TB法制备高效感受态细胞

在科研实验中，为了获得纯的重组质粒DNA，需要允许外源DNA分子进入的细胞。

经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。

基本制备步骤1.从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养3 h。

一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。

2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。

3.于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5.每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。

6.于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

8.每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。

9.此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。

洁净是最重要的~无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。

离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。

涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复。

轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。

整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。

Preparation of Highly Efficient Chemical Competent cell Reagents:所有的ddH2O都必须是最高级别纯度的水（18.2M）,容器专用，避免一切活性洗涤剂或者有机溶剂。

1:0.5M PIPES(PH6.7)15.1gPIPES溶于80mlddH2O中，5M KOH调至PH=6.7,定容至100ml，Nalgene（0.22um）过滤除菌，-20度分装保存。

2：Transformation Buffer(TB): For 250mlMnCl2.4H2O 2.72g 55mmol/LCaCl2.2H2O 0.55g 15mmol/LKCl 4.66g 250mmol/LPIPES(0.5M PH6.7) 5ml 10mmol/LH2O 补至250mlNalgene（0.22um）过滤除菌，Store at 4℃3：SOB: For 200ml2%Bactotryptone 4g0.5%Yeast Extract 1g10mM NaCl (5M stock,0.4ml)2.5mM KCl (2M stock, 0.25ml)Mix above four in 198ml of ddH2O,Sterilize by autoclave in a 1Lflask. Prepare 2M Magnesium solution(1M MgSO4+1M MgCl2), Sterilize by autoclave.可以直接用2M MgCl2。

Add 2ml of Mg solution into the autoclaved IL flask containing 198ml of BactoTrytone/Yeast Extract/NaCl/KCL solution. Store at 4℃4：LB agar plates without antibiotics.5: E.coli for competent cells(usually I use DH5αor XL-blue),without any plasmid.ProceduresDay1:1:Streak a favorite strain of E.coli on a LB agar plate without antibiotics. Incubate at 37℃for O/N2: Make TB and SOB.Day2:3:Pick up 1-2 colonies and inoculate them to 200ml of SOB in a 1L flask.4:Incubate culture at 200-250rpm/min at 18℃.This culturing temperature is critical. If cultured at room temperature, we see about 5 to 10 fold decrease in competency. Never try to culture at 37℃.We usually use a shaker with a cooling system, or put a normal shaking incubator into a cold room to grow cells.Grow cells until OD600 become between 0.4 and 0.8(0.6 is optimal).It takes 24-48hours depending on the number and size of colonies used.Day3:5:Put the flask on ice for 10 min.6:Spin down at 3000rpm,4℃for 10min.7:Resuspend gently in 80ml of ice-cold TB(or 1/3volumc of culture medium),place on ice 5min.8:Spin down again at 3000rpm,4℃for 10min.9:Resuspend cells in 20ml of TB gently on ice.10: Add 1.5ml of DMSO (final 7%vol/vol) dropwise while gently shaking. 11:Incubate on ice for 10min.12:Aliquot cells in 50-100ul into screw-cap tubes.13:Free them by putting in liquid N2.The use of liquid N2 is critical for high transformation efficiency.14:Keep cells in liquid N2.Alternatively the cells can be kept at higher temperature in deep freezer(-135℃or -80℃)although the transformation efficiency will be droping during the storage.通常保存于-80℃，一定注意不要频繁的造成温差，每次拿取尽量迅速，同时注意分装。

制备感受态细胞的原理1. 什么是感受态细胞1.1 定义感受态细胞，听起来像是个高大上的名词，其实就是那些“准备好”接受外界信息和刺激的细胞。

想象一下，像个随时待命的服务员，时刻准备接待客人。

细胞的这种状态，通常是在特定的环境下，通过某些方法处理后形成的。

1.2 重要性为什么要制备感受态细胞呢？这可是生物实验中的关键一步！它们能帮助我们进行基因转化、疫苗研究，甚至是药物开发。

就像一个关键的道具，缺了它，很多实验都没法顺利进行。

2. 如何制备感受态细胞2.1 基本步骤制备感受态细胞的过程其实并不复杂，简单来说就是要让细胞放松心情，准备好接受外来的DNA。

首先，我们需要把细胞放在一个低温环境下，这就像给它们一个凉爽的SPA，让它们变得“懒洋洋”的。

接着，添加一些化学试剂，比如氯化钙，这些化学试剂可以帮助细胞的膜变得更容易接受外来的DNA，哇，真是神奇！2.2 处理时间然后，细胞要在这个特殊的环境中待一段时间，让它们完全“感受”这个过程。

