3-高效液相色谱分析d3(精)

高效液相色谱法测定制剂中维生素D3粉的含量摘要用高效液相色谱法测定VD3粉中VD3的含量。

采用菲罗门氨基键合硅胶柱（250mm×4.6mm，5μm），以正己烷-异丙醇（99：1）为流动相，流速为1.5ml/min，检测波长为265nm，柱温为25℃。

在此色谱条件下，维生素D3浓度在18.86μg/ml时进样量在10μl～100μl范围内呈良好的线性关系，r=1.0000，平均回收率为99.46%，RSD（n=6）为0.90%。

结论：本方法操作简便易行，系统使用性良好，适用于VD3粉中VD3的含量测定。

关键词：维生素D3粉；维生素D3；复方制剂；高效液相色谱法维生素D3（胆钙化醇；英文名：Vitamin D3）是一种脂溶性维生素，被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，帮助肠道内钙和磷的吸收，促进骨钙沉积，增加肾脏对钙、磷的重吸收，提高血钙、磷的浓度，有利于骨的矿化作用。

上市的补钙和补维生素的复方制剂中大多都含有VD3，由于VD3在复方制剂中含量极低，对光、热不稳定，在空气中易氧化和光解成前维生素D3、反式维生素D3、光甾醇和速甾醇等多种产物，在品种开发时多选取制成包合物的VD3粉为原料，以便提高产品的稳定性。

DSM生产的VD3粉加入维生素E、大豆油、明胶制成包合物的形式提高了稳定性。

但包合物的形式造成测定时VD3提取难度增大，有文献报到采用皂化后提取测定，此方法操作繁琐，而且提取中有损失影响结果。

另有采用稀释剂（DMSO-水10：2，0.2%BHT）溶解后，正己烷提取浓缩的方法，以达到液相测定浓度的要求，此方法操作时间长，提取浓缩过程中人为误差较大。

维生素D3粉进口注册标准JX2008006[7]中提取采用的是回流、萃取、旋蒸、充氮、溶解等方法，操作时间长、操作步骤繁琐，误差大。

本文参考相关文献[1] [2] [3] [8]并经验证，证明采用方法准确可靠，且操作简便、快速。

1仪器与试药高效液相色谱仪（赛默飞U3000、岛津SPD-M20A）；分析天平（奥豪斯AUW120D）；VD3对照品（批号：100061-201208，含量：99.8%，中国食品药品检定研究院）；VD3粉（10万单位/g，瑞士DSM Nutritional Products Ltd）；正己烷、异丙醇和甲醇为色谱纯；二甲基亚砜、二氯甲烷为分析纯。

饲料中维生素D3含量检测科标化工分析检测中心通过市场调查和实验结果，发现养殖户为了解决家禽缺乏维生素D3所带来的“弱腿病”、生长率和饲料利用率下降、产蛋率下降等问题，在饲料中添加维生素D3，为了更好的监测饲料中维生素D3含量，科标化工分析检测中心现开发了其检测方法。

科标化工分析检测中心可依照ISO、ASTM、DIN、GB、HB等标准完成食品、饲料、药品、纺织品、农业、高分子材料、生物产品、建筑材料以及微生物产品理化性能、力学性能、电气性能等测试。

中心通过了中国国家认证认可监督管理委员会和中国合格评定国家认可委员会的二合一（CMA、CNAS）实验室认证认可，能出具权威的第三方检测报告。

饲料中维生素D3的含量检测(高效液相色谱法)一、实验原理科标化工分析检测中心参照国标GB/T17818-2010饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法中第一法皂化提取法，试样经粉碎、过筛后，用碱溶液皂化，乙醚提取维生素D3，蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇，取部分溶液用C18小柱净化，收集滤液，蒸发至干，用正己烷溶解，反相液相色谱柱分离测定，紫外检测器检测，外标法定量分析。

二、仪器和试剂试验地点：青岛科标化工分析检测中心实验室。

仪器：高效液相色谱仪带紫外检测器，AS3120超声波发生器；试剂：甲醇为色谱纯试剂，实验用水为超纯水，维生素D3标准品（购于日本CPE公司）。

三、试验方法1.皂化称取样品（配合饲料称取10g~20g，浓缩饲料10g，维生素预混饲料或复合预混合饲料1g~5g）精确至0.0001g，置于250ml圆底烧瓶中，加入50ml5g/LL-抗血酸乙醇溶液，混匀，加入10ml氢氧化钾溶液，混匀，置于沸水浴上回流30min，不时震荡防止样品粘附在壁上。

