第45讲 生物技术在其他方面的应用[考纲要求] 1.植物的组织培养。
2.PCR 技术的基本操作和应用。
3.蛋白质的提取和分离。
4.从生物材料中提取某些特定的成分。
5.实验：DNA 的粗提取与鉴定。
考点一 植物组织培养1． 植物组织培养的过程外植体――→脱分化愈伤组织――→再分化幼苗―→移栽植物组织培养常用的培养基是MS 培养基，一般需要添加生长素和细胞分裂素两种植物激素。
2． 植物组织培养的实验操作 (1)菊花的组织培养过程制备MS 培养基(配制母液、配制培养基、灭菌)→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培。
(2)月季的花药培养过程①过程：材料的选取→材料的消毒→接种和培养→鉴定和筛选。
②影响花药培养的因素主要有材料的选择和培养基的组成。
③要挑选完全未开放的花蕾，确定花粉发育时期最常用的方法是醋酸洋红法。
3． 影响植物组织培养的因素(1)菊花的组织培养，一般选择开花植株的茎上部新萌生的侧枝 ( × ) (2)植物激素的浓度可影响细胞分化，但使用的先后顺序及比例不影响组织培养的过程 ( × )(3)pH 、温度和光照等也影响植物组织培养 ( √ ) 易错警示 实验操作中易错的几个问题(1)材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝；月季的花药培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。
(2)外植体消毒：所用消毒剂为体积分数为70%的酒精和质量分数为0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。
(3)培养过程：在初期，菊花的组织培养需光照，月季的花药培养不需光照；而在后期均需光照。
1． 植物的花药培养在育种上有特殊的意义。
植物组织培养可用于无病毒植株及细胞产物的工厂化生产等方面。
请回答相关问题：(1)利用月季的花药离体培养产生单倍体时，选材非常重要。
一般来说，在____________期花药培养的成功率最高。
为了选择该期的花药，通常选择____________的花蕾。
确定花粉发育时期最常用的方法有____________法，但是对于花粉细胞核不易着色的植物，需采用____________法，该法能将花粉细胞核染成____________色。
(2)若要进行兰花无病毒植株的培育，首先选择兰花的____________作为外植体。
从外植体到无病毒植株试管苗，要人为控制细胞的____________和____________过程。
(3)进行组织培养需配制MS培养基，在该培养基中常需要添加____________、____________等植物激素。
欲有利于根的分化，植物激素的用量比例应为________________________________________________________________________。
(4)不同植物的组织培养除需营养和激素外，____________________________等外界条件也很重要。
(5)无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，下列各项中使用化学药剂进行消毒的是____________，采用灼烧方法进行灭菌的是____________。
(填序号)①培养皿②培养基③实验操作的双手④三角锥形瓶⑤接种环⑥花蕾答案(1)单核靠边完全未开放醋酸洋红焙花青—铬矾蓝黑(2)茎尖分生组织脱分化(或去分化) 再分化(3)生长素细胞分裂素(两空顺序可以颠倒) 生长素多于细胞分裂素(4)pH、温度和光照(5)③⑥⑤解析(1)早期的花药比后期的更容易培养成功。
一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。
该时期的花药通常存在于完全未开放的花蕾中。
(2)根尖、茎尖约0～0.1 mm区域中几乎不含病毒。
病毒通过维管系统移动，而分生组织中不存在维管系统，且茎尖分生组织中，代谢活力高，竞争中病毒复制处于劣势。
(3)生长素与细胞分裂素等植物激素可调节脱分化和再分化。
当生长素含量多于细胞分裂素含量时，利于生根。
(4)植物培养时，除需要营养、激素外，还需要适宜的温度、pH和光照等。
(5)对实验器具进行灭菌处理，对实验过程中的具有生物活性的材料或用具进行消毒处理。
1．植物组织培养技术和花药离体培养技术的异同2．(1)生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点：①在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。
②使用顺序不同，结果不同，具体如下：生长素用量细胞分裂素用量⎩⎪⎨⎪⎧高：利于根的分化、抑制芽的形成低：利于芽的分化、抑制根的形成适中：促进愈伤组织的生长3． 影响植物组织培养的因素(1)材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。
一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。
嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。
(2)营养：常用的培养基是MS 培养基，其中含有的大量元素是N 、P 、S 、K 、Ca 、Mg ，微量元素是Fe 、Mn 、B 、Zn 、Cu 、Mo 、I 、Co ，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。
(3)环境条件：pH 、温度、光照等条件。
如菊花的组织培养所需pH 为5.8左右，温度为18～22 ℃，光照条件为每日用日光灯照射12 h 。
