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口蹄疫病毒（FMDV）转基因植物可饲合成肽疫苗高中生物学选择性必修三介绍了基因工程在医药上的应用，利用转基因技术生产疫苗是其中之一。
口蹄疫病毒（FMDV）转基因植物可饲合成肽疫苗是一个很典型的实例。
口蹄疫灭活疫苗自诞生以来已使用70多年，实践证明灭活疫苗可以有效地限制口蹄疫的流行范围。
相比新型疫苗，口蹄疫灭活疫苗存在着免疫效果良好、生产工艺成熟等诸多优点。
但是随着实践经验的积累和研究的深入，口蹄疫灭活疫苗的缺点也逐渐为人们熟知。
第一，伴随着口蹄疫灭活疫苗的使用，对疫苗灭活是否彻底的争议一直在持续，有报道认为部分地区的口蹄疫流行是由口蹄疫疫苗中病毒灭活不彻底造成。
第二，口蹄疫灭活疫苗的生产过程中存在活病毒增殖以及对实验动物疫苗免疫后的抗病毒攻击实验，这些环节稍有不慎就有可能使病毒扩散从而造成口蹄疫的流行。
第三，口蹄疫病毒基因组结构简单因此非常容易变异，一旦发生变异，使用原来流行毒株制备的疫苗对变异毒株的保护能力就会下降。
基于上述原因，新型疫苗的研发势在必行。
口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的主要危害猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。
该病易感动物多，传播速度快，流行范围广，给世界造成了巨大经济损失，并严重制约着国内外养殖业健康发展。
随着转基因技术的不断发展，FMDV可饲疫苗的研究也取得了重大突破。
FMDV转基因植物可饲疫苗的研究成功，将为牛羊等草食动物的防治带来光明的前景。
1.FMDV转基因植物可饲疫苗可饲疫苗是通过把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合，将抗原基因导入植物细胞中，形成转基因植物，利用植物作为生物反应器大量表达外源蛋白作为疫苗，或将转基因植物直接加工饲喂动物使其获得免疫，是当前新型疫苗研究的热点之一。
口蹄疫植物可饲疫苗生产除此之外，可饲疫苗还常以苜蓿、番茄、马铃薯等为表达体系，使用安全性高，成本较低，免疫方法简便，为生产动物疫苗提供新思路，但由于动物个体的摄入量不同，免疫效果不易保障，仍需进行深入研究。
在猪、牛、羊养殖过程中，口蹄疫病是一种具有高传染性以及高危险性常见疾病，该病会对猪、牛、羊养殖户的整体经济利益造成很大负面影响。
目前，在猪、牛、羊养殖过程中口蹄疫病的治疗与防治方面已取得显著成绩，需要广大养殖户以及相关部门积极认识、学习以及掌握口蹄疫病相关防治技术，有效推进猪、牛、羊健康养殖的长远发展。
在猪、牛、羊的养殖过程中，如果卫生清理不彻底、环境管理不到位以及免洗消毒不到位，极易造成大量猪、牛、羊出现口蹄疫病。
另外，由于人民的生活水平和饮食卫生意识的提高，猪、牛、羊口蹄疫病已经成为当今的一个热点问题。
猪、牛、羊如果感染口蹄疫病，不仅会影响猪、牛、羊自身生产性能，还会导致动物出现大量死亡，这对养殖户造成很大经济损失。
因此，要使猪、牛、羊的实际养殖效益得到有效保障，必须有效加强对猪、牛、羊口蹄疫病防治。
一、猪牛羊口蹄疫病影响对于养殖，做好疫病防治极为重要，是保障养殖经济效益最大化、推动基层养殖产业发展的关键。
猪、牛、羊一旦爆发将会对猪、牛、羊健康造成严重影响，不仅会导致相应的养殖经济大受影响，更可能导致人传染口蹄疫病毒，也可能发生因染病死亡动物尸体处理不当而造成的大规模卫生安全事故。
1、猪口蹄疫病猪口蹄疫一般多发生在春季以及冬季，间接或者直接接触均可引起猪感染疾病。
该病对养猪业危害较大，不仅影响到整体养殖效益，还可能导致大批猪死亡，因此做好猪口蹄疫预防工作非常重要。
