菌、92株非单增李斯特菌的Ct 值均大于35或无Ct值.重复试验Ct值变异系数小于5％.30件模拟实样单增李斯特菌的检测结果与常规方法完全一致.且EMA实时荧光PCR方法检出时间仅需10h左右,而常规分离培养方法需要5～7 d.结论 EMA实时荧光PCR检测技术是一种快速、简便、特异性强、灵敏度高、仅检测单增李斯特菌活菌的有效方法,可作为食品中检测单增李斯特活菌的方法推广使用.%A new EMA real-time fluorescence PCR method was developed to detect alive Listeria monocytogenes in foods.The specific primers and probe were designed based on the conserved inlA gene.The pretreatment conditions including EMA of different concentrations and irradiating times were optimized.The detection limit and inhibition rate to dead bacteria of this method were confirmed by using direct plating method.The detection specificity wasevaluated by using 35 L.monocytogenes strains,25 non-L.monocytogenes strains and 92 non-Listeria strains.Simulation detection experiments were performed on 15 beverage samples and 15 cooked meat samples supplemented separately with inactivated L.monocytogenes,aliveL.monocytogenes and Staphylococcus aureus.Results showed that the Ct of EMA real-time fluorescence PCR for alive L.monocytogenes wasCt=38.46-3.30 × log (R2=0.999).The detection limit was 55 cfu per reaction.Inhibition rate of DNA of inactivated strains was over 99.98％.The Ct of 35 L.monocytogenes strains were between 16.21 and 29.38,while 25 non-L.monocytogenes strains and 92 non-Listeria strains had Ct ＞35.The variation coefficient of CT was less than 5％ when the experiments were repeated.Results of 30 simulation samples were consistent with that by using standard method.The test time by using newly developed EMA real-time fluorescence PCR was shortened from 3-5 days to about 10 h.The newly developed EMA real-time fluorescence PCR method for aliveL.monocytogenes is rapid,convenient,specific and sensitive and could be applyed in foods inspection.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2017(033)011【总页数】6页(P1007-1012)【关键词】单增李斯特菌;活菌;叠氮溴化乙锭(EMA);实时荧光PCR技术【作者】张俊彦;梅玲玲;徐昌平;占利;陈鸿鹄;张云怡;陈建才;张政;杨勇【作者单位】浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051;浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051;浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051;浙江省疾病预防控制中心,杭州310051;浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051;浙江省疾病预防控制中心,杭州310051;浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051;浙江省疾病预防控制中心,杭州310051;浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051【正文语种】中文【中图分类】R378.99单核细胞增生李斯特菌可引起新生儿、老年人和免疫缺陷病人脑膜炎、败血症，孕妇流产等疾病，死亡率高达20%～30%。
单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立李丹丹;徐义刚;李梦圆;王昱;邱索平;高会江;高慎阳【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)006【摘要】为建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的快速检测方法,本研究以LM iap基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR快速检测LM的方法.结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有LM菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为6.5 CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2％;利用该检测方法对采集的139份样品进行检测,共计检出3份LM阳性样品,与国标法(GB 478930-2010)检测结果一致.该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性.【总页数】5页(P1453-1457)【作者】李丹丹;徐义刚;李梦圆;王昱;邱索平;高会江;高慎阳【作者单位】海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,海口 570311;东北农业大学动物医学学院,哈尔滨 150001;从化出入境检验检疫局,从化 510900;重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心,重庆 404100;从化出入境检验检疫局,从化 510900;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,牛遗传育种研究室,北京 100193;辽宁医学院畜牧兽医学院,锦州 121001【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立 [J], 刘书花;李福伟;李剑;张瑞凌2.单核细胞增生李斯特氏菌依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法的建立 [J], 王建广;杨大伟;雷质文;石琰璟n;付静芸;祝素珍;房保海;姜英辉;刘云国;张健3.单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立 [J], 周红蕾;程淑琴;胡永青;刘静4.食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测方法 [J], 王环宇;李业鹏;杨军;刘秀梅;计融5.单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法建立 [J], 彭国华;涂俊凌;夏文;胡主花因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
