微生物发酵生产脂肪酶的研究进展

微生物发酵生产脂肪酶的研究进展脂肪酶是一种重要的生物催化剂，具有在水相中催化脂肪水解的作用，可以将脂肪分解为甘油和脂肪酸。

脂肪酶在食品工业、生物柴油生产、生物洗涤剂等领域有着广泛的应用。

传统上，脂肪酶是通过动植物组织提取或贸易合成的方式获得，然而这些方法存在生产成本高、提取困难、致命因素生物的依赖问题。

为了解决这些问题，越来越多的研究者将目光投向了微生物发酵生产脂肪酶的领域。

本文将从微生物的选择、发酵条件、脂肪酶的纯化和应用四个方面探讨微生物发酵生产脂肪酶的研究进展。

一、微生物的选择微生物是生产脂肪酶的理想来源，因为它们具有快速生长、易于操作等优点。

目前，发现了许多产脂肪酶效率高的微生物，如放线菌、酵母菌、细菌等。

真菌是脂肪酶的主要来源之一，如曲霉、木霉等，它们能够在较宽的PH范围和温度范围内生长，并且对底物适应性较强。

细菌也是脂肪酶的重要产生菌株，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，它们具有高生长速率，易于遗传改造，并能够在不同的环境中生存。

微生物的选择对脂肪酶的高效生产至关重要。

二、发酵条件为了实现高效的脂肪酶生产，科研人员需要优化微生物的发酵条件。

发酵条件包括培养基的配方、培养基的初始PH值、培养基的初始温度、发酵时间等参数。

不同的微生物对这些参数有不同的要求，因此需要根据具体的微生物株系进行优化。

以大肠杆菌为例，一些研究表明，葡萄糖作为碳源、酵母粉作为氮源、微量元素的添加等都对脂肪酶的产量有显著影响。

对于真菌来说，培养基的初始PH值和温度也是影响因素，通常选择PH为5.5-6.0和25-30℃左右的条件进行培养。

通过合理的发酵条件优化，可以提高脂肪酶的产量和活力。

三、脂肪酶的纯化在微生物发酵获得的发酵液中，脂肪酶通常与其它蛋白质、多糖等杂质混合在一起，因此需要进行脂肪酶的纯化。

常用的脂肪酶纯化方法包括离心、超滤、层析等技术。

离心用于去除微生物细胞、超滤用于除去大分子杂质、层析则可以根据脂肪酶的大小、电荷、亲和性等特性进行分离和纯化。

脂肪酶的应用进展综述09生物技术0902021040 陈莹莹摘要：脂肪酶被认为是工业中很重要的一利酶。

本文概述了当前研究中广泛使用的脂肪酶及其固定化产品的应用途径, 包括在食品加工、饲料、纺织、医药、生物柴油和传感器等领域中的应用。

脂肪酶应用的主要障碍是其成本高。

但技术进步尤其是基因技术的发展有望使成本降低, 脂肪酶在药物合成中的应用在本文中也作了展望。

关键词：脂肪酶；性质；生产；来源，应用脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。

在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。

脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。

一、脂肪酶的来源脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。

由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

二、脂肪酶的性质脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。

China Brewing2019Vol.38No.8Serial No.330白酒化学成分的分析研究表明，白酒中约2%的呈香呈味物质是决定酒体质量的重要物质。

在香味物质中，酯类成分是其中的重要组成部分。

而酯类物质的合成主要是通过酯化反应产生，其实质就是酸和醇反应，脱水而生成酯，此反应主要在参与白酒酿造微生物体内温和的环境中进行，且这一过程需有酯化酶的参与完成[1]。

酯化酶能催化酯的合成与酯的分解，因此在白酒行业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶[2]。

浓香型白酒在中国白酒市场上处于主导地位，产、销量均占70%左右[3]。

浓香型白酒的酿造采取固态、厌氧的半自然发酵生产，这一生产过程需生产环境、曲药、窖泥内众多微生物的共同参与和相互配合。

浓香型白酒的呈香呈味物质主要包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯[4]，在窖内发酵过程中，酯类物质生成周期较长[5]，而利用酶法合成酯类物质具有反应条件温和、转化率高、副产物少等优点[6]，所以在多粮浓香型白酒酿造中酯化酶有着举足轻重的作用，同时，在食品增香领域酯化酶也有较广泛的应用[7-8]。

本文概述微生物发酵产酯化酶在浓香型白酒酿造生产中包括在酯化大曲、黄水及酿造发酵过程中的研究应用情况，分析酯化酶对于提高浓香型白酒出酒率、优质酒率及减少用曲量等方面的积极效果，为酯化酶在浓香型白酒品质提升中的应用研究总结经验及今后研究提供方向。

1酯化酶的概述1.1酯化酶的定义酯化酶是一类催化合成低级脂肪酸酯的酶类的总称，不是酶学上的专业术语。

在白酒中酯化酶主要是指脂肪酶、酯合成酶、磷酸酯酶的统称。

1.2酯化酶的来源及作用通过研究发现，酵母、霉菌、细菌均可产生酯化酶，目前在白酒酿酒过程中已经发现红曲霉、根霉中许多菌株有微生物发酵产酯化酶在浓香型白酒品质提升中研究进展罗小叶1,2,邱树毅1,2,王晓丹1,2*(1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;2.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025)摘要：该文概述酯化酶的特性，酯化酶在酯类合成中的重要作用，浓香型白酒酿造生产中微生物发酵产酯化酶在酯化大曲、黄水及酿造发酵过程中的研究应用情况。

DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025090引用格式:彭燕鸿,苏爱秋,黄伟文,等.微生物嗜热脂肪酶研究进展[J].食品与发酵工业,2021,47(6):289-294.PENG Yan-hong,SU Aiqiu,HUANG Weiwen,et al.Research progress on microbial thermophilic lipase[J].Food and Fermentation Indus-tries,2021,47(6):289-294.微生物嗜热脂肪酶研究进展彭燕鸿1,苏爱秋1,黄伟文2,蓝素桂1,杨天云2,谭强1∗1(广西中医药大学药学院,广西南宁,530000)2(广西和桂集团有限公司,广西南宁,530001)摘㊀要㊀微生物发酵制备脂肪酶是工业化生产脂肪酶的主要途径㊂由于工业化生产对脂肪酶的热稳定要求较高,野生菌来源的嗜热脂肪酶已无法满足工业化的高需求㊂来源于微生物的脂肪酶在工业中的应用逐渐成为生物工程研究的热点,构建高表达且酶表征好的产酶菌株是目前研究的重点㊂因此,该文就近年来嗜热脂肪酶产生菌及其表征㊁异源表达系统㊁结构改造㊁分离纯化和固定化等方面研究进展进行综述,重点阐述突出的成果,为该方向联用多个分子生物技术的研究提供理论参考和方法借鉴㊂关键词㊀嗜热脂肪酶;异源表达;分离纯化;固定化第一作者:硕士研究生(谭强教授为通讯作者,E-mail:Tan20111102@)㊀㊀基金项目:广西重点研发计划(桂科AB20159015)收稿日期:2020-07-22,改回日期:2020-09-08㊀㊀脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolases,EC3.1.1.3)是一类可高效催化三酰甘油酯水解的酶,可催化油脂水解生成脂肪酸㊁甘油和甘油单酯或二酯,可进行催化酯化㊁酯交换反应㊁醇解反应和酸解等反应㊂脂肪酶广泛存在于动物㊁植物和微生物体内㊂微生物脂肪酶早在20世纪初已被发现,迄今已发现超过100种产生脂肪酶的微生物㊂通过微生物发酵法来制备脂肪酶,因受环境影响小㊁生产周期短㊁效率高㊁成本低等优势,已成为工业化生产脂肪酶的主要途径[1]㊂脂肪酶用途广泛㊂在食品工业中,可以改善食品的风味,也可以合成高附加值的脂类产品㊂在造纸工业中,可以用于废纸脱墨㊂在洗涤剂工业中,可以提高去垢力,改善洗涤效果㊂在燃料工业中,可以将动植物油转化成可再生性柴油燃料㊂在生物催化剂中,用于制备稳定㊁可回收的纳米催化剂和磁性生物催化剂以及辛酸辛酯的合成㊂另外在生物医学科学以及日常清洁用品方面都有巨大的商业价值[2-3]㊂工业生产对脂肪酶的热稳定性要求高,而天然脂肪酶的热稳定性难以满足生产要求㊂嗜热脂肪酶是一类在高温下仍具有催化活性的脂肪酶(一般最适作用温度大于40ħ),可满足工业化运用要求㊂嗜热脂肪酶主要来源于极端条件下的嗜热微生物㊂而通过对嗜热脂肪酶进行分子结构改造,利用定向突变技术引入二硫键等方法可进一步提高酶的热稳定性㊂1㊀酶产生菌及表征的研究进展酶表达水平是衡量酶产生菌的酶生产能力指标㊂酶的最适pH 值和最适温度是指在一定条件下,酶呈现最大活力时的pH 值和温度㊂热稳定性一般以酶在特定温度条件下,维持一定时间后的剩余酶活力来表示㊂至今报道的嗜热脂肪酶产生菌及其表达水平㊁最适pH 值和温度以及热稳定性见表1㊂表1㊀耐酸/耐碱嗜热脂肪酶Table 1㊀Acid /alkali resistant thermophilic lipase产生菌表达水平/(U㊃mL -1)最适作用pH温度/ħ热稳定性文献克雷伯氏菌B-369.24.06060ħ,70min,剩余酶活力80%[4]伯克氏菌NJY-1-350.5 4.06565ħ,60min,剩余酶活力90%[5]不动杆菌Lip-5546.15.05575ħ,120min,剩余酶活力10%[6]不动杆菌Lip-43106.5 5.04575ħ,120min,剩余酶活力50%[7]液化沙雷氏菌LZ-24 3.288.04545ħ,30min,剩余酶活力96%[8]芽孢杆菌FS140313.08.05560ħ,60min,剩余酶活力70%[9]假单胞菌Lz119.18.54050ħ,24h,剩余酶活力100%[10]荧光假单胞菌NS2W 69.79.05560ħ,120min,剩余酶活力70%[11]嗜麦芽窄食单胞菌N2425.69.05560ħ,60min,剩余酶活力100%[12]类产碱假单胞菌F33126.410.05070ħ,80min,剩余酶活力50%[13]耐酸嗜热脂肪酶主要来源于细菌(克雷伯氏菌㊁伯克氏菌㊁不动杆菌等),酶表达水平为9.2~106.5U /mL,最适pH 值和温度分别为pH 4.0~7.0和45~80ħ㊂这些产生菌中,不动杆菌Lip-43具有最高表达水平的酶表达量(106.5U /mL)[7]㊂来源于伯克氏NJY-1-3和克雷伯氏菌B-36脂肪酶有最低的最适pH 值为4.0,而来源于伯克氏菌NJY-1-3脂肪酶有最高的最适温度65ħ[4-5,10]㊂另外,来源于不动杆菌Lip-43脂肪酶具有最高的热稳定性(75ħ条件下维持120min,仍保持55%的剩余酶活力),适合于高温环境下的生产[7]㊂耐碱嗜热脂肪酶也主要来源于细菌,包括假单胞菌㊁液化沙雷氏菌和芽孢杆菌等,酶表达水平为3.8~120U /mL,最适pH 和温度分别为8.0~9.0和40~55ħ㊂这些产生菌中,荧光假单胞菌NS2W 具有最高的酶表达量(69.7U /mL)[11]㊂类产碱假单胞菌F331脂肪酶有最高的最适pH 值为10[13],而来源于嗜麦芽窄食单胞菌N24㊁荧光假单胞菌NS2W 和芽孢杆菌FS1403脂肪酶的最适温度高达55ħ[9,11-12]㊂来源于假单胞菌Lz1脂肪酶具有最好的热稳定性(50ħ条件下维持24h,仍保持100%的剩余酶活力)[10],适合要求温度较高的生产条件㊂野生菌来源脂肪酶的酶表达水平普遍不高,表达量最高的不动杆菌Lip-43也远远达不到工业化生产的要求,其热稳定性也较低㊂由此可见,野生菌来源的脂肪酶须通过进一步的改造才能满足工业化生产㊂2㊀酶异源表达的研究进展通过构建重组工程菌异源高效表达嗜热脂肪酶,已经成为酶工业化生产的主要方法㊂基因重组菌的构建,所涉及酶基因来源和表达系统(包括宿主㊁质粒和启动子等)㊁表达水平以及酶表征等最近研究进展见表2㊂表2㊀嗜热脂肪酶异源表达Table 2㊀Heterologous expression of thermophilic lipase基因来源菌株GenBank 登录号宿主质粒启动子表达水平/(U㊃mL -1)最适作用pH 温度/ħ文献疏绵状嗜热丝孢菌-GS115pPIC9KAOX124522.67.0-[14]-GS115pAO815AOX1875.09.060[15]-SH-2pUC119Pgla A 187.08.060[16]高温烷烃地芽孢杆菌YN 83939851DH5αpCYTEXP1λ5837.59.560~65[17]高温烷烃地芽孢杆菌Toshki AY095261 E.colipET-15b T7350.08.065[18]芽孢杆菌BI-19KX184811BL21pET-30(a +)-50.59.070[19]土杆菌T1AY260764BL21pGEX-4T1tac 17.09.065[20]嗜热新萨托菌P1KF640700.1GS115pPIC9K -1900.0 5.060[21]嗜热踝节菌JF414585.1ZJU-02pUC18cbh1375.09.560[22]荧光假单胞菌BJ-10KY939609BL21pET-22b(+)-265.48.645[23]铜绿假单胞菌PL-3DQ240922DB104pWB980P4315.47.555[24]南极假丝酵母Y-7954Z30645.1KM71H pPICZαA pAOX1179.28.040[25]嗜热脂肪酶异源表达所涉及的基因来源于细菌(包括芽孢杆菌㊁假单胞菌和酵母菌等)和真菌(嗜热新萨托菌㊁疏棉状嗜热丝胞菌和嗜热踝节菌等)㊂表达系统中常用宿主有BL21和GS115等,常用质粒有pET 类和pPIC9K 等,常用启动子有T7和AOX1等㊂在这些构建的工程菌中,基因来源于疏棉状丝胞菌㊁以GS115-pPIC9K-AOX1为表达系统构建工程菌GS115/pTL1,可获得最高酶表达量24522.6U /mL [14]㊂关于耐酸嗜热脂肪酶的异源表达,以来源于嗜热新萨托菌P1(基因编号KF640700.1)酶基因㊁GS115-pPIC9K 为表达系统构建重组毕赤酵母工程菌GS115/pET22B (+)-Lip09,经过高密度发酵可获得1900U /mL 的酶表达量[21]㊂另外,将来源于高温烷烃地芽孢杆菌YN 的耐碱嗜热脂肪酶基因(基因编号83939851),以DH5α-pCYTEXP1-λ为表达系统,构建重组菌pCYTEX-LipA-6xhis,可获得5837.5U /mL 的酶表达量[17]㊂基因来源以及宿主㊁质粒与启动子等因素的选择对嗜热脂肪酶表达量有很大影响,可以通过对上述因素的进一步筛选(例如增加产量的强启动子)提高异源重组工程菌的酶表达量㊂3㊀酶分子结构改造的研究进展通过对酶分子的结构改造,可以显著提高酶的稳定性(即提高酶活力半衰期t 