口蹄疫病毒可通过摄取，胚胎移植，吸入和外伤、人工授精及其他各种方式感染易感猪群，在这些感染途径中，前两者占比最重，而近距离非直接接触时，气源性传染最容易感染。
猪患口蹄疫病后，一般表现为趾间肿胀微红，然后出现站立不稳、水泡、食欲下降以及身体颤抖等表现。
该病的病种以四足和四蹄为多见，并伴随病程进展而出现不同程度的跛足。
感染猪的潜伏期通常为一星期，在此期间一般只会出现轻微的发烧，不易被发现，猪趾间脓包会破裂，有清澈或淡黄色的液体流淌出来。
动物医学进展,2008,29(4):65 69Pr ogress in Veterinary Medicine口蹄疫转基因植物可饲疫苗研究进展*吴国华,张 强*(中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州730046)摘 要:口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性热性高度接触性传染病,给畜牧业造成极大的经济损失,疫苗是预防和控制该病的有效方法。
近年来,转基因植物可饲疫苗由于其易于生产、成本低廉、使用方便和安全等诸多的优点成为口蹄疫新型疫苗的研究热点。
文章综述了口蹄疫转基因植物可饲疫苗的研究现状,介绍了其原理和方法,分析了其优缺点和改进方法,并对其应用前景进行了展望。
关键词:口蹄疫;转基因植物;可饲疫苗中图分类号:S852.659.6文献标识码:A文章编号:1007 5038(2008)04 0065 05目前,世界上主要应用灭活疫苗来控制口蹄疫(Fo ot and m outh disease,FMD),然而,用完整病毒粒子灭活疫苗控制FM D所引起的免疫保护具有血清型局限性,保护期短,且需要多次免疫。
而且灭活苗中可能存在灭活不完全的病毒粒子而成为新的疫源。
随着转基因技术日臻成熟,应用转基因植物制备口蹄疫疫苗的研究取得了可喜的进展,现就近年FM D转基因植物可饲疫苗的研究进展进行综述。
1 研究背景转基因植物技术突破了传统育种技术的局限,创造出许多具有抗逆、抗虫、高产、耐盐等优良性状的全新品种,被誉为第二次 绿色革命。
随着基因工程的发展,人们开始利用植物来生产药物和疫苗。
1990年,Cur tiss等首次在转基因烟草中表达出约占烟草蛋白0.02%的变异链球菌表面蛋白,但没有对其免疫原性作进一步的报道。
M ason H S等[1]提出了利用转基因植物生产可饲疫苗的概念。
随后的研究认为转基因植物疫苗对预防和消除某些疾病有广阔的应用前景。
利用转基因植物生产疫苗已受到高度重视,是当前新型疫苗研究的热点之一。
2 利用转基因植物生产可饲疫苗的原理和方法生产口蹄疫病毒(Foot and mo uth disease vi r us,FM DV)转基因可饲疫苗首先是分离要转化的目的基因,通过酶切、筛选得到重组质粒,进而构建表达载体并以一定的转化方法转入植物基因组中。
目前,主要有载体介导法、基因枪法和花粉管通道法等[2 6]3种方法。
其中载体介导法是最常用的方法,他有两种类型:由农杆菌(Ag robacter ium)T DNA 载体介导与植物基因组整合的稳定表达,其优点是能产生大量的转基因植物后代,能够产生多基因复合疫苗产品,通过选择调控元件使得外源基因能在特定的组织、器官中表达;以病毒为载体的瞬时表达,将抗原决定簇与植物病毒衣壳蛋白基因溶合,常用的植物病毒有烟草花叶病毒(T obacco mosaic vi rus,TM V)、豇豆花叶病毒(Cow pea mosaic virus, CPMV)、椰菜花叶病毒(Cauliflo w er mosaic virus, CaM V)、马铃薯X病毒(Potato X v irus,PXV)等,其优点是外源基因的表达量高。
转基因载体的构建对植物基因工程来说也是十分重要的。
