pLVX-TetOne-Puro慢病毒载体使用说明

LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus.lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page.lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page.Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro.Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319).Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: /gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material.Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014).Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005Target Guide Sequence Cloning ProtocolIn order to clone the target sequence into the lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro backbone, synthesize two oligos of the following form. All plasmids have the same overhangs after BsmBI digestion and the same oligos can be used for cloning into lentiCRISPRv2, lentiGuide-Puro or lentiCRISPRv1.Example oligo design : Note that the NGG PAM is not included in the designed oligos. Oligonucleotide ordering tips : Standard de-salted oligos (usually the most inexpensive synthesis) are sufficient forcloning. If not already resuspended, dilute each oligo to 100 µM in sterile water or TE.* * * * *Lentiviral vector digestion, oligo annealing and cloning into digested vector:1. Digest and dephosphorylate 5ug of the lentiviral CRISPR plasmid with BsmB I for 30 min at 37C: 5 ug lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro 3 ul FastDigest BsmB I (Fermentas) 3 ul FastAP (Fermentas) 6 ul 10X FastDigest Buffer 0.6 ul 100 mM DTT (freshly prepared) X ul ddH 2O 60 ul total2. Gel purify digested plasmid using QIAquick Gel Extraction Kit and elute in EB. If BsmBI digested, a ~2kb filler piece should be present on the gel. Only gel purify the larger band . Leave the 2kb band.3. Phosphorylate and anneal each pair of oligos: 1 ul Oligo 1 (100 µM) 1 ul Oligo 2 (100 µM) 1 ul 10X T4 Ligation Buffer (NEB) 6.5 ul ddH 2O 0.5 ul T4 PNK (NEB M0201S) 10 ul total Please use the T4 Ligation Buffer since the buffer supplied with the T4 PNK enzyme does not include ATP (or supplement to 1mM ATP).Put the phosphorylation/annealing reaction in a thermocycler using the following parameters: 37o C 30 min 95o C 5 min and then ramp down to 25o C at 5o C/min4. Dilute annealed oligos from Step 3 at a 1:200 dilution into sterile water or EB.5. Set up ligation reaction and incubate at room temperature for 10 min:X ul BsmB I digested plasmidfrom Step 2 (50ng)1 ul diluted oligo duplex from Step 4 5 ul 2X Quick Ligase Buffer (NEB) X ul ddH 2O 10 ul subtotal1 ul Quick Ligase (NEB M2200S) 11 ul total Also perform a negative control ligation (vector-only with water in place of oligos) and transformation.6.Transformation into Stbl3 bacteria . Lentiviral transfer plasmids contain Long-Terminal Repeats (LTRs) and must be transformed into recombination-deficient bacteria. We use homemade Stbl3 (propagated from Invitrogen C7373-03) and get excellent plasmid yields. Although other RecA- strains may work, we have found the most consistent transformations and yields using Stbl3.。

慢病毒包装体系使用说明本说明书适用于以下产品：名称货号慢病毒包装体系KLV3501慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504北京英茂盛业生物科技有限公司Web site：1北京英茂盛业生物科技有限公司/产品内容KLV3501KLV3502KLV3503KLV3504慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3333辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂33载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。

HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。

请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。

慢病毒载体慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。

外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。

pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。

其它载体信息见本公司网站 或本说明书后面的附表。

慢病毒包装载体慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。

载体图谱见下：HEK293V细胞包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。

我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。

在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。

Polyfect‐V转染试剂Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。

3北京英茂盛业生物科技有限公司/慢病毒包装概述：病毒包装前需制备转染级慢病毒载体及两种包装载体。

慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。

与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。

本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。

一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。

慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。

另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。

二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。

构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。

基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。

包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。

包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。

将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。

经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。

三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。

1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。

通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。

2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。

外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。

慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。

3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。

通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。

此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。

慢使用操作指南操作指南：慢使用1、简介1.1 背景介绍1.2 慢的定义1.3 慢的应用领域2、仪器与材料2.1 实验室安全设备2.2 实验室试剂和材料2.3 慢载体和质粒3、慢的生产3.1 慢生产细胞系的选择3.2 质粒构建与筛选3.3 慢包装细胞的构建与筛选3.4 慢的生产与扩增4、慢的感染4.1 细胞培养与准备4.2 慢感染的条件优化4.3 慢感染的时间和浓度控制5、慢的转染5.1 细胞转染前的处理5.2 转染的操作条件5.3 考虑的转染效率和细胞毒性问题6、实验细胞系的维护6.1 细胞的培养和传代6.2 细胞的冻存与恢复6.3 实验细胞系的检测和验证7、实验数据记录与分析7.1 实验数据的记录和整理7.2 数据分析方法与软件使用7.3 结果的展示和解释8、安全注意事项8.1 实验操作安全措施8.2 废液处理及废弃物管理8.3 慢实验室传播的预防措施9、附件9.1 相关实验记录表格9.2 质粒和慢载体序列信息法律名词及注释：1、载体：在基因工程中，指用来携带或传递目标基因的DNA或RNA分子。

2、质粒：指自主复制的独立DNA分子，可被插入或移除目标基因，用于基因克隆、表达和操控等实验。

3、细胞培养：通过体外培养细胞的技术，提供实验所需的可控环境和条件。

4、转染：将外源DNA或RNA导入细胞内，使其表达或转录的过程。

5、传代：将细胞从一个培养器转移到另一个培养器，以维持细胞系的生长。

6、冻存：将细胞以特定的方法冷冻保存，以备将来使用。

7、废液处理：对实验过程中产生的含有有害或感染性物质的废液进行妥善处理，避免对环境和人体造成危害。

8、废弃物管理：对实验中产生的废弃物进行分类、包装和处理，符合相关法规和标准。

本文档涉及附件：1、慢生产记录表2、慢感染实验记录表3、细胞培养和传代记录表4、实验数据分析表格本文所涉及的法律名词及注释：载体、质粒、细胞培养、转染、传代、冻存、废液处理、废弃物管理。

慢病毒载体包装构建过程原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。

对于一些较难转染的细胞, 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达.概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 （H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。

携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒,通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括: 慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。

慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白.为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。

基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分.包装成分：由HIV—1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。

包装成分通常被分开构建到两个质粒上,一个质粒表达Gag和Pol蛋白,另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能.将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。

3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。

计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。

4、细胞离心，1000rpm，5min。

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。

该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。

VSV-GVSV-G载体基本信息：载体名称: VSV-G质粒类型: 慢病毒包装系统载体高拷贝/低拷贝: --启动子: --克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: --5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: --载体抗性: --筛选标记: --备注: --稳定性: --组成型: --病毒/非病毒: --VSV-G载体质粒图谱和多克隆位点信息VSV-G载体序列VSV-G其他相关慢病毒载体：Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAGpMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRCpCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMSFUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1 pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherry pLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1 pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-HygpLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CREpRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-PuropLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3GpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZpLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCSpGIPZ pLP2 pLP1FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTKpMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpvpSico pSicoR pLVTHMpGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3GFUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVGFUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miRpLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZpLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3GpLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-PuropLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK PuropLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTHpLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP。

慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenPEG6000溶液50%WakoHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。

在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。

）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。

将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。

慢病毒包装标准操作细则1. 目的：规范慢病毒包装标准操作程序2. 范围：适用于慢病毒包装操作工序3. 操作程序3.1器材准备无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、，移液枪（量程1000μL）、10cm培养皿、各种枪头，1.5mL EP管、试管架，酒精灯、振荡混匀仪、荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜3.2溶液准备1640培养基，Opti-MEM，Lipo转染试剂，293T细胞，重组慢病毒穿梭质粒，重组慢病毒骨架质粒(H1，H2)。

3.3操作步骤3.3.1转染前一天，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为6x 106细胞，重新接种于10 cm细胞培养皿，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。