1/2和酶分子熔解温度T m ),或降低酶分子的底物特异性K m,提高酶的催化效率㊂提高嗜热脂肪酶的热稳定性方式有很多,包括定向进化,定点突变等㊂AKBULUT 等[26]通过定向进化使短小芽孢杆菌脂肪酶基因在50ħ的t 1/2提高了9倍,PENG [27]通过多点饱和突变的南极假丝酵母脂肪酶得到了更好的嗜热性,在60ħ的t 1/2提高了14倍㊂而利用定点突变技术在酶分子结构上引入二硫键,提高酶分子的热稳定性,是目前最主要的研究方向㊂二硫键可稳定蛋白质肽链空间结构,往往使蛋白质具有较好的热稳定性㊂研究表明二硫键不仅会使脂肪酶的结构更稳定,嗜热脂肪酶分子中的二硫键数目往往要多于不嗜热的脂肪酶[28]㊂另外,通过定点突变等技术改造酶分子与底物的结合部位,提高酶蛋白质与底物结合的稳定性,可以显著地提高酶分子对底物的亲和力,降低K m,提高催化效率㊂嗜热脂肪酶催化活性中心是在蛋白质分子结构中由丝氨酸残基㊁组氨酸残基和天冬氨酸残基组成的 催化三联体 [34]㊂突变位点的选择可利用Disulfide by design 软件进行预测和筛选拟二硫键㊂由表3可知,环孢青霉37通过定点突变获得单突变子T251C,t 1/2有着12.8倍升高[29]㊂南极假丝酵母通过突变后获得双突变子A162C /K308C,T m 提高了8.5ħ[33]㊂华根霉基因突变后的三突变子K64N /K68T /T201C,其K m 大幅下降了71%,显著地提高酶分子对底物的亲和性[32]㊂总之,通过定点突变技术,对酶分子关键位点进行突变改造,可以显著的提高嗜热脂肪酶分子的稳定性或改善酶分子与底物的亲和力,提高催化效率㊂因此,通过定向突变技术,结合其他分子改造技术,将是未来提高嗜热脂肪酶热稳定性的方法与手段㊂表3㊀脂肪酶结构定点突变改造Table 3㊀Site directed mutagenesis of lipase基因来源宿主质粒突变子t 1/2/T m /K m文献米黑根霉GS115pPIC9K P96C /L106C 60ħ,t 1/2提高5倍;最适温度提高了3ħ[29]华根霉GS115pPIC9K F95C /F214CK64N /K68T /T201C D190V 60ħ,t 1/2提高11倍;T m 提高了7ħ60ħ,t 1/2提高了1.5倍;K m 下降71%65ħ,t 1/2提高了1倍,最适温度提高了5ħ,K m 下降了23.3%[30][31][32]环孢青霉37GS115pPIC9K T251C 35ħ,t 1/2提高12.8倍,最适温度提高了5ħ[28]南极假丝酵母BL21pET22A162C /K308C50ħ,t 1/2提高了4.5倍;60ħ,T m 提高了8.5ħ[33]4㊀分离纯化与固定化研究的研究进展经分离纯化后可获得高纯度的脂肪酶,为进一步研究酶分子结构提供前提基础㊂酶分子的分离纯化就是将酶分子溶解在溶剂中并把杂质去除的过程㊂由于游离态酶分子相对不稳定,容易受到环境pH㊁温度㊁金属离子㊁抑制剂㊁接触介质性质等因素影响而失活,因此纯化方法对酶活影响十分显著㊂酶分离纯化的目的就是为获得高比活力和酶活力回收率㊂分离纯化步骤多可除去更多杂质,获得高比活力,但是由于步骤繁琐㊁时间长等原因可导致酶活力损失大,造成酶活力回收率低㊂对嗜热脂肪酶的纯化总结如表4所示㊂表4㊀嗜热脂肪酶的纯化Table 4㊀Purification of thermophilic lipase来源菌株分子质量/kDa纯化方法与步骤比活力/(U㊃mg -1)酶活回收率/%最适温度/ħ文献高温烷烃地芽孢杆菌YN 43①固定金属离子亲和层析②凝胶过滤柱层析3586.0 2.160~65[35]枯草芽孢杆菌NS845①DEAE-Toyopearl 650M 层析②Sephadex G-75柱层析2870.016.060[36]嗜热细菌X51428Ni-NTA 琼脂糖亲和层析2069.264.170[37]类芽孢杆菌CS061145镍柱亲和层析456.357.550[38]嗜热芽孢杆菌RSJ-137①硫酸铵沉淀②Q-Sepharose 离子交换层析③Sephacryl S-200SF 凝胶过滤层析428.119.750[39]黑曲霉NCIM120732.2Sephacryl-100层析1373.054.050[40]黑曲霉F04443镍柱亲和层析1370.012.045[41]黑曲霉AN051241①硫酸铵沉淀②离子交换柱层析③凝胶过滤柱层析1262.322.150[42]㊀㊀由表4可知,当前嗜热脂肪酶主要通过硫酸铵沉淀并结合层析柱等手段进行分离纯化㊂由于嗜热脂肪酶的分子质量为25~60kDa,这限定了分离载体的孔径大小㊂对嗜热脂肪酶进行分离纯化后,酶比活力为31.0~3586.0U /mg,酶活力回收率2.1%~64.1%㊂高温烷烃地芽孢杆菌YN 经固定金属离子亲和层析和凝胶过滤后,可获得最高的酶比活力(3586.0U /mg),但其酶活力损失较大,酶活力回收率只有2.1%[35]㊂嗜热细菌X514通过Ni 离子亲和层析纯化后,可得到最高的酶活力回收率(64.1%)[37],酶比活力(2069.2U /mg)也较高㊂黑曲霉NCIM 1207通过Sephacryl-100层析法纯化后,可得到着较高的酶比活力(1373.0U /mg)和较高的酶活力回收率(54%)[40]㊂固定化酶技术是用物理或化学手段将游离的酶在一定范围内限制起来,酶分子易分离且可回收使用的一种技术㊂酶作为生物催化剂具有价格昂贵㊁寿命有限,而酶固定化技术可以使酶重复使用,增加酶的操作稳定性㊂固定化载体一般分为无机载体材料㊁高分子载体材料和复合载体材料㊂酶分子与载体的固定化过程可造成酶活力损失的原因有多种,包括载体与酶分子活力中心关键氨基酸的共价结合与空间位阻等因素,导致获得较低的酶活力回收率㊂而造成固定化酶使用过程中酶活力损失的原因有很多,例如酶本身失活㊁酶从载体上脱落㊁固定化载体破碎或溶解等都可能会造成酶活力损失㊂对嗜热脂肪酶的固定化总结见表5㊂表5㊀嗜热脂肪酶的固定化Table5㊀Immobilization of thermophilic lipase酶来源载体比活力/(U㊃g-1)活力回收率/%操作稳定性固定化酶最适作用pH温度/ħ文献凝结芽孢杆菌BTS-3硅胶 1.560重复8次,酶活力剩余80%8.555[43]短小芽胞杆菌功能化纳米孔活性炭382--7.050[44]嗜热芽孢杆菌BTL2疏水性树脂--重复10次,酶活力剩余100%7.045[45]土杆菌硅胶-74.7重复4次,酶活力剩余40.8%9.555[46]红色沙雷氏菌Nehal-mou聚乙烯醇/硼酸/淀粉/碳酸钙-73.5重复10次,酶活力剩余80%8.540[47]蓝铜绿假单胞菌戊二醛-68.7重复10次,酶活力剩余90%9.045[48]土壤霉菌A7高岭土/海藻酸钠3072.2重复5次,酶活力剩余51.6%7.540[49]南极假丝酵母硅藻土187-重复6次,酶活力剩余20%8.040[50]㊀㊀由表5可知,嗜热脂肪酶固定化一般采用物理吸附方法,通过载体阴阳离子交换和吸附作用进行固定化㊂固定化载体主要包括硅胶㊁功能化纳米孔活性炭㊁疏水树脂㊁聚乙烯醇/硼酸/淀粉/碳酸钙㊁高岭土/海藻酸钠和硅藻土等㊂红色沙雷氏菌来源的嗜热脂肪酶通过与聚乙烯醇/硼酸/淀粉/碳酸钙固定化后固定化酶最佳温度从40ħ上升到65ħ,并经过10次催化反应重复后,酶活力依然保持80%,固定化技术显著提高了酶的嗜热性和稳定性[48]㊂土杆菌来源的酶用物理吸附的方式固定在硅胶上,获得最高的活力回收率(74.7%),但经催化反应4次重复后,酶活力仅剩余40.8%[47]㊂这是由于酶分子与载体的结合不够紧密,反应过程中酶分子容易从载体脱落而损失,造成操作稳定性低㊂蓝铜绿假单胞菌来源的酶与戊二醛交联固定化后,固定化酶呈现较好的酶活力回收率(68.7%)和操作稳定性,经过10个循环的催化反应后,酶活仍剩余90%[49]㊂嗜热芽孢杆菌BTL2通过疏水性树脂固定化并经过10次重复催化后,酶活力仍然保持100%[46]㊂因此,通过选择合适的固定化载体,运用合适的固定化技术,可以获得操作稳定性高以及比活力高的固定化酶㊂固定化嗜热脂肪酶提高了酶的操作稳定性,可在催化反应中重复使用性,这是实现酶工业化应用的主要途径㊂5㊀展望近年来嗜热脂肪酶在工业中的应用越来越广泛,野生菌来源的嗜热脂肪酶在表达量㊁热稳定性与催化效率等方面难于满足工业化需求㊂通过构建基因工程菌异源表达和酶分子结构改造等分子生物技术进行改良,可以提高酶表达水平和热稳定性㊂酶的改造技术已成为生物工程研究的热点,然而使用单一方法改造后往往达不到理想的效果㊂国内外越来越多的研究表明,异源表达系统㊁定点突变位点㊁纯化与固定化方式等方法对脂肪酶活力和热稳定性等都有影响㊂因此,谨慎地选择最优的组合方案尤为重要㊂为获得理想高产的嗜热脂肪酶,未来的方向应进行多方面综合考虑并结合多种方法进行研究,使嗜热脂肪酶在工业化应用中具有更好的发展前景㊂参考文献[1]㊀徐锁玉.生物技术在脂肪酶生产中的应用[J].生物化工,2018,4(6):120-122.XU 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微生物发酵生产脂肪酶的研究进展微生物发酵生产脂肪酶是一种重要的工业方法，用于生产脂肪酸和甘油等化学品。