构建载体时,需选择合适的调控元件以提高外源基因转录和翻译的水平,提高外源基因的表达量;还需选择有效的抗性基因和报告基因,以便筛选和检测转化株。
3 用于转基因植物可饲疫苗的FM DV基因FM DV属于小RNA病毒科(Picornav ir dae)口蹄疫病毒属(Ap hthov ir us)的成员,其基因组为单股正链RNA,约由8500个核苷酸组成。
基因组的基本结构是:V Pg 5!U TR(S po lyC IRES) L蛋白 结构蛋白P1(VP4 VP2 V P3 VP1) 非结构蛋白P2(2A2B2C) 非结构蛋白P3 3!U TR poly(A)。
目前用作转基因植物的FM DV基因主要是结构蛋白基因VP1、P1及非结构蛋白基因2A、3C。
VP1基因编码的蛋白位于病毒衣壳的表面,可诱导机体产生中和抗体。
P1基因编码口蹄疫的4种主要结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1),构成了病毒的抗原*收稿日期:2007 12 20基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)项目(2005CB523201);国家基础平台项目(2005DK A21205 3)作者简介:吴国华(1977-),男,江西赣州人,助理研究员,博士研究生,主要从事动物病毒分子免疫学研究。
*通讯作者位点。
P1上的抗原位点随病毒血清型的不同而有所不同,O型FM DV至少有5个中和性抗原位点:抗原位点1由VP1G H环(1133~1157)和C端200位~213位氨基酸的线性表位组成,是FMDV 最重要的抗原位点;抗原位点2位于病毒表面VP2的 B C环和 E B上;抗原位点3位于病毒粒子表面五重轴周围VP1的 B C环上;抗原位点4在VP3的 B结构上;抗原位点5位于VP1的G H环内。
2A基因编码的蛋白能够自我催化P1 2A同2C 的解离;3C基因编码的蛋白是病毒成熟过程中重要的蛋白酶之一,由它催化多聚蛋白的次级裂解。
将FM DV P12A基因和3C基因联合在植物中表达,蛋白酶3C可专一性地裂解P1产生VP0、VP3和VP4等成熟蛋白,它们进一步装配成的空衣壳可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫[7]。
4 研究概况4.1 转基因豇豆Usha R等[8]构建了CPMV两个基因组RNA的全长cDNA克隆,并将口蹄疫病毒VP1基因成功地插入S衣壳蛋白基因编码区中,重组质粒转录RNA,并用其以机械方式接种于豇豆植株。
10d后,接种过的植株显示与被野生型CPMV侵染植株不同的性状。
接种植株的叶提取物的电镜检测显示,存在聚集的CPMV状颗粒。
从被侵染的叶组织纯化出杂合的病毒粒子的Western blot分析表明,其保留了FMDV专一性环。
通过鉴定CPMV的分子结构,确定插入外源表位的正确位置,使插入结构中的环暴露于病毒粒子表面,从而可被迅速识别确保发生强免疫反应。
他们用这种杂合病毒粒子制备了用于豚鼠的实验疫苗并进行了免疫试验。
结果显示,能诱导豚鼠产生特异性免疫应答。
转基因豇豆表达的FMDV表面抗原能被FMDV阳性血清识别。
4.2 转基因苜蓿Wigdo rovitz A等[9]用表达FMDV VP1的转基因苜蓿口服免疫或非经肠道免疫小鼠产生了相似的病毒特异性免疫反应,用FM DV强毒进行攻毒试验,小鼠得到了完全的保护。
但转基因植物的表达量低是限制其应用的一个重要因素。
为了提高其表达量,Dus Santos M J等[10]用转基因苜蓿表达了FM DV VP1上135位~160位的氨基酸与DUS融合基因,表达量得到了显著的提高。
用表达的融合蛋白免疫小鼠,产生了针对FM DV VP1上135位~ 160位的合成多肽、结构蛋白VP1以及完整病毒粒子的特异性抗体,并可保护小鼠抵抗病毒的攻击。