皂化结束，分别用5ml无水乙醇、5ml蒸馏水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至室温。

2.提取定量转移全部皂化液于盛有100ml无水乙醚的500ml分液漏斗中，用40ml水分3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，用160ml乙醚分三次萃取，合并乙醚相。

维生素D3的含量检验方法一、目的：建立维生素D3含量检验操作规程，保证分析结果的准确性。

二、依据：GB/T 5413.9-1997含量检验操作三、范围：本规程适用于本公司维生素D3四、职责：质量检验员对本标准的实施负责五、正文：1、试制和溶液1.1 高峰氏淀粉酶（Taka-Diastase）1.2 异丙醇：色谱纯1.3 焦性没食子酸的乙醇溶液15g/L1.4 氢氧化钾溶液：质量比100:501.5 石油醚：沸程30~601.6 甲醇：重蒸后使用。

1.7 正己烷：色谱纯。

1.8 环己烷：色谱纯1.9 维生素D3标准储备液：含维生素D3100ug/ml（称取10mg维生素D3，用甲醇定容于100ml量瓶中）1.10 维生素D3标准工作液：取维生素D3标准储备液1ml于100ml量瓶中，用甲醇定容。

2、实验室常用仪器。

2.1 高效液相色谱仪：具有可变波长的紫外分光检测器、数据处理系统或记录仪。

2.2 平底烧瓶：250ml2.3 分液漏斗：500ml2.4 旋转蒸发器。

3 分析步骤3.1 试样处理准确称取10g样品，放入250ml平底烧瓶中，加入1gTaka淀粉酶（3.1），再加入30ml45~50℃的蒸馏水，混合均匀后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞，置45℃烘箱内30min，于上述样品中加入100ml没食子酸的乙醇溶液（3.3），充分混匀后加入50ml氢氧化钾溶液（3.4），在蒸汽浴上回流30min后，立即冷却到室温。

将冷却后的皂化液转入500ml分液漏斗中，用100ml水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中；于分液漏斗中加入100ml石油醚（3.5），盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min，静置分层，将水相放入另一500ml分液漏斗中。

重复上述萃取过程二次，合并醚液到第一个分液漏斗中。

用蒸馏水洗至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干后，用石油醚转移至10ml量瓶中，定容。

2020.11科学技术创新时间 /min 流速 /(mL/min) A /% B /% 0 0.8 15 85 10 1.0 0 100 15 1.0 0 100 16 0.8 15 85 200.8158525-羟基维生素D 3（25-OH-D 3），是维生素D 3在机体内的首个代谢产物，更易被吸收[1]。

目前，25-OH-D 3已广泛用于畜禽养殖业，用于提高蛋壳质量[2]、提高母猪怀孕率及窝产仔数[3-4]等。

目前关于饲料中25-OH-D 3含量测定的报道仅限于配合饲料及浓缩饲料[5-6],至于预混合饲料方面，仍为空白。

此外，维生素预混合饲料中25-OH-D 3的含量高，用量大，又是配合饲料和浓缩饲料中25-OH-D 3的来源。

因此，本文建立了维生素预混合饲料中25-OH-D 3含量测定的方法以期为维生素预混合饲料的质量控制提供技术手段。

1试验部分1.1仪器和试剂高效液相色谱仪（ACQUITY Arc ，Waters 公司）；电子天平（AB265-S ，梅特勒-托利多公司，精度为0.01mg ）。

25-OH-D 3标准品（Dr.Ehrenstorfer 公司，纯度为98.2%，批号为G155330）；甲醇为色谱纯；试验用水为一级水；维生素预混合饲料样品来自于市场收集。

1.2色谱条件采用Thermo AQUASIL-C 18色谱柱（规格为100mm ×3.0mm ，粒径3μm ），检测波长为264nm ；50μL 进样；柱温箱温度为30℃；流动相：A 相为水，B 相为甲醇，梯度洗脱程序见表1。

1.3试样溶液的制备称取维生素预混合饲料3g 置于50mL 棕色容量瓶中，加水10mL ，超声10min ，冷却；继续加入30mL 甲醇，混匀，超声提取20min ，冷却，用甲醇定容，稀释至刻度，摇匀；移取20mL 于离心管中，离心5min （6000转/min ）取上清，过0.22μm 滤膜，得到试样溶液。

分析与检测Oct 2018 CHINA FOOD SAFETY29现行的饲料中维生素A 、维生素D 3、维生素E（以下简称“VA、VD 3、VE”）的检测方法均为液相色谱法，其中VA 的检测方法为GB/T 17817-2010，定量限为1000IU/kg；VD 3检测方法为GB/T 17818-2010，定量限为500IU/kg；VE 的检测方法为GB/T 17812-2008，定量限为1IU/kg。