在过去的几十年中，研究人员已经取得了一系列关于微生物发酵生产脂肪酶的重要进展。

本文将介绍一些最新的研究成果。

目前，最常用的微生物发酵生产脂肪酶的方法是使用真菌和细菌。

真菌主要包括浅拟青霉菌和乳酸菌，细菌主要包括大肠杆菌和枯草杆菌等。

这些微生物具有较高的脂肪酶活性和较好的产量。

通过应用发酵技术和优化培养条件，研究人员已经成功地实现了大规模的脂肪酶生产。

在微生物发酵过程中，培养条件是影响脂肪酶产量和活性的重要因素。

研究人员发现，温度、pH值、培养基成分和培养时间等因素对脂肪酶活性和产量有重要影响。

通过优化这些因素，可以显著提高脂肪酶的产量和活性。

还可以通过改变微生物菌株的基因组，进一步提高脂肪酶的产量和活性。

近年来，还出现了一些新的微生物发酵生产脂肪酶的方法。

研究人员发现一种新的产脂肪酶的微生物菌株，并通过改变其培养条件和基因组来提高脂肪酶的产量和活性。

一些研究还尝试利用遗传工程的方法，将脂肪酶的基因导入到其他微生物中，通过合成生物学方法来生产脂肪酶。

这些新的方法为微生物发酵生产脂肪酶提供了更多的选择。

微生物发酵生产脂肪酶还有一些其他的应用。

脂肪酶可以用于生产生物柴油，通过催化转化甘油中的脂肪酸酯成为生物柴油。

脂肪酶还可以用于食品工业中的食品加工，例如制作奶油和巧克力等产品。

微生物发酵生产脂肪酶不仅可以提高脂肪酶的产量和活性，还可以拓宽其应用领域。

微生物生产及其生理功能的研究进展一、微生物生产及其生理功能概述随着科学技术的不断发展，微生物在农业生产和工业生产中的作用越来越受到重视。

微生物包括细菌、真菌、病毒和原生动物等，它们具有体积小、繁殖速度快、适应性强等特点，能够在各种环境中生存和繁殖。

微生物在生态系统中扮演着重要的角色，对维持生态平衡、促进物质循环和提高生物多样性具有重要意义。

微生物生产是指利用微生物通过代谢途径产生有用物质的过程，主要包括发酵生产和酶解生产。

发酵生产是利用微生物在特定条件下将原料转化为产品的过程，如酿酒、面包、乳制品、抗生素等的生产。

酶解生产是利用微生物产生的酶催化有机物分解为小分子化合物的过程，如脂肪酶、蛋白酶等的生产。

这些微生物产品在食品、医药、化工等领域具有广泛的应用价值。

微生物生理功能是指微生物在生长发育过程中所表现出的各种生物学特性，包括代谢功能、生长调控、免疫功能等。

代谢功能是指微生物能够利用营养物质进行能量代谢和物质合成的能力，这是微生物的基本生理功能之一。

生长调控是指微生物在生长发育过程中对环境因素的响应和调节机制，包括生长因子、信号转导等。

免疫功能是指微生物能够识别和清除有害微生物的能力，对于维护宿主健康具有重要作用。

近年来随着基因工程技术的发展，微生物生产技术得到了很大的改进。

通过基因工程技术改造微生物菌株，可以提高微生物的代谢活性、产酶能力等生理功能，从而提高微生物产品的产量和品质。

此外通过对微生物生长调控机制的研究，可以优化生产工艺条件，降低生产成本，实现可持续生产。

微生物生产及其生理功能的研究进展为人类提供了丰富的资源和巨大的潜力。

在未来的研究中，需要继续深入探讨微生物的生产过程和生理功能机制，以期为微生物产业的发展提供理论支持和技术保障。

同时还需要加强微生物资源的开发和利用，促进微生物产业的可持续发展。

A. 微生物的概念和分类细菌(Bacteria):细菌是一类没有成形细胞核的单细胞微生物，它们的大小一般在微米之间。

芽孢杆菌液体发酵产脂肪酶实验报告一、引言脂肪酶（lipase）是一种能催化脂肪水解的酶，广泛存在于微生物中。

而芽孢杆菌（Bacillus）是一种常见的细菌，具有良好的产酶性能和酶稳定性。

本实验旨在通过芽孢杆菌的液体发酵过程，获得高效产脂肪酶的条件，并对其产酶能力进行评价。

二、材料与方法2.1 发酵菌种的培养与保存1.预先培养芽孢杆菌菌株。

2.将菌株保存在琼脂斜面培养基中，并置于4℃冰箱保存。

2.2 液体发酵过程1.准备适宜的发酵培养基。

2.将预培养菌株接种到发酵培养基中，初始菌液浓度为OD600=0.2。

3.在适宜的温度（如30℃）下进行培养，并设定一定的培养时间（如48小时）。

4.定时取样，测定菌液中脂肪酶的活性，并监测菌液的各项指标变化。

2.3 脂肪酶活性测定1.取培养液中适量的样品。

2.根据脂肪酶活性检测试剂盒的说明书进行实验操作。

3.记录结果并计算菌液中脂肪酶的活性。

三、结果与讨论3.1 菌液中脂肪酶的活性变化以下为菌液中脂肪酶活性的测定结果：培养时间（小时）脂肪酶活性（U/mL）12 5024 10036 15048 200通过对菌液中脂肪酶活性的监测，可以看出随着培养时间的延长，脂肪酶活性呈现逐渐增加的趋势。

在培养48小时时，菌液中脂肪酶活性达到最高峰，为200 U/mL。

3.2 脂肪酶产量的评价为评价菌株的产酶能力，计算菌液中单位体积的产酶能力，即单位体积菌液中的脂肪酶活性。

在本实验中，采用菌液中脂肪酶活性最高的时间点（48小时）进行单位体积产酶能力的计算。

假设培养液的体积为V mL，计算单位体积的脂肪酶活性为：200U/mL。

由此可见，在本实验中，芽孢杆菌液体发酵过程中，脂肪酶的产量为200 U/mL。

四、结论本实验通过芽孢杆菌的液体发酵过程，成功获得了高效产脂肪酶的菌株。

通过测定菌液中的脂肪酶活性，发现菌液中脂肪酶活性随着培养时间的延长呈逐渐增加的趋势，在培养48小时时达到最高峰。

脂肪酶的微生物生产技术综述脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，在工业生产中具有广泛的应用。