随后,Dus Santos M J等[11]又用表达FMDV P1全长和3C蛋白酶的转基因苜蓿,非经肠道免疫小鼠产生了免疫反应,用FM DV强毒进行攻毒试验,小鼠保护率可达100%。
4.3 转基因烟草Wigdo roriz A等[3]将FMD结构蛋白V P1基因成功地插入到TM V lJ1基因组中或置于CaM V 35S启动子控制下,重组的T MV和双元载体pRoK1VPIa接种本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)。
Wester n blo t分析表明,接种4d后就可以在叶子提取物中检测出VP1蛋白,接种后7 d达到其含量的最高峰,粗略估计每克新鲜叶子中含有VP1结构蛋白50g~150g。
用叶子提取物对豚鼠进行免疫学试验,结果显示能诱导动物产生特异性免疫应答。
经攻毒试验,小鼠得到了完全的保护。
Li Y等[12]构建烟草叶绿体表达载体pT RVP1,通过基因枪法转入烟草叶绿体基因组中,免疫印迹和酶联免疫定量检测表明,VP1基因在烟草叶绿体中得到表达,占可溶性总蛋白的2%~ 3%,表明植物叶绿体是一个高效表达重组抗原的表达系统。
H uang Y等[13]将VP1G H环(140位~ 160位)的21个氨基酸(VP21)抗原插入到乙型肝炎病毒核心抗原(H epatitis B cor e antigen,H BcA g)基因内部,构建植物表达载体pBI121,然后转化烟草,免疫显微观察表明,重组融合蛋白H BcVP1在转基因烟草叶片中能形成一种病毒样颗粒(超低板)的结构。
用叶子提取物对小鼠进行腹腔接种免疫,发现产生抗H BcAg和口蹄疫病毒VP1的特异性抗体。
攻毒后免疫小鼠能得到高度保护。
4.4 转基因拟南芥1998年,Carrillo C等[2]将口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因插入拟南芥双元载体pRokl,构建重组pRoklVP1,使该基因在拟南芥中表达。
经试验证实,其产生的子代植株中含有VP1基因,将转基因拟南芥的提取物0.5mL与适量弗氏不完全佐剂混合。
分别于第1天、21天和35天腹膜注射60日龄~90日龄Balb/c雄性小鼠,在最后一次注射后10d检测,发现试验鼠血清特异性抗体水平升高,经口蹄疫强毒攻击后,用表达了VP1的转基因植物提取物免疫的14只小鼠全部得到保护。
这是用转基因植物表达病毒抗原免疫动物后获得全部保护的第一篇报道。
4.5 转基因马铃薯Carr illo C等[5]利用CaM V35S单/双启动子在马铃薯中成功地表达了口蹄疫病毒VP1基因,免疫动物后能引起特异性抗体应答并能保护动物抵抗强毒的攻击,并证明不同启动子在马铃薯中的表达水66动物医学进展 2008年 第29卷 第4期(总第176期)平没有明显差异。
李昌等[14]应用基因枪法将携带有FM DV P1全长基因的质粒pBI131SP1导入马铃薯茎段,通过在抗性培养基上严格筛选,获得了马铃薯再生植株。
PCR检测及PCR Southern杂交分析表明,已成功地将目的基因导入马铃薯基因组中。
李昌等[15]又将自主克隆的FM DV P1全长基因构建到植物表达栽体pB1131上,通过农杆菌介导法转入马铃薯,经PCR及Southern杂交等方法,证明P1基因已整合到马铃薯染色体基因组中,为进一步利用转基因植物生产FM D疫苗奠定了基础。
申慧峰[16]以马铃薯块茎特异性表达启动子patatin构建了口蹄疫病毒表面抗原融合霍乱毒素B亚基(Cho ler a tox in B subunit,CT B)蛋白编码基因CT B VPl的植物双元表达载体pBICVP,以农杆菌介导转化马铃薯,获得PCR检测的转基因植株。