食品微生物期末考核题目：单核细胞增生李斯特氏菌检测方法进展姓名：学号：班级：单核细胞增生李斯特氏菌检测方法进展康阳妃西南大学食品科学学院，重庆400715摘要：单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患病的食源性致病菌之一，在自然界中分布广泛。
近年来，在许多国家，它是卫生部门重点监测的几种食源性致病菌之一。
本文介绍了单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性，流行病学特征。
总结了单核细胞增生李斯特氏菌现行有效的的常规和快速的检测方法及流程，并对各方法的优缺点进行了比较。
关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；生物学特征；流行病学特性；检测；致病菌The progress of detection methods to ListeriamonocytogenesKang yangfeiCollege of Food Science ,Southwest University,Chongqing 400715Abstract:Listeria monocytogenes is one of foodborne pathogens that can cause zoonosis,it is found ubiquitously in the environment. In recent years, it is one of several kind of foodborne pathogens that the Health department focus on surveillance to in many countries.This paper introduce the biological and epidemiological characteristics of Listeria monocytogenes. Summarize the current effective conventional and rapid detection methods and processes of Listeria monocytogenes.Key words:Listeria monocytogenes; biological characteristics;epidemiological characteristics ; Detection;pathogens引言单核细胞增生性李斯特菌是一种短小的革兰氏阳性无芽胞杆菌，是一种人畜共患病的致病菌，可使人和动物患李斯特菌病。
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，是一种常见的细菌性食物中毒病原体。
单核细胞增生组织均为生化鉴定的一种常见方法。
以下是李斯特氏菌生化鉴定的一些特征：
1. 嗜冷性：李斯特氏菌生长适宜温度为2-45℃，菌株能够在4℃下生长，并在冷藏食品中繁殖。
2. β-溶血素产生：李斯特氏菌能够产生β-溶血素，可以通过血琼脂（Blood agar）培养基上的溶血环进行观察。
3. 乳酸发酵：李斯特氏菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，能够进行乳酸发酵。
可以使用乳糖发酵基质（Lactose fermentation medium）进行鉴定，如果产生乳酸则为阳性。
4. 半胱氨酸脱羧：李斯特氏菌具有半胱氨酸脱羧酶活性，可以将半胱氨酸转化为硫代氨基酸。
可使用兰氏差异培养基（LDC medium）进行鉴定。
5. 半乳糖酶活性：李斯特氏菌具有半乳糖酶活性，可以将乳糖转化为半乳糖。
可使用半乳糖发酵基质（Rhamnose fermentation medium）进行鉴定。
此外，李斯特氏菌还可以进行PCR扩增目标基因进行鉴定，
如16S rRNA基因、Internal Transcribed Spacer（ITS）区域等。
需要指出的是，单纯进行生化鉴定可能存在一定的误判率，结合其他检测方法可以提高鉴定的准确性。
此外，由于李斯特氏菌在环境中广泛存在，饮食中也常常带菌，所以对于临床病例的确诊还需要结合患者的临床表现、流行病学调查等综合分析。
食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立摘要建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR 快速检测方法。
选取hlyA 基因作为靶序列设计1对引物,在单核细胞增生李斯特氏菌中能扩增出356 bp 的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的单增李斯特菌种特异性。
纯培养的检测极限为46个细菌。
用该方法对36 份食品样品进行检测,检测结果与分离鉴定方法完全相符,表明该方法可适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。
关键词食品;单核细胞增生李斯特氏菌;PCR快速检测方法单核细胞增生李斯特氏菌(Listeie monocytogenes,简称L.M,单增李氏菌),是一种人畜共患病病原菌[1],使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。
该菌可通过眼睛及破损的皮肤、粘膜进入体内而造成感染,孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也会引起感染。
单增李斯特氏菌不易被冻融,能耐受较高的渗透压,在土壤、地表水、污水、植物、青贮饲养中均有该菌存在,所以动物很容易食入该菌,并通过口腔—粪便的途径进行传播。
据报道,健康人粪便中单增李斯特氏菌的携带率0.6%~16.0%,有70%的人可短期带菌,4.0%~8.0%的水产品、5.0%~10.0%的奶及其产品、30.0%以上的肉制品及15.0%以上的家禽均被该菌污染。
人主要通过食入软奶酷、未充分加热的鸡肉、鲜牛奶、冻猪舌等而感染,约占85%~90%的病例是由被污染的食品引起的。
近年来,国外报道该菌所致的食物中毒越来越多,病死率高达30%～70%[2-3]。
国内也不断有散发病例,引起了国内医学界的普遍关注。
WHO在20世纪90年代已将其列为食品四大致病菌之一[4-5]。
该菌在自然界分布广泛,以家畜、家禽兽为主要宿主,易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发[6-7]。
食品是导致人类受单核细胞增生李斯特氏菌感染的主要传播途径,由于该菌在4 ℃冰箱保存的食物中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法摘要：通过扩增hly 基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR 方法。
该方法具有较强的特异性，35株经传统方法鉴定的菌株PCR 结果均为阳性，而其他三种同属异种菌，包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段。