饲料原料中VA、VD 3、VE 含量在方法的定量限之下时，上述方法无法准确检出它们的含量。

虽然饲料原料中VA、VD 3、VE 的含量很低，但由于饲料原料的添加比例很大，因此饲料中VA、VD 3、VE 的总量十分很可观，故研究适用于饲料中VA、VD 3、VE 低含量的检测方法是一件十分有价值的工作。

1 研究内容1.1 优化前处理方法1.1.1 皂化反应溶液需先离心：皂化反应后的样液转移至离心管中，离心取上清液转移至分液漏斗中，防止样品残渣堵塞分液漏斗。

1.1.2 用石油醚代替乙醚：石油醚的提取效率和乙醚的提取效率基本相同，且因为石油醚的毒性低于乙醚，因此用石油醚代替乙醚。

1.2 考查线性相关性用甲醇溶液配置VA、VD 3、VE 工作液，其系列浓度分别为0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L。

相同条件下，用串联质谱检测上述曲线各点的峰面积，VA 的浓度与峰面积的相关系数为0.9998，VD 3的浓度与峰面积的相关系数为0.9999，VE 的浓度与峰面积的相关系数为0.9995。

1.3 净化小柱的选择根据VA、VD 3、VE 的性质特点，应选取吸附特性为非极性的净化小柱。

经查阅资料，选择安捷伦公司提供的Bond Elut ENN、Bond Elut LMS、Bond Elut ENV、Bond Elut PLEXA4种净化小柱。

笔者分别考察并进行了VA、VD 3、VE 过净化小柱的回收率，其中，Bond Elut PLEXA 净化小柱VA、VD 3过柱回收率达到99%，VE 过柱回收率达到93%。