通常，我们会让它们静置一小时左右，这段时间就像让一个小孩在游乐场里玩耍，兴奋而又期待。

当时间到了，嘿！细胞已经准备好迎接挑战了。

3. 实际应用3.1 科研领域在科研领域，感受态细胞的应用真是无处不在。

比如，科学家们可以将新的基因片段导入这些细胞中，看看它们会发生什么样的变化。

就像给一个平凡的角色增加超能力，结果往往出乎意料，有时候能发现新的疾病机制，有时候能找到新的治疗方法，简直就是科研的“黑科技”！3.2 工业应用当然，感受态细胞的应用不仅限于实验室，它们在工业上也大显身手。

比如，利用这些细胞生产蛋白质，甚至是药物，提升生产效率，降低成本，简直是企业的“秘密武器”。

有了它，企业就能在竞争中抢占先机，像个抢眼的明星一样脱颖而出。

总之，感受态细胞的制备虽然听起来复杂，但只要掌握了窍门，便能游刃有余。

它不仅是生物学研究的基础，更是现代科技进步的重要推动力。

就像一首动听的乐曲，细胞的“感受态”是其中不可或缺的音符。

感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。

一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。

由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。

其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。

这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。

2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。

这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。

一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。

此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。

3、利用小分子引起的感受态细胞制备。

小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。

这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。

以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。

此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。

另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。

因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。

使用说明书TransEasy TM超高效感受态细胞制备试剂盒产品套装编号：U0201A / U0201B / U0201C产品成分包装规格储存条件Solution A1×1ml-20ºC保存。

1×10ml1×50mlSolution B1×1ml-20ºC保存。

1×10ml1×50mlpUC19(10 pg/μl) 1×50μl-20ºC保存。

产品概述本试剂盒是在制备高效感受态细胞的标准方法上结合了一步法制备感受态细胞的方法，既可以一步制备超高效的感受态细胞，又可把常态细胞（包括新鲜培养的菌液,新鲜的或4ºC放置数月的培养基菌落,甘油菌种保存液等）快速制备成感受态细胞。

产品特点一步超高效感受态细胞制备方法快速感受态细胞制备方法(细胞转化液)1. 转化率高：所制备的感受态细胞转化率可达109cfu/µgpUC19 DNA（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。

2. 操作简单：只需离心一次即可完成感受态细胞的制备。

3. 产率高：制备的感受态细胞数量比普通方法多一倍。

4. 稳定性好：所制细胞在-80ºC保存一年以上，其转化率几乎不会降低。

1. 转化率适中：使用10ng质粒转化一般能得到上万个转化子，效率在105到107cfu/μg质粒之间。

2. 操作简单快捷：不需专门制备感受态细胞，可直接使用常态细胞进行质粒转化，随用随配，整个操作过程在一个1.5ml离心管中即可完成。

3. 设备要求低：无需冷冻离心机和恒温摇床，菌种无需过夜培养，最短只需1小时培养时间。

用户需准备的试剂（相关配置见附录）S.O.B培养基（含有20mM Mg2+）液氮或者乙醇干冰S.O.C培养基LB平板（含有抗生素）用户需准备的设备温控摇床离心机（大量制备需冷冻离心机）超净工作台水浴锅分光光度计（可见光）感受态细胞制备操作流程方法一：一步超高效感受态制备方法1.接种从-80ºC冰箱中取出冻存的甘油菌，直接挑取部分菌液（无需解冻）接种于含100ml S.O.B培养基（含相应抗生素）的500ml三角瓶中，也可挑取已经划线纯化的新鲜单菌落接种于S.O.B培养基中，或者将已隔夜摇好的母液按照1:100比例接种于S.O.B培养基中，以上三种接种方法可以根据需要自主选择（直接从冻存的细菌原种接种培养的细菌，所得到的转化效率高于使用连续传代、4ºC或室温贮存的培养物）。