24 h待细胞密度达～80%时即可用于转染。

细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

3.3.2第二天转染前用电动移液器将细胞培养基更换为无血清的1640培养基或是opti-MEM培养基。

3.3.3准备两个灭菌EP管，依次向一灭菌的EP管中加入10ug目的载体质粒，12ug pHelper 1.0质粒， 10ug pHelper 2.0质粒、相应体积的Opti-MEM培养基，总体积调整为500ul，轻轻混匀。

3.3.4在另一灭菌EP管中，加入460ul的Opti-MEM培养基和40ul Lipo转染试剂轻轻混匀，室温孵育5分钟。

3.3.5把两管含有载体的溶液与转染试剂的溶液进行混合，轻轻颠倒混匀，总体积为1ml，室温孵育20分钟。

将混合液滴加入细胞培养皿中，37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中孵育6h～8 h。

3.3.6培养6-8 h后换液，弃去含有转染混和物的培养基，每盘细胞加入10 ml的10% FBS的1640培养基，于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中培养。

3.3.7转染24h后观察转染效率并拍照。

3.4清场3.4.1物品集中在废液桶中灭菌后清洗。

1.慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：如果用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80 ℃冰箱（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）。

A．病毒可以-80 ℃保存6个月，滴度不会明显下降；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。

B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰上融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4 ℃保存(请尽量在三天内用完) 。

1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和细胞建系1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。

如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用细胞培养板，如96孔板、24孔板等等检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A.测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。

B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

C.我们提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。

如：病毒滴度为1E8 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1E8个具有生物活性的慢病毒颗粒。

稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。

2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。

是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。

有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。

慢病毒使用操作指南1. 引言1.1 目的本文档旨在提供关于慢病毒使用的详细操作指南，以确保实验室人员能够正确、安全地处理和利用该种类病毒。

2. 概述2.1 定义与特点- 慢病毒是一类具有复制缓激活机制并且感染后可长期存在于寄主体内的RNA或DNA 症候群相关性（SAR）等多个领域中发挥重要作用。

3. 实验前准备工作在进行任何涉及到潜在危险生物材料如此类型之前, 快速评估风险，并采取适当措施来最小化这些风险。

4 . 材料清单：下面列出了完成所需任务时可能需要的基本设备和试剂: - 生物安全柜级别II (BSL-2) 或更高级别环境下进行所有步骤；- 防护手套、防护眼镜/面罩和实验服;...5 . 实验流程：进行以下步骤以成功执行您对操纵蠕虫样品库存的需求:5.1 准备工作- 确保实验室环境符合慢病毒操作所需要的生物安全级别；- 检查所有设备和试剂是否齐全并处于良好状态。

5.2 培养基准备：...6 . 安全注意事项与风险评估7 . 应急措施及处理方法8 . 相关法律名词及注释：在本文档中，以下是一些常见使用到的法律名词以及其相应解释说明。

a) 生物安全柜 (Biosafety Cabinet, BSC):是用来提供对人员、产品和环境进行防护，并且在其中进行微生物学或细胞培养等活动时，提供无菌条件下能够有效地限制有害因素扩散传播而又不影响正常运行过程。

9. 结束语本文档涵盖了详尽的慢病毒使用操作指南，旨在确保实验室人员正确理解并遵循相关规定以最大程度上降低任何可能存在的危险性。

10. 文档涉及附件：请参考随信发送之文件列表。

金拓思慢病毒产品说明书一、产品简介慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，由于其结构和功能的特点，慢病毒载体作为一种重要的基因转移工具应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。

区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，达到良好的基因治疗效果。

我公司生产的重组慢病毒均以国际通用的第三代载体四质粒体系生产，通过重组改造后将含有目的基因的慢病毒骨架及其相应的作用元件组合为新质粒，并通过辅助质粒将病毒包装的元件组成重组病毒。