高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素D3的含量:墨:oliTraditionalChineseMedicalUniversity2007,voI.10No.2图3金花茶叶乙醇液二阶导数光谱图图4金花茶叶氯仿液零阶光谱图图5金花茶叶氯仿液一阶导数光谱图^.^^人^i^!6.VV一图6金花茶叶氯仿液二阶导数光谱图3讨论3.1在可见紫外鉴别中,金花茶叶可供鉴别的特征峰较多,特别是其氯仿提取液在可见光区和紫外光区特征峰更明显.在乙醇液零阶光谱图中,在243,276,663121TI波长处有明显的吸收,其中243nm为最大吸收峰,276为肩峰;叶的氯仿液零阶光谱图在246,416,458,668nm波长处有明显吸收峰.其中416啪为最大吸收峰,这些特征均具有一定的鉴别意义.3.2在一阶,二阶导数光谱图中,金花茶叶的乙醇液在200～32Onto和650～70Ohm;氯仿液在200～3o0啪,400～500nm和600--700nm中均有鉴别特征.整个光谱曲线均具有鉴别意义.3.3金花茶是我国一级保护的珍稀物种,不仅具有较高的观赏价值,而且具有一定的营养价值和药用价值.本研究可为金花茶叶药材的鉴定提供依据.参考文献[1]中国科学院.中国植物志[M].北京:科学出版社,1998.49.[2]梁盛业.金花茶[M].北京:中国林业出版社,1993.123.(编辑陈明伟)高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素D3的含量'梁晓艳(广西中医学院附属瑞康医院,广西南宁530011)摘要:[目的]建立反相高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素D3的含量.[方法]采用KromasilCl8反相色谱分离柱,流动相为甲醇-乙腈(90:10),检测波长为265nm,流速为0.8rnl/min,加入维生素A和维生素E进行干扰试验.[结果]维生素,03在0.5～lOOmg/L浓度范围内线性关系良好,维生素平均加样回收率98.9%～108.4%,RSD收稿日期:2006—09—202007年第10卷第2期广西中医学院?59?2.22%--4.28%;维生素A和维生素E不干扰测定.【结论]本方法简单,易于操作,分离效果好,结果准确,受干扰因素小,适宜测定片剂中的维生素D2和维生素D3.关键词:维生素D2;维生素D3;高效液相色谱法;钙镁D片中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:1008—7486(2007)02—0058—04脂溶性维生素D是人体必需的营养素,其主要形式是维生素D3(Ch)lecaldferol,胆骨化醇)和维生素132(~dferol,骨化醇),分别来源于动物和植物,结构相似,功能相近.维生素D能够维持血钙水平稳定,调节钙磷代谢,维持骨骼的正常钙化,肌肉收缩,神经传导和所有细胞的正常功能,还有免疫调节作用,增强机体对感染的反应;主要用于预防和治疗骨质疏松症,以及预防癌症,多囊性卵巢综合征,牛皮癣,糖尿病等疾病[.由于维生素D2和D3的结构相似,色谱行为相近,对其有效分离和定量具有一定难度,因此同时测定药品中两种维生素D的报道尚不多见_2q].本文建立了反相高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和D3的含量,结果满意,现报道如下.1实验材料1.1仪器Agilem1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),紫外检测器,自动进样器(安捷伦公司);HS20500D超声波清洗器(BENCHTOP);离心机(上海安亭科学仪器厂). 1.2药品与试剂钙镁D片(市售品);维生素D2,D3对照品(购自Sigma公司,含量>99.0%);水为超纯水;甲醇,乙腈(色谱纯).2实验方法2.1对照品溶液的制备混合对照品贮备液分别精密称取维生素D2,D3对照品各0.1g,置100ml量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制得浓度为lmg/ml的混合对照品贮备溶液.贮存至4℃条件下.混合对照品溶液精密吸取混合对照品贮备液5ml,置于50ml量瓶中,用流动相定容至刻度,制得浓度为0.1mg/ rnJ的混合对照品溶液.2.2供试品溶液的制备取样品10片,研细,混匀.取1g,精密称定,置lOml具塞比色管中,加流动相8ml,摇匀,超声提取20mln,加流动相定容至刻度,摇匀,转移至离心管,置离心机中以4000r/rnln离心5min.吸取上清液,经0,45tan滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液.2.3对照品溶液的纯度校正由于维生素D2和对光不稳定,因此在配制对照品溶液之前需用紫外分光光度法进行纯度校正.具体方法参照中国药典l-8J.2.4色谱条件色谱柱:KromasilC18柱(4.6×150mm,3/zrn);流动相:甲醇一乙腈(90:10);流速:0.8ml/mln;检测波长:265nm;柱温:25℃;进样量:10.2.5线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液0.25,1.0,5.0,10.0,25.Oml,置50ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,进样.以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线.得回归方程:=32.756C一1.4072,r=0.99996.An:33.599C一1.1979,r=0.99996.结果表明维生素D2,j在0.5～100mg/L浓度范围内均有良好的线性关系.检测限按3倍空白噪声计算.维生素D2,D3的检出限均为0.3ng,若称样1g,最低检出浓度为0.3~g/g.按信噪比(S/N)为10时,最低定量浓度为1.O~g/g.2.6系统适用性试验精密吸取供试品,混合对照品溶液各10,按2.4项色谱条件进样测定,色谱图见图1.