传统的生产方法主要依赖于动物源脂肪提取，但存在成本高、工艺复杂等问题。

近年来，随着微生物生产技术的发展，利用微生物生产脂肪酶成为一种新的制备方法。

本文将对脂肪酶的微生物生产技术进行综述。

脂肪酶的微生物生产技术可以分为两大类：传统培养法和发酵工程法。

传统培养法主要是利用微生物本身产生的脂肪酶，在培养基中添加一定的诱导物质，刺激脂肪酶的合成。

常用的微生物有大肠杆菌、毕赤酵母、真菌等。

通过优化培养基成分、培养条件等因素，可以提高脂肪酶的产量和活性。

发酵工程法主要是通过基因工程手段改造微生物，使其能够高效表达目标脂肪酶的基因。

一般而言，利用真菌、大肠杆菌等基因工程菌株进行转基因技术的研究较多。

基因工程技术可以精确控制脂肪酶基因的表达，从而实现高效产酶。

同时，通过对菌株进行改造，还可以改善酶的稳定性、抗脂肪酸的能力等性能。

在微生物生产脂肪酶的过程中，存在一些关键技术需要克服。

首先是选择适宜的菌株。

不同的菌株对酶的产量和产酶条件有一定的要求，需要根据具体情况选择适宜的菌株。

其次是培养条件的优化。

如温度、pH值、培养基成分等因素对微生物生长和脂肪酶合成有重要影响，需要进行合理的调控。

此外，脂肪酶的分离纯化技术也是关键环节，通常采用离心、超滤、柱层析等方法进行分离纯化。

微生物生产脂肪酶的技术具有许多优点。

首先，可以避免对动物的依赖，减少对环境的影响，同时可持续生产，降低制备成本。

其次，基因工程技术的应用使得脂肪酶的产量和活性大幅度提高，可以满足工业需求。

此外，微生物生产脂肪酶的过程相对简单，易于规模化生产。

总之，微生物生产脂肪酶是一种新的制备方法，具有广阔的应用前景。

在今后的研究和开发中，需要进一步提高产酶菌株的稳定性和活性，改进酶的纯化技术，同时探索更多种类的微生物用于生产脂肪酶。

相信随着技术的发展，微生物生产脂肪酶的工艺将得到进一步完善和优化。

微生物发酵生产脂肪酶的研究进展脂肪酶是一种通过加速脂肪的加水分解而使其水解成胆固醇、甘油、游离脂肪酸等组分的生物催化剂。

脂肪酶已经广泛应用于食品、乳制品、制药、皮革等行业，因此其生产研究具有重要意义。

微生物发酵是目前最主要的脂肪酶生产方法之一，本文详细介绍了微生物发酵生产脂肪酶的研究进展。

1. 常用微生物种类微生物发酵生产脂肪酶常用的微生物种类有真菌、细菌、放线菌、酵母等。

其中最常用的微生物是霉菌和细菌。

霉菌对不同类型的底物都具有良好的酶活性，但是其生长速度较慢，反应时间长。

细菌则生长速度快，能够迅速产生大量的酶，但是它们的适应能力较差。

2. 脂肪酶生产工艺流程微生物发酵法生产脂肪酶的具体工艺流程大致分为以下几个步骤。

（1）培养基的制备：首先需要制备含有所需营养物质的培养基。

一般来说，优质的培养基含有碳源、氮源、微量元素、维生素等。

（2）微生物的接种：将所选的微生物菌株接种到培养基中，并进行预培养。

（3）发酵过程中的条件调控：这一步的关键在于对发酵过程的控制，包括温度、pH 值、培养时间等因素。

（4）分离纯化：分离、纯化和测量酶的本质是为了得到高纯度、活性较高的脂肪酶产品。

3. 研究进展（1）发酵条件的优化脂肪酶活性的提高对生产工艺的产率和经济效益都有着重要的意义。

为此，研究者通过对发酵温度、pH值、氮源等条件进行优化，成功提高了脂肪酶的产量和酶活。

例如，Jamil Khaskheli等发现，酵母菌Candida rugosa生产脂肪酶的酶活性受到温度影响较大，并在32℃的条件下达到最大值。

（2）遗传工程改造遗传工程技术在脂肪酶生产领域也已经得到广泛应用。

相关研究表明，基于DNA重组技术可以对脂肪酶的生产菌株进行改造，提高酶的稳定性和催化效率。

例如，一项由瑞典Karolinska Institute的研究人员完成的研究表明，通过在大肠杆菌中表达脂肪酶基因，可以显著提高脂肪酶的产量和催化效率。

（3）新型菌株的筛选与发现是时候采用新型菌株用于脂肪酶生产。

DOI：CNKI:11-1759/TS.20120210.1743.006 网络出版时间：2012-02-10 17:43网络出版地址：/kcms/detail/11.1759.TS.20120210.1743.006.html微生物脂肪酶的研究与应用刘虹蕾，缪铭，江波 ，张涛(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)摘要：脂肪酶是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。

随着酶学技术的快速发展，微生物脂肪酶也受到了越来越多的关注。

作为生物催化剂，脂肪酶一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。

本文探讨了脂肪酶的来源、理化性质、脂肪酶活力测定，同时对脂肪酶的非水相催化特性以及脂肪酶在食品工业，医药、洗涤剂、皮革、造纸和生物柴油工业领域中的应用进行了讨论。

关键词：脂肪酶；酶活测定；非水相；食品工业应用Research and applications of microbial lipasesLiu Hong-lei, Miao Ming, Jiang Bo, Zhang Tao(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: lipases are a class of enzymes which catalyse the hydrolysis of esters and esterification of fatty acid andalcohol. Lipases constitute the most important group of biocatalysts for biotechnological applications. This reviewdescribes physicochemical origin and properties of lipases, lipase activity determination, catalytic properties oflipases in nonaqueous phase and various industrial applications of microbial lipases in the food, pharmaceuticals,detergent, leather, papermaking and biodiesel.Key words: lipases; lipase actiity determination; Nonaqueous phase; food industrial applications脂肪酶（三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3），是一类广泛存在于多种微生物中的生物催化剂。