通过自我灭活的方式，阻止病毒自我复制。

保证了慢病毒使用过程中的良好生物安全性。

二、重要说明2.1安全操作说明1.应在Ⅱ级及以上级别生物安全柜中使用慢病毒产品。

2.虽经过改造后病毒安全性极大提高，操作中仍需佩戴口罩、手套等安全防护措施以免产生潜在危害。

3.操作中所有接触慢病毒试剂的样品、耗材、器皿等均需通过84消毒液（1:20）浸泡后，高温121℃灭活15min以上。

4.实验过程中有病毒液洒落的情况时，应用纸巾将病毒液吸干后喷洒70乙醇，并将擦干的纸巾一并高温处理以免造成其它伤害、污染环境。

2.2使用注意事项所有慢病毒产品均通过干冰低温运输，请收到产品后立即转入-80℃冰箱保存。

每次使用时提前取出病毒液放置在4℃冰箱待融化，并保存于4℃冰箱。

每次融化后请尽快使用，病毒液应尽量避免反复冻融降低病毒滴度。

三、慢病毒制备与使用3.1实验材料细胞：人贴壁细胞293T培养基：高糖DMEM培养基血清：胎牛血清抗生素：青链霉素转染试剂：Transfection-mate增强剂：Polybrene3.2病毒制备方法3.2.1细胞准备细胞复苏：1.将液氮保存细胞取出后，迅速放入37℃水浴锅内，应及时轻柔摇动加快解冻速度。

2.将完全溶解的细胞离心，1500rpm，3min。

YRGene 慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm 皿 产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1） 优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。

（2） 高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T 细胞转染效率接近 100%）。

（3 ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优 势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。

产品组成：1. 转染前，传代 293FT 细胞于10cm 培养皿中（例如，接种 1 x 107细胞于10cm 培养皿中，使用完全 培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到 90-95%即可进行转染。

Tips :培养基里面不要添加抗生素。

2. 转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml 新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。

3. 准备转染。

在5ml 离心管中，分别配制 A 管与B 管试剂（Tube A and Tube B ）配好后，放置5min ，然后将A 管缓慢加入B 管，混合均匀。

室温放置20min ，使得脂质体-DNA 混合物形成。

Tips :混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。

然后将混合液逐滴均匀加入 10cm 培养皿，轻微混匀。

置于37C, 5% CO ?培养箱中培养过夜。

4. 第三天，更换培养基，加入 10ml 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。

5. 转染后48-72h 后收取上清，转移至 15ml 离心管。

Tips :上清里面含有病毒，请小心操作。

6. 3000rpm 在4C 离心15min ，去除沉淀。

7. 上清液用0.45卩m 滤器过滤后转移到新的离心管中。

慢病毒浓缩：1. 每10ml 过滤后的病毒初始液，加入 Concen Solution 3ml ，每20-30min 混合一次，共进行 3-5次。

慢病毒操作资料说明慢病毒操作资料说明1、Hexadimethrine bromide.pdf：这是Hexadimethrine bromide（别名Polybrene）的说明书，该试剂用于提高慢病毒的感染效率，在病毒滴度测定和病毒感染实验中均需使用；2、Lenti-X™ Concentrator.pdf：这是Lenti-X Concentrator的说明书，该试剂用于病毒粒子的浓缩纯化；3、Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf：这是过表达慢病毒（用于基因过表达）的操作说明书4、Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf：这是干扰慢病毒（用于基因干扰）的操作说明书5、pLVX-shRNA1 Vector Information.pdf：pLVX-shRNA1慢病毒干扰载体说明书6、pLVX-IRES-Neo Vector Information.pdf：pLVX-IRES-Neo 慢病毒过表达载体说明书7、慢病毒（Lentivirus）载体.pdf：慢病毒载体介绍8、Lenti-X™ Lentiviral Packaging Systems FAQs.pdf：慢病包装系统常见问题介绍9、病毒纯化-PEG6000.doc：病毒纯化方法10、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒；11、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒；12、Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf：慢病毒包装、纯化、滴度测定操作指南，供理论学习；13、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；14、慢病毒实验方法.doc：慢病毒包装报告单；15、慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc：慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染操作指南；。

慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。

本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。

一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。

慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。

这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。

二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。

2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。

三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。

2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。

3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。

4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。

5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。

6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。

四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。

2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。

3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。

4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。

5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。

6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。

如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。

实验室用慢病毒包装与感染细胞实验方案1.实验材料：细胞株：293细胞质粒：pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro（简称CDHv）pMDL-gag/pol RRE（简称RRE）pVSV-G（简称VSVG）pRSV-Rev（简称REV）转染试剂：聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI），贮存液浓度为1mg/ml。