结果表明供试品在混合对照品色谱图相应位置上有相同保留时间的色谱峰.且被测成分与相邻杂质峰分离良好.2.7干扰试验在维生素D2,D3的混合对照品溶液中加入维生素A,a,B,,占四种维生素E和维生素E醋酸酯的对照品,在上述色谱条件下分离,色谱图见图2.从图2中可以看出,维生素A,E,D2,D3都得到很好的分离,维生素A,E不干扰维生素D2,的测定.2.8精密度试验对同一份供试品溶液,连续进样测定6次,结果维生素D2,D3峰面积RSD分别为1.05%和1.17%.2.9重复性试验精密称取同一批供试品6份,按供试品溶液制备方法制备,依法测定,结果维生素平均含量0.1013mg/~,RSD为1.64%.维生素D3平均含量<0.0003mg/片.2.10稳定性试验对同一供试品溶液,在棕色瓶中和室温下放置Oh,lh,2h,4h,6h,8h,分别进样测定峰面积,结果维生素D2峰面积的RSD为2.08%(,z=6),维生素D3峰面积的RSD为2.26%(,z=6),表明供试品溶液在8h内有良好的稳定性.2.11加样回收率试验精密称取已测知含量的样品1g于10ml具塞刻度管中,分别精密加入维生素D2对照品适量,分高,中,低三种浓度加标,按"供试品溶液制备方法"项下操作,进样测定含量,计算加样回收率.每个浓度均平行试验6次.结果见表1.表1维生素D2加样回收率试验结果JournalofGuangxiTraditionalChineseMedicalUniversity2007,V ol.10No.2 mA【JmAUVWDIA.Wavelength265nm(VITD6213/H/ST3.D)占'200150loom^U扣田0246810l2A混合对照品VWDIA,Wavelength=265nm(VITD6213/IS-33D)l6min口F-.豢壁&八山.02468l0l2B供试品图1}玎Lc色谱图16min图2混合对照品加维生素A,EHPLC图谱2.12样品测定取3批样品,根据供试品溶液制备方法制备样品溶液,按2.4项色谱条件进样测定含量,每批平行测定3次,结果见表2.3讨论3.1色谱柱的选择实验中曾采用ZorbaxSBCl8柱(Stun,4.6mmX250mm)和Waterst~BondapakCl8柱(1Opm,4.6mm ×250ram)反相分离柱,不断改变流动相配比,但维生素D2 如加巧mO2007年第10卷第2期广西中医学院?61?和维生素D3分离度均小于1.2,不能达到基线分离.本文采用KromasilC18柱(m1,4.6mmx150mm)进行分离,维生素D2和维生素D3分离度均大于2.5,分离良好.表2样品测定结果(=3,mg/h")3.2色谱流动相的选择单独采用甲醇,出峰时间较长;单独采用乙腈,毒性和成本加大.通过改变甲醇和乙腈的比例,保留时间和分离度均随之改变.本文选用甲醇.乙腈(90:10),分离度等于2.0,保留时间合适,避免了杂质的干扰.3.3本方法能将维生素D2和维生素D3良好分离;方法简便,易于操作,出峰时间适宜,干扰小,色谱峰重现性好,结果准确.由于目前市售的药品和保健食品很多没有标明添加的是维生素D2还是维生素D3,往往给检测工作带来诸多不便.本方法可以同时测定片剂中的维生素和维生素,节约了时间成本,提高了工作效率.参考文献[1]周建烈,柳启沛.实用维生素矿物质补充剂手册[M].北京:中国轻工业出版社,2003.46~48.[2]蒋晔,刘红菊,郝晓花.4种脂溶性维生素的非水反相HPLC测定[J].中国医药工业杂志,2005,36(2):93～94.[3]张玫,刘新字.高效液相色谱法测定维多宝泡腾片中的维生素D3的含量[J].上海医药,1998,19(2):36～37.[4]张学农,周慧,苗爱东,等.正相高效液相法测定碳酸钙颗粒剂中微量维生素D3含量[J].新疆医科大学学报,2002,25(1):39～41.[5]周春兰,金锡然,韩宁.高效液相色谱法测定维生素D2糖丸的含量[J].黑龙江医药科学,2004,27(1):97.[6]历士旺,赵亚平,张亚锋,等.HPLC法测定钙一D颗粒剂中维生素D3的含量[J].西北药学杂志,2003,18(1):3--4.[7]彭清涛,谭生建,崔瑞芳,等.高效液相色谱法测定钙维康胶囊中维生素D3的含量[J].药物分析杂志,1998,18(6):395--396.[8]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2000.55.(编辑陈明伟)高效液相色谱法测定排石Ⅱ号颗粒剂中绿原酸的含量农英高.莫海玲,李以军.于灿华(广西壮族自治区民族医院,广西南宁530001)摘要:[目的]建立高效液相色谱法测定排石Ⅱ号颗粒剂中绿原酸的含量.[方法]色谱柱为ZorbaxC18柱(250mm×4.6mm,5tan),流动相为乙腈一0.5%磷酸溶液(11:89),检测波长为326nm,流速为1.0ml/min.[结果]绿原酸进样量在0.2064～2.064txg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r:0.9997),平均回收率为100.3%,RSD=0.66%(=6).[结论]本方法简便,灵敏,准确,重现性好,可用于该制剂的质量控制.关键词:绿原酸;排石II号颗粒剂;高效液相色谱法中图分类号:R284.1文献标识码:A文章编号:1008—7486(2007)02—0061—03我院自制制剂排石Ⅱ号颗粒剂来源于临床经验方,由广金钱草,石韦,海金沙,泽泻,赤芍等九味中药组成,对尿路结石,肾盂肾炎,胆囊炎等有很好的疗效.目前该制剂的质量标准尚元含量测定,为了控制该制剂的质量,保证临床用药效果,本文采用高效液相色谱法对方中君药石韦的主要有效成分绿原酸进行含量测定,结果满意,现报道如下.收稿日期:2007—03—20l仪器与试药1.1仪器美国Beckman公司高效液相色谱仪(125泵,166检测器);电子天平(BP_211D,sartorius,德国);德国Elma13-78224型超声仪.1.2试药绿原酸对照品(批号:110753.200212,供含量测定用,由中国药品生物制品检定所提供);排石Ⅱ号颗粒剂为广西民族医院研制品;乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯;。