PCR 方法对Lm 纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl，对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g，牛奶为4CFU/ml。
应用该方法对285 份食品样品检测，17 份样品Lm 呈阳性，结果与常规的分离培养方法完全一致。
该种方法具有敏感、特异、快速及准的优点，可用于食品中L m 的快速检测。
关键词：食品；单核细胞增生性李斯特氏菌；聚合酶链式反应Abstract ：A polymerase chain reaction (PCR) assay targeting the hly gene was developed to detect Listeria monocytogenes.The PCR product was detected in 35 L monocytogenes strains and not in other Listeria spp, including innocua, ivanovii andwelshimer and also not in non-Listeria species, indicating that this method was highly specific for L. monocytogenes. The detectionlimit of the PCR assay was 7.3 CFU/μl o f pure cell culture. The PCR assay could detect4 CFU of L. monocytogenes in thecontaminated pork and vegetable (1g) and milk (1ml). From 285 samples, 17 samples were proved positivefor L. monocytogenesby the PCR method, and the results were quite consisted with those detected by conventional biochemical testing. The PCRassay is highly sensitive, specific, rapid and accurate and can be used for rapid detection of L. monocytogenes in food.Key words：food；Listeria monocytogenes；PCR；detection1引言1.1李斯特氏菌-概况李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。
《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特菌，是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患致病菌，主要存在于肉类、乳制品和蔬菜中，可引起脑膜炎、败血症和流产，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。
自1961年，英国首次报道2例由单增李斯特菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿单增李斯特菌感染事件。
1985年美国有52人死于食用受单增李斯特菌感染的软干酪。
2011年美国18个州72人因食用受李斯特菌污染的甜瓜而染病。
在我国感染性腹泻致病菌中李斯特菌居首位。
因此，建立快速、特异、灵敏的检测标准对于单增李斯特菌早期预防及疫情的有效控制至关重要。
我国目前主要采用传统培养方法进行单增李斯特菌的检测，需要一周时间左右，费时费力。
本次研究以单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列为靶基因设计一对引物，采用EMA与PCR相结合的方法进行检测，能够有效地区分单增李斯特菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。
本次研究结果显示， PCR检测单增李斯特菌的灵敏度在1.0×102cfu/mL左右，从预增菌、样品处理、PCR扩增、凝胶电泳只需要2 d左右，与传统培养学方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中单增李斯特菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。
二、任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2017〕104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210481）的起草、制定工作。
2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。
3、编制依据主要依据以下标准：NY/T 1902 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验，GB 4789.30 食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB 19489 实验室生物安全通用要求，GB 4789.28 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。
三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：单核细胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCR检测方法的建立1.引物设计根据单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌Hly 基因序列设计一对特异性引物。
根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增271 bp大小的特异性引物对。
表1 引物序列2. EMA-PCR方法参数的优化首先是探索单核细胞增生李斯特氏菌培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入EMA，制备成EMA终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。
然后通过离心收集上清液，进行PCR扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳EMA添加终浓度。
其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、8、10min，离心收集上清液，进行PCR扩增。
3.确定方法的灵敏度和特异性。
4. 用建立的单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料样品，并与NY/T 1902-2010 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验比对，以验证该方法的实用性和准确性。
第二阶段：单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR检测方法应用实验本阶段主要进行单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR检测方法在河南省范围内的应用实验。
为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。
共对来自全国4个省（大部分样品来自河南省）共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出1批单核细胞增生李斯特氏菌阳性样品，并对单核细胞增生李斯特氏菌进行了分离鉴定。
