乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测.doc

2023乙型肝炎病毒标志物临床应用专家共识(最全版)临床实践中，乙型肝炎病毒标志物主要用于诊断感染、监测疾病进展、评估慢性乙型肝炎治疗应答，以及在临床试验中评估新型抗病毒药物的疗效。

结合近年来慢性乙型肝炎抗病毒治疗的研究进展和临床诊治实际需求，中华医学会肝病学分会基础医学与实验诊断协作组制订此专家共识，对经典及新型乙型肝炎病毒实验室检测相关标志物的临床应用进行证据总结和要点推荐，旨在指导其规范、合理的临床应用。

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染是我国肝硬化和肝细胞癌(hepatoce11u1arcarcinoma,HCC)的主要病因，科学、规范应用HBV标志物是提升其诊治水平的基石。

经典的病毒标志物包括血清学标志物如乙型肝炎表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)及其抗体(抗-HBs)、乙型月干炎e抗原(hepatitisBeantigen,HBeAg)及其抗体(抗-HBe)和乙型肝炎核心抗体(抗-HBC),以及分子生物学标志物如HBVDNA,基因型及其突变检测等。

近年临床对血清学标志物定量检测和HBVDNA高敏检测的需求不断增加，同时，有关HBV全新标志物如前基因组RNA(pregenomicRNA,pgRNA)和乙型肝炎核心相关抗原(hepatitisBcore-re1atedantigen,HBcrAg)应用的报道也陆续出现。

HBV标志物主要用于临床实践中诊断HBV感染、监测疾病进展、评估治疗应答，以及在临床试验中评估新型抗病毒药物的疗效。

本共识在新发布的《慢性乙型肝炎防治指南（2023年版）》⑴基础上，对经典及新型HBV实验室检测相关标志物的临床应用进行证据总结和要点推荐，旨在指导其规范、合理的临床应用。

循证医学证据的检索与评价和推荐意见的形成：首先，根据共识相关临床问题进行数据检索，数据库包括PubMed,中国知网和万方数据库，文献种类包括系统评价/meta分析、随机对照试验（randomizedcontro11edtria1,RCT）、观察性研究及病例系列研究等，检索时限均从建库至2023年3月1日。

乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程（PCR和DNA反向点杂交）1. 目的：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规章，保证检测结果的准确性。

2. 应用范围：对HBV的基因型和耐药突变基因检测。

3. 职责3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献4.1 亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒剂说明书。

4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。

5. 内容5.1 检测方法：PCR和DNA反向点杂交5.2 实验原理：设计特异的PCR引物扩增获得HBV目的基因片段，该片段包含了所要检测的基因型和耐药基因突变位点。

通过PCR产物与设计的探针进行特异性杂交，根据膜条特定位置显色（蓝色）与否来判断HBV的基因型和耐药突变类型。

5.3 性能参数3 copies /ml 。

5.3.1 灵敏度：检测下限为 1.0 ×105.3.2 稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。

5.4.1 标本类型：血清或血浆。

5.4.2 标本保存：制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，2～8℃保存不超过48h，-18 ℃以下保存不超过半年，应避免反复冻融。

5.4.3 运送条件：冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时不宜超过48h。

5.5 设备和试剂5.5.1 设备：DA 7600 荧光定量PCR仪、低速离心机、生物安全柜、高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/ 干式恒温器、冰箱（4℃、-20 ℃）、移动/ 固定紫外灯、三孔电热恒温水浴箱、振荡恒温水浴箱。

5.5.2 试剂：5.5.2.1 试剂品牌亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒。

5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3401179号。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）正嗜肝DNA 病毒属（Orhtohepadnavirus），是乙型肝炎的病原体。

HBV感染是全球性公共卫生问题，估计全世界HBV携带者高达3.5亿。

我国人群HBV携带率约为10%，HBV携带者超过1.2亿。

（一）生物学性状1.形态与结构电镜下HBV感染患者血清中可见三种形态的病毒颗粒，即大球型颗粒，小球型颗粒和管形颗粒。

（1）大球型颗粒：又称为Dane颗粒，是有感染性的完整的HBV，直径42mm，电镜下呈双层结构的球型颗粒。

外层相当于病毒的包膜，由脂质双层和病毒基因编码的包膜蛋白组成，包膜蛋白包括HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）,前S1抗原（Pre S1）和前S2抗原（Pre S2）。