感受态细胞的制备的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

感受态细胞的制备步骤和原理实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。

制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

本次实验的目的就是增加质粒的数量。

同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。

实验原理及过程实验步骤1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37℃，180rpm 培养过夜。

[ 让菌复苏，进入对数期的早中期。

此时更容易制得感受态细胞。

]2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37℃250rpm大约2.5 小时。

[ 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。

]3 取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。

（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）[ 使细菌的生长停止，代谢减慢。

因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。

]4 菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2 中，轻吹，4℃ 30min ，4000rpm 离心5min 弃上清。

[ 细菌处于0 度，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。

（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]5 菌体重悬于1mL 100mmol/L 冰冷的CaCl2 中，轻吹，用于转化。

[ 除去所有的LB 以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。

防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。

（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]6 取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a 质粒，冰浴30 min 受体菌：感受态细胞100uL ，加入 2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2 溶液100uL，加入 2 uL 阴性对照[ 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a 质粒未被污染。

感受态细胞常用的制备方法常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

?α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

杆菌电转化感受态细胞制备经验过程实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养。

2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。

准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。

感受态细胞制备
感受态细胞制备是一种技术，用于制备仅有一种特定细胞类型的
细胞株。

常用于生物医学研究中，其中包括肿瘤学、免疫学研究等等。

细胞的感受态是指把转录因子的活性形式改变，使其响应环境刺激，
以调节其生化活性或特性。

感受态细胞制备的基本步骤是，首先收集需要制备的细胞株。

此外，设计环境因子，使细胞可以被富集于细胞培养液中，比如添加一
定量的表观遗传因子。

然后，将细胞培养液中的收集细胞用多种组合
方法，如离心法、细胞膜滤过法提纯细胞，最终得到所需的细胞株。

最后，移植所筛选出来的细胞株到环境中，使其进入感受态。

模
拟能够调节受体活性的外界刺激，对其进行诱导，使其进化到更加完
美的感受态细胞。

当准备好后，可以用于临床诊断、研究以及各种免
疫应答的研究等。

无论是医学上的准备，还是科学研究的准备，感受态细胞的制备
都是非常重要的。

人们可以通过改变细胞生长环境，调节外源基因活性，来改变细胞表达，以及形态和功能等，从而有效地控制细胞的生
长和发育。

感受态实验SOB溶液的配制(1000 ml用量):蛋白胨20 g酵母抽提物 5 gNaCl 0.585 gKCl 0.186 gH2O 加至1000 ml用之前向培养基中加入2M的Mg2+(1M MgSO4.7H2O + 1 M MgCl2·6H2O)，可在高压后直接加入或过滤除菌，1000 ml培养基中加入2 M的Mg2+ 10 ml.灭菌：SOB高压；Mg2+高压；滤膜高压。

无氨卞，干净LB固体培养基用于菌株划线。

LB液体培养基，用于预培养。

1.5ml离心管高压用于装感受态，约160个。

50ml 离心管高压,约4个。

TB滤膜过滤。

步骤:(1) 保存的JM109永久菌平板划线，37℃过夜。

(实验中用的是DH5α，培养约20h。

)(2)预培养：挑取单菌落，接种到5ml无氨卞LB试管液体培养基。

约16h, 使单菌落快速大量繁殖。

(3)取1ml接种于盛有100 ml SOB的250 ml小三角瓶中，37℃振动培养,约4h，使OD=0.4(600nm, ddH2O对照)，冰上放置10 min。

(4) 2500 rpm，4℃离心15 min(5) 用1/3体积冰冷TB溶液悬浮沉淀10 min。

(6) 2500，4℃离心15 min(7) 重复(5)，(6)步骤一次。

(8) 1/12.5体积冰冷TB溶液悬浮(50ml SOB加4mlTB。

)加DMSO至终浓度7%，约300μl ，轻轻吹打，冰上放置10 min。

(使DMSO进入细菌)。

(9) 用1.5 ml离心管分装成100 µl/管，液氮速冻，-80℃保存。