同时与 NY/T 1902-2010《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验》进行了对比，检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法NY/T 1902-2010检测结果完全一致，但检测时间比传统培养法缩短了2-3天的时间。
通过对比发现，EMA-PCR方法具有准确、快速的特点，在应用推广方面具有一定的优势。
第三阶段：标准的起草、修改与制定根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分析的基础上，组织有关专家起草了《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测 EMA-PCR法》河南省地方标准草案，规定了适用范围、样品处理方法、实验操作方法、结果判定等，并将标准草案送微生物有关方面专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测 EMA-PCR法（草案）》。
项目主持人：吴志明，河南省兽药饲料监察所，主持本项地方标准的制定与编写。
主要起草人：高延玲：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和技术推广。
方忠意：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和检测方法的优化。
董鹏：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。
李金磊：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。
狄元冉：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和优化。
四、主要内容的确定1. 检测方法基本原理EMA能够穿过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其基因组DNA发生不可逆转的结合，使死细菌和游离状态的DNA不能作为模板进行PCR扩增。
根据单核细胞增生李斯特氏菌溶血素蛋白的基因Hly序列设计一对特异性引物，通过对样品进行EMA处理然后进行PCR扩增及凝胶电泳分析，含单增李斯特菌活菌的样品会在271 bp处出现一条目的条带，而含有单增李斯特菌死菌DNA 及非单增李斯特菌的样品不会出现该条带。
2. 最佳致死方法、EMA浓度及曝光时间向煮沸致死、紫外处理和异丙醇处理后的0.5 麦氏单位（MCF）单增李斯特菌菌悬液中分别加入EMA，使其终浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、4、8 μg/mL，PCR结果电泳图分别为图1，图2，图3。
由图可以看出煮沸法致死效果最理想，加入EMA终浓度为0.5 μg/mL既能完全抑制0.5 MCF单增李斯特菌死菌的扩增。
另向0.5 MCF活菌菌悬液加入EMA，使其终浓度分别为0、1、2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mL，PCR电泳结果如图4。
由图4可以看出加入终浓度为4 μg/mL的EMA样品PCR电泳条仍无明显减弱，表明终浓度低于4 μg/mL的EMA不会抑制单增李斯特菌活菌的扩增。
图1 煮沸处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 μg/mL EMA； 3：0.2 μg/mL EMA；4：0.5 μg/mL EMA； 5：1 μg/mL EMA；6：2 μg/mL EMA； 7：4 μg/mL EMA； 8：4 μg/mLEMA图2 紫外照射处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 μg/mL EMA；3：0.2 μg/mL EMA；4：0.5 μg/mL EMA； 5：1 μg/mL EMA； 6：2 μg/mL EMA； 7：4 μg/mL EMA； 8：4 μg/mL EMA图3 异丙醇处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 μg/mL EMA；3：0.2 μg/mL EMA；4：0.5 μg/mL EMA； 5：1 μg/mL EMA； 6：2 μg/mL EMA； 7：4 μg/mL EMA； 8：4 μg/mL EMA图4 EMA抑制单核细胞增生李斯特氏菌活菌浓度注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 μg/mL EMA; 3：1 μg/mL EMA； 4：2 μg/mL EMA； 5：4 μg/mL EMA；6：8 μg/mL EMA； 7：10 μg/mL EMA； 8：12 μg/mL EMA；9：14 μg/mL EMA；10：16 μg/mL EMA将煮沸致死的0.5 MCF单增李斯特菌菌悬液，加入EMA终浓度为0.5 μg/mL，黑暗环境下孵育5 min后，分别曝光0、1、2、4、6、8、10 min，处理后PCR产物电泳结果如图5所示。
由图5可以看出只有不曝光的有条带，其他均无条带，说明EMA处理后，曝光1 min，即可使EMA与死菌充分交联。
图5曝光时间注：M：Marker；1：0 min； 2：1 min； 3：2 min；4：4 min； 5：6 min； 6：8 min；7：10 min；8：阴性对照3. PCR方法的灵敏度用灭菌棉签蘸取新鲜培养的营养琼脂固体平板上的单增李斯特菌菌落转接于5 mL灭菌去离子水中，用比浊仪调至0.5 MCF，系列稀释至10-1-10-8，以此为模板，按上述方法进行EMA-PCR试验，同时对检出的最低稀释度进行涂板计数，每个稀释度做3个重复，37 ℃培养24 h，检测PCR反应灵敏度。
结果表明，建立的PCR方法检测最底线是1.3×102 cfu/mL（图6）。
图6 PCR灵敏度检测注：M：Marker；1：阴性对照； 2：108 CFU； 3：107 CFU；4：106 CFU； 5：105 CFU；6：104 CFU； 7：103 CFU； 8：102 CFU；9：10 CFU；10：1 CFU4.PCR方法的特异性将单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株及其余待测菌株单菌落分别接种于LB肉汤中过夜培养，取菌液作为PCR反应模板，按上述方法进行试验。
结果如图7，由图可以看出以单增李斯特菌菌株为模板的PCR产物出现有1条特异性的271 bp 条带，与预测序列片段大小相符；阴性对照、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌等10株非李斯特氏菌及格氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌等5株非单增李斯特菌菌株未出现任何扩增条带；同时也未发现有其他非特异性扩增条带，表明建立的PCR方法具有很高的特异性。
图7 PCR特异性注：M：Marker；1：单核细胞增生李斯特氏菌；2：阴性对照；3：斯氏李斯特氏菌；4：伊氏李斯特氏菌； 5：威氏李斯特氏菌；6：格氏李斯特氏菌；7：英诺克李斯特氏菌；8：福氏志贺氏菌；9：宋内氏志贺氏菌；10：鲍氏志贺氏菌； 11：金黄色葡萄球菌；12：大肠杆菌；13：肠产毒性大肠杆菌；14：肠致病性大肠杆菌；15：鼠伤寒沙门氏菌：16：肠炎沙门氏菌17：甲型副伤寒沙门氏菌5．结果报告凡被检样品的PCR扩增产物电泳结果在271 bp处出现一条目的条带（见图8），即可报告该样品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。
