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单克隆抗体制备的主要技术

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单克隆抗体制备的主要技术

单克隆抗体制备的主要技术

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单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种特殊的抗体，它们可以特异性地识别抗原，并且具有极高的特异性和稳定性。它们已经在临床治疗和诊断方面发挥了重要作用，因此单克隆抗体制备技术已成为生物医学研究的重要手段。

一、单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理是将一种特定的抗原分子和一种抗原特异性的抗体分子连接起来，从而产生一种特定的单克隆抗体。这种联合物可以由一种具有抗原特异性的单克隆抗体分子或多克隆抗体分子所表示。

单克隆抗体制备的基本过程可分为四个步骤：选择抗原；制备抗原；选择和培养单克隆抗体产生细胞；制备和纯化单克隆抗体。

1、选择抗原

在进行单克隆抗体制备时，首先必须选择一种特定的抗原，以便于产生特异性的单克隆抗体。常用的抗原来源有蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白和合成化学物质。

2、制备抗原

根据所选用的抗原，可采用不同的方法对其进行制备。例如，蛋白质通常可以采用蛋白质表达或免疫原制备方法；多肽可以采用合成方法或者从天然蛋白质中分离出来；核酸可以采用合成方法或者从样品中分离出来；糖蛋白可以采用表达方法或者从天然蛋白质中分离出来；而合成化学物质可以直接合成。

3、选择和培养单克隆抗体产生细胞

在单克隆抗体制备中，必须使用能够产生特异性单克隆抗体的产生细胞。目前常用的单克隆抗体产生细胞包括B细胞、T细胞和流感株融合细胞。在这些产生细胞中，B细胞是最常用的，因为它能够快速、有效地产生大量的特异性单克隆抗体。

4、制备和纯化单克隆抗体

当B细胞产生了足够数量的单克隆抗体之后，就可以采用不同的方法将它们制备和纯化出来。常用的方法包括浸出法、寡核苷酸酶切法、蛋白酶浸出法、杂交法和Ion-exchange chromatography。这些方法可以帮助我们得到高度纯化的单克隆抗体。

二、单克隆抗体制备的优势

单克隆抗体制备是一种高效、可靠的方法，它可以用来高通量地产生大量特异性的单克隆抗体。它能够快速、有效地产生高度特异性的单克隆抗体，并且有一定的重复性。此外，它还具有低成本、易于扩增和保存的优势。

三、单克隆抗体制备的应用

由于它所带来的优势，单克隆抗体制备已成为生物医学领域中一个重要的手段。它已广泛应用于临床诊断和药物开发领域，并将在未来发挥重要作用。例如，mAb可用于诊断和监测诸如乙肝、HIV和风疹等传染性疾病；mAb也可以作为药物来进行临床试验，如mAb-IL-2（Interleukin-2）和mAb-TNF-α （Tumor Necrosis Factor-alpha）。此外，mAb还可以应用于新药开发中，如mAb-EGFR （Epidermal Growth Factor Receptor）、mAb-VEGFR （Vascular Endothelial

Growth Factor Receptor）和mAb-CD20 （Cluster of Differentiation 20）。

因此，单克隆抗体制备是一个重要而有效的工具，可用于诊断、监测和新药开发中。它将成为当今生物医学领域中不可或缺的一部分。

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单克隆抗体制备技术.

单克隆抗体制备技术.

单克隆抗体制备技术

单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop

第一章: 小鼠免疫

第二章: 细胞融合

第三章: 细胞建株

第四章: 细胞株鉴定

第五章: 腹水制备

第六章: 抗体纯化和鉴定(略

第一章. 小鼠免疫(BALB/c

小鼠免疫是单抗制备的关键一环, 质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。

一. 小鼠免疫分两程方案:根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:

1. 短程免疫方案:

第一次: 1d 100ug(可溶性Ag+等体积完全佐剂. 腹腔注射. 0.4ml/只

第二次: 7d 100ug+等体积不完全佐剂腹腔注射. 0.4ml/只

第三次: 12d 50ug IV 0.3ml/只

(强化 第四次: 15d 20ug IV 0.3ml/只

第17 d~24d内融合

2长程免疫方案:

第一次: 1d 100ug+等体积完全佐剂腹腔注射(IP0.4ml/只

第二次: 14d 100ug+等体积不完全佐剂IP 0.4ml/只

第三次: 21d 100ug IP 或IV 0.4ml/只

第四次: 25d 50ug IV 0.3ml/只

(强化 第五次: 28d 20ug IV 0.3ml/只

第30d~37d内融合.

注意:a.在融合前(即加强免疫前 必须测定免疫鼠血清滴度, 短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1:32000,方可做融合.b. 免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量。

二．小鼠免疫质控标准

1．免疫鼠血清滴度短程≥1：8000，长程≥1：32000；

2．小鼠免疫后需在一周内做完融合；

3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。

免疫鼠选择：免疫种类为:balb/c小鼠；性别. 雌性佳；大小：6-7周龄：体重：20g;

健壮. 活泼。

第二章．细胞融合

一．融合前准备

1．脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏，并制成单个脾细胞悬液，每只鼠的脾细胞约1～3亿。在制备过程中严格保证无菌。制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。

单克隆抗体制备流程

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备

(一) 免疫方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

初次免疫 1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)

↓ 2～3周后

第二次免疫 1×10７／0.5ml ip

↓ 3周后

加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)

↓

取脾融合

2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│ (一般0.8～1ml 0.2ml／点)

↓3周后

第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

单克隆抗体制备的杂交瘤技术

单克隆抗体制备的杂交瘤技术

单克隆抗体制备的杂交瘤技术

XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)

一、实验目的：1.掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。

2.能运用杂交瘤技术来制备自己的单克隆抗体。

二、实验原理：（一）动物免疫

动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗

原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，

相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大

量产生专一的B淋巴细胞。

（二）细胞融合

B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；

而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。

脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官,取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合

后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及

脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交

瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。（三）杂交瘤细胞的筛选

在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT养基

中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途

径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸

还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine

kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地

制备单克隆抗体的技术要点

制备单克隆抗体的技术要点

制备单克隆抗体的技术要点

1． 交瘤技术的技术流程

如图4-1所示。

图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程

2． 技术要点

1） 免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系

Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

2） 骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3） 细胞融合 融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。1000rpm离心10min。最后加含20%小牛血清的HAT培养液。将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。

4） 阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。

5） 克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。

（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。