考点二 DNA 的粗提取与鉴定1． 基本原理2． 操作过程材料的选取：选用DNA 含量相对较高的生物组织――→破碎细胞以鸡血为例：鸡血细胞，加蒸馏水，用玻璃棒搅 拌，用纱布过滤，收集滤液 去除杂质：利用DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度的 不同，通过控制NaCl 溶液的浓度去除杂质――→DNA 析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液DNA 的鉴定：在溶有DNA 的溶液中加入二苯胺试剂，沸水 中加热5 min ，溶液变成蓝色易错警示 (1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。
可选用鸡血细胞作材料。
(2)实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA ，第二次的目的是稀释NaCl 溶液，使DNA 从溶液中析出。
2． 下图表示以鸡血为实验材料进行DNA 的粗提取与鉴定的操作程序，请分析回答下列问题：(1)步骤一中，向鸡血细胞液中加入____________并搅拌，可使鸡血细胞破裂。
(2)步骤二中，过滤后收集含有DNA的____________。
(3)步骤三、四的操作原理是________________________________________________________________________________________________________________________；步骤四中，通过向溶液中加入____________调节NaCl溶液的物质的量浓度至____________mol/L时，DNA将会析出，过滤去除溶液中的杂质。
(4)步骤七：向步骤六过滤后的____________中加入等体积的冷却的____________，静置2～3 min，溶液中会出现________色丝状物，这就是粗提取的DNA。
(5)步骤七：DNA遇____________试剂，沸水浴5 min，冷却后，溶液呈______色。
答案(1)蒸馏水(2)滤液(3)DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质蒸馏水0.14 (4)滤液酒精白(5)二苯胺蓝解析破碎红细胞应用蒸馏水，使之吸水涨破。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中DNA溶解，在0.14 mol/L的NaCl溶液中DNA析出。
可通过加入蒸馏水将2 mol/L的NaCl溶液稀释为0.14 mol/L的NaCl溶液。
DNA不溶于冷酒精，遇二苯胺加热呈蓝色。
1．(1)不同生物的组织中DNA含量不同在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
(2)材料不同所采用的提取方法不同①植物组织：取材→研磨→过滤→沉淀。
②鸡血：制备鸡血细胞液→提取核DNA→溶解细胞核内DNA→析出并滤取DNA→DNA再溶解→提取较纯净的DNA。
考点三PCR技术的基本操作和应用1． PCR原理DNA热变性原理，即：2． PCR反应过程(1)变性：当温度上升到90_℃以上时，双链DNA解聚为单链。
(2)复性：温度下降到55_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
(3)延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
易错警示(1)DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100 ℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50 ℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶和两种引物。
反应场所：PCR仪。
(2)PCR技术中的引物：①含义：引物是一小段单链DNA或RNA分子。
②作用：为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。
③种类：扩增一个DNA分子需要2种引物。
④数目：引物数目等于新合成的DNA子链数目。
⑤与DNA母链的关系：两种引物分别与DNA 母链的3′端通过碱基互补配对结合。
3．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题：(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将________________的末端称为5′端，当引物与DNA 母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的____________开始延伸DNA链。
(2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。
到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到__________________________________，它的发现和应用解决了上述问题。
要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫______________。
(3)PCR的每次循环可以分为______________________三步。
假设在PCR反应中，只有一个DNA 片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有________个这样的DNA片段。
(4)请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。
(5)简述PCR技术的主要应用。
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