Sigma公司产品，Cat No. 408727-100ML感染增强剂：polybrene(hexadimethrine bromide)，中文名称为：凝聚胺或海地美溴铵其它：一次性注射器、0.45um针头滤器等2. 实验程序：1. 首先将目的基因克隆至CDHv的多克隆位点区获得CDHv-Gene，而后制备包括CDHv、RRE、VSVG和REV在内的5种质粒；2. 培养293细胞至其生长情况良好，接种至10cm细胞培养皿中，细胞数目以12hr后或第二天转染时细胞覆盖率为70-80%为佳；3. 转染293细胞：分别在两个洁净的1.5ml离心管加入500ul无血清MEM（或DMEM、PBS、saline），其中一只管中混合包装病毒用四种质粒（CDHv或CDHv-Gene、RRE、VSVG和REV），各质粒用量依次比例为4ug:4ug:3ug:2ug(或为4ug:4.2ug:3.2ug:2.1ug)，轻轻吹打3-5次混匀；另一只管中加入PEI溶液，用量（ul数）与质粒量（ug数）大致保持1:1的关系，即第一只管中加入13ugDNA，此管中即加入13ul 浓度为1mg/ml 的PEI溶液，同样轻轻吹打混匀后，将第一管中的质粒溶液加入至第二管中的PEI溶液中，室温放置孵育15分钟后，直接加入铺有293细胞的培养皿中（此处293细胞转染前可不换液），轻轻晃动培养皿混匀后继续常规培养；4.（可选）大约8hr后，更换新鲜的完全培养基（温育为佳），继续常规培养；5. 培养48-72hr后，培养基变黄，部分293细胞浮起，收集上清至离心管中离心数分钟（目的是除去可能掺杂的293细胞，不至于下一步过滤时阻塞针头滤器），利用一次性注射器和洁净的0.45um针头滤器过滤上清至洁净的离心管中，此上清可直接冻存于-80℃备用，直接感染细胞最佳；6. 感染目的细胞：可直接将过滤后的病毒上清直接加入弃去原有培养基的铺有目的细胞的培养皿中（此时的目的细胞也应生长状态良好，覆盖率不宜过高，个人认为50-60%为宜，过高可能会因为细胞过度生长营养不足且感染效率低，或过低会形成大量病毒攻击少数细胞，两者都可能会引起大量细胞死亡），12hr 后丢弃病毒，更换新鲜培养基。

一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。

在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A 尾。

当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4 个U。

U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop）。

慢病毒感染敲低流程
一、慢病毒包装
1．复苏293T细胞于10cm皿中，传至第3-4代。

2．转染病毒包装质粒（PEI转染）：
（1）转染前2小时换无血清培养基。

（2）质粒DNA稀释至1mlDMEM中，枪头吹匀（8μg shRNA 和各4μg pMDLg/pRRE, RSV-Rev, CMV-VSVG）。

（3）20μL PEI稀释至1mlDMEM中，用枪头缓慢吹匀，室温放置5min。

（4）DNA稀释液加到PEI稀释液中，缓慢吹匀,室温放置5min。

（5）DNA和PEI混合液加入到10cm皿293T细胞中，摇匀后于培养箱培养。

（6）4h后换有血清培养基。

3. 48h 和72h收集病毒液，保存于4度冰箱。

合并病毒液，3000rpm 离心10min取上清，0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

二、病毒感染筛选
1．复苏HELA细胞于10cm皿中，传至2-3代。

2．细胞大约70%汇合度时，换8μg/ml polybrene的新鲜培养基，加2ml病毒液。

3．培养12h后继续感染（同2）。

4．感染后48h加puromycin至终浓度为3μg/ml。

5．感染后72h传代，继续使用puromycin筛选一代。

6．进行Western检验及其他试验。

傅锦林11.4。