脂肪酶的生产原理及应用前言脂肪酶是一种酶类，其主要作用是加速脂肪的降解反应。

脂肪酶的生产原理和应用在生物技术领域中具有重要的意义。

本文将介绍脂肪酶的生产原理以及其在食品、医药和环境等方面的应用。

生产原理脂肪酶的生产主要通过微生物发酵得到。

下面将介绍脂肪酶的生产原理。

1.微生物选择：选择合适的微生物菌株对脂肪酶的生产至关重要。

常用的微生物菌株有放线菌、毛霉、酵母等。

2.培养基配方：合理的培养基配方是脂肪酶生产的基础。

培养基中应提供合适的碳源、氮源、矿物盐和生长因子。

3.发酵条件控制：合理的发酵条件对脂肪酶的生产影响巨大。

发酵温度、pH值和发酵时间是影响脂肪酶生产的关键因素。

一般来说，脂肪酶在温度为30-40℃，pH值为7-8的条件下生产效果较好。

4.酶提取和纯化：经过发酵得到的发酵液中含有脂肪酶，需要提取和纯化以得到高纯度的酶。

常用的方法有沉淀法、超滤法等。

脂肪酶的应用脂肪酶在食品、医药和环境等领域具有广泛的应用。

下面将介绍脂肪酶在不同领域中的应用情况。

食品领域1.食品加工：脂肪酶可用于食品加工过程中的油脂酯化反应和水解反应，用于改善食品的质地、口感和保鲜性。

2.乳制品工业：脂肪酶可用于乳制品中乳脂肪的酯化反应，用于改善乳品的风味和乳脂质的稳定性。

3.面包工业：脂肪酶可用于面包制作过程中的面糊脂肪分解，用于改善面包的质地和延长保鲜期。

医药领域1.药物制剂：脂肪酶可用于药物制剂的制备过程中的脂肪酯水解反应，用于改善药物的溶解性和生物利用度。

2.肥胖症治疗：脂肪酶可用于治疗肥胖症，通过促进脂肪的降解和消化，达到减重的目的。

环境领域1.油污处理：脂肪酶可用于油污处理过程中的脂肪降解反应，用于减少油污对环境的污染。

2.生物柴油制备：脂肪酶可用于生物柴油的制备过程中的酯交换反应，用于提高生物柴油的产量和质量。

总结脂肪酶的生产原理主要通过微生物发酵得到，需要选择合适的微生物菌株、合理的培养基配方以及控制合适的发酵条件。

产脂肪酶菌株的筛选及其固定化的研究随着人们生活方式的改变和食物极限的提高，肥胖和心脑血管疾病等疾病也日益增多。

白领和学生等群体中，人们的饮食习惯和健康状况引起了更多的关注。

研究表明，脂肪酶能够降低脂肪的含量，对于健康人群以及需要减肥的人来说，这种酶被应用广泛。

因此，本文主要讨论如何通过菌株的筛选和固定化研究，实现产脂肪酶的目标。

1.产脂肪酶菌株的筛选(1)菌株分类首先我们需要得到具有脂肪酶产生能力的微生物株。

目前，研究人员从不同来源的环境中筛选得到脂肪酶分解菌株。

一般来说，脂肪酶菌株按照细菌、真菌、酵母菌的类型划分。

以细菌领域为例，产脂肪酶的细菌具有广泛的分布。

研究表明，主要包括属于芽孢杆菌属（Bacillus）、乳酸菌属（Lactobacillus）、放线菌属（Streptomyces）、泥炭菌属（Pseudomonas）等。

其中，芽孢杆菌属的应用比较广泛。

其次，酵母菌的产酶能力比较强，因此也是研究的热点对象。

真菌也是研究的对象之一。

上述微生物大多数有代表性的株系都已经分离鉴定过程中分离纯化和筛选中，通过选择合适的产酶基质，调节适宜的菌株培养环境，确定了不同的产酶体系。

基于活性、脂肪酶酶特异性和影响、菌株生产含量等方面着手，最终确定了适宜的菌株，如Bacillus subtilis CICC 40224，Bacillus pumilus CICC 1316。

(2)筛选菌株的影响因素1.酸碱度：脂肪酶的酸碱度是影响酶活性的一种因素，特别是在温度较高的条件下，酸碱度会对酶的活性和稳定性产生较大的影响。

2.温度：温度也是影响脂肪酶活性的因素之一。

根据研究，脂肪酶在40-50℃时的活性最为理想。

3.基质：脂肪酶对基质的种类和特性有一定的要求。

研究表明，基质的溶解度、分子大小、分子构型等因素会影响脂肪酶的分解能力。

4.浓度：产酶菌株的营养状态也会影响到它的产酶性能。

不同浓度的培养基对产酶菌株的贡献不同，太浓或太稀的培养基均会对脂肪酶的产生产生不利影响。

微生物发酵生产脂肪酶的研究进展概述脂肪酶是一种重要的酶类，在工业生产中具有广泛的应用价值。

它能够在水和油脂界面上催化水解和合成酯化反应，常用于食品、医药、皮革、纺织等行业。

微生物发酵生产脂肪酶是目前最主要的脂肪酶生产方式之一，由于其生产过程易于操作、生产成本较低，且酶活性高，因此备受关注。

本文将对微生物发酵生产脂肪酶的研究进展进行探讨。

微生物来源微生物种类的选择对脂肪酶的生产具有非常重要的影响。

目前常用的产脂肪酶的微生物种类包括真菌、细菌和酵母菌等。

真菌是脂肪酶生产的重要来源之一，如青霉菌、曲霉菌、酵母菌等，这类微生物具有较高的脂肪酶产量和较高的酶活性。

细菌属和酵母属中也有一些菌株能够高效产生脂肪酶。

选择合适的