慢病毒载体的构建方法共24页

慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。

慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。

慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。

慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。

在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。

2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。

通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。

3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。

4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。

通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。

总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。

这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。

方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。

寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。

连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。

构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。

通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。

结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。

与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。

结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。

国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。

沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。

本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。

1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。

现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。

此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。

瞬时转染制备慢病毒：细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。

但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。

多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。

转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。

DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。

质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。

不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。

转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。

其它方法有脂质体法和PEI法。

转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。

如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012 IU/ml的慢病毒载体。

之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-80℃储存。

储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。

病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107 IU/ml，浓缩之后可以达到109 -107 IU/ml 。

含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa试剂盒。

一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24 gag。

然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24 gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。

一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。

通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。

用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。

三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。

回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。

该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。

慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。

下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。

2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。

3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。

4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。

5.限制性内切酶：用于DNA切割。

6.DNA连接酶：用于DNA连接。

7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。

8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

9.细胞培养基：用于细胞培养。

10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。

11.抗生素：用于防止细胞污染。

12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。

二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。

2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。

3.水浴锅：用于保温反应液。

4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。

5.细胞培养箱：用于细胞培养。

6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。

7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。

8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。

9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。

三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。

2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。

3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。

6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。

8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。

慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够长期潜伏在宿主细胞内，并且在细胞分裂时能够传递给子细胞的病毒。

慢病毒的研究和应用在基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域具有重要意义。

慢病毒载体构建是慢病毒研究的关键环节，下面将介绍慢病毒载体构建的原理。

首先，慢病毒载体构建的关键是选择合适的病毒骨架。

常用的慢病毒载体包括HIV-1、HIV-2和SIV等。

这些病毒骨架具有较高的转导效率和稳定性，能够有效地将外源基因导入宿主细胞中。

在选择病毒骨架时，需要考虑到载体的稳定性、毒性和转导效率等因素，以确保慢病毒载体能够在宿主细胞中稳定表达外源基因。

其次，慢病毒载体构建需要将外源基因整合到病毒基因组中。

一般来说，外源基因会被整合到病毒的长末端重复序列（LTR）之间，这样可以确保外源基因能够稳定地表达。

在整合外源基因时，需要使用逆转录酶将外源基因的RNA转录成DNA，并将其整合到病毒基因组中。

整合外源基因的位置和数量会影响慢病毒载体的稳定性和表达水平，因此需要对整合位点和整合数量进行精确控制。

另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的包装限制。

在病毒的生命周期中，病毒颗粒的组装和包装需要依赖于病毒的包装信号。

因此，在构建慢病毒载体时，需要确保外源基因的整合不会影响到病毒的包装信号，否则会影响病毒的组装和包装，从而降低病毒的转导效率和稳定性。

最后，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。

在构建慢病毒载体时，需要对病毒的毒性进行改造，以降低其对宿主细胞的损害。

同时，还需要对病毒的复制和传播进行限制，以确保慢病毒载体在宿主细胞中稳定表达外源基因，同时不会对宿主细胞造成不良影响。

综上所述，慢病毒载体构建是慢病毒研究和应用的重要环节。

通过选择合适的病毒骨架、整合外源基因、考虑病毒的包装限制和确保病毒的安全性和稳定性，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域的研究和应用提供重要支持。

慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。

慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。

本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。

首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。

慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。

因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。

其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。

常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。

而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。

另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。

为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。

此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。

总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。

通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011175991.9(22)申请日 2020.10.28(71)申请人 和元生物技术（上海）股份有限公司地址 201321 上海市浦东新区中国(上海)自由贸易区张江路1238弄1号6层B、C、D、E座(72)发明人 杨兴林　潘讴东　贾国栋　杨佳丽　杨蕊菊　夏清梅　(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人 陆惠中　田欢(51)Int.Cl.C12N 15/867(2006.01)C12N 5/10(2006.01)C12N 7/01(2006.01)(54)发明名称一种慢病毒载体、构建方法及其应用(57)摘要本发明属于生物领域，尤其涉及一种慢病毒载体、构建方法及其应用。

本发明公开了一种慢病毒载体的制备方法，包括：以基于LTR1.27‑GEW质粒为骨架，在5’端添加R和U5区，同时删除3’端的PBS序列，并且将其中的5’CMV启动子更换为猕猴免疫缺陷病毒的U3启动子，得到慢病毒载体Obio ‑02。

本发明制备得到的新型的第四代慢病毒载体在保障安全性的前提下，还能够具有高产量的病毒滴度，可应用于基因治疗等领域。

权利要求书1页 说明书7页序列表25页 附图11页CN 112011574 A 2020.12.01C N 112011574A1.一种慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括：以基于LTR1.27-GEW质粒为骨架，在5’端添加R和U5区，同时删除3’端的PBS序列，并且将其中的5’CMV启动子更换为猕猴免疫缺陷病毒的U3启动子，得到慢病毒载体Obio -02。

2.根据权利要求1所述的方法得到的慢病毒载体。

3.一种细胞，其特征在于，所述细胞通过权利要求2所述的慢病毒载体感染得到。

4.一种制备病毒产品的方法，其特征在于，将细胞与有效量的权利要求2所述的慢病毒载体接触，以产生病毒产品。

慢病毒载体包装构建过程原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。

对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。

携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。

慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。

包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。

将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。