内层为病毒的核心，相当于病毒的核衣壳，呈20面体立体对称，核心表面的衣壳蛋白为HBV核心抗原（hepatitis B core antigen ,HBcAg）。

病毒核心内部含病毒的双链DNA分子、DNA多聚酶等。

（2）小球型颗粒：直径为22nm，为一种中空颗粒，成分为HBsAg,是HBV 在肝细胞内复制时产生过剩的HBsAg装配而成，不含病毒的DNA及多聚酶，无感染性。

这种小球型颗粒大量存在于血液中。

（3）管形颗粒：由小球型颗粒聚合而成，颗粒长100~500nm，直径22nm，成分与小球型颗粒相同，具有与HBsAg相同的抗原性。

2.基因结构与编码蛋白HBVDNA分子为不完全双链环状DNA，两链长短不一。

长链是负链，约有3200个核苷酸，短链为正链，是长链长度的50%~100%。

HBVDNA负链含4个开放阅读框（ORF），分别称为S,C,P,X区。

其中S区有3个启动子，分别编码主蛋白（含HBsAg）、中蛋白（含PreS2Ag和HBsAg）和大蛋白（含PreS1Ag、PreS2Ag、HBsAg）。

2019版：慢性乙型肝炎防治指南(全文版)中华医学会感染病学分会和肝病学分会于2005年组织国内有关专家制订了《慢性乙型肝炎防治指南》(第1版)，并分别于2010年和2015年进行了更新。

近4年来，国内外有关慢性HBV感染的基础和临床研究都取得了重要进展，为更好地规范慢性乙型肝炎(CHB)的预防、诊断和治疗，助力实现世界卫生组织(WHO)提出的"2030年消除病毒性肝炎作为重大公共卫生威胁"的目标，再次更新本指南。

本指南旨在帮助临床医师在CHB预防、诊断和治疗中做出合理决策，但并非强制性标准，也不可能包括或解决CHB诊治中的所有问题。

因此，临床医师在面对某一患者时，应在充分了解有关本病的最佳临床证据、认真考虑患者病情及其意愿的基础上，根据自己的专业知识、临床经验和可利用的医疗资源，制定全面合理的诊疗方案。

基于相关研究进展和知识更新，现对本指南进行更新和完善。

本指南中的证据等级分为A、B和C三个级别，推荐等级分为1和2两个级别，见表1(根据GRADE分级修订)。

表1推荐意见的证据等级和推荐等级1 术语•慢性HBV感染：HBsAg和(或)HBV DNA阳性6个月以上。

•CHB：由HBV持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。

•HBV再激活(HBV reactivation)：HBsAg阳性/抗-HBc阳性，或HBsAg阴性/抗-HBc阳性患者接受免疫抑制治疗或化学治疗时，HBV DNA较基线升高≥2 lgIU/mL，或基线HBV DNA阴性者转为阳性，或HBsAg由阴性转为阳性。

•HBeAg阴转(HBeAg clearance)：既往HBeAg阳性的患者HBeAg 消失。

•HBeAg血清学转换(HBeAg seroconversion)：既往HBeAg阳性的患者HBeAg消失，抗-HBe出现。

•乙型肝炎康复(Resolved hepatitis B)：曾有急性或CHB病史，现为HBsAg持续阴性、抗-HBs阳性或阴性、抗-HBc阳性、HBV DNA低于最低检测下限、丙氨酸转氨酶(ALT)在正常范围。

乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析姜清明【摘要】目的检测该院2013年-2015年乙型肝炎患者基因分布及病毒耐药基因突变情况及相关性和临床意义.方法采用荧光定量和基因芯片技术检测240例乙型肝炎患者乙肝病毒(HBV)基因型和对拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定药物突变基因型.结果 240例乙型肝炎患者中,HBV基因型包括:B型61.3％(147/240)、C型25.0％(60/240)、B和C混合型5.4％ (13/240)、其他型8.3％(20/240),未检出D型.182例未出现耐药,拉米夫定耐药突变44例,阿德福韦出现耐药突变者7例,恩替卡韦出现耐药突变者6例,替比夫定出现耐药突变者为1例.M204V以及M204I是两种常见的拉米夫定耐药突变情况,在阿德福韦耐药突变中以N236T±A181位碱基替换相对常见;T184位碱基替换是恩替卡韦耐药突变的典型代表;M204I是替比夫定耐药突变的主要表现.部分从来没有采用核苷酸等药物治疗者也有可能被检测出耐药突变情况.44例出现拉米夫定耐药的基因型中,180M 及其混合突变型占86.4％(38/44),C型HBV基因突变占61.4％(27/44),且主要为180M耐药突变型(24/27).结论检测乙型肝炎病毒耐药突变基因,可以帮助医学工作者确定患者是否存在耐药性,从而选择恰当的抗病毒方法对其进行治疗.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2017(025)002【总页数】3页(P84-86)【关键词】肝炎病毒;乙型;耐药;突变基因【作者】姜清明【作者单位】广东省粤北第二人民医院检验科,广东韶关512231【正文语种】中文【中图分类】R512.62乙型肝炎简称乙肝，作为全球性关注的公共卫生问题，严重威胁到人类健康，据报道，慢性乙型肝炎病毒携带者全球多达3.6亿人，在中国，乙肝病毒携带者占三分之一。

乙型肝炎可成为肝硬化、肝癌和肝衰竭的诱因，严重者甚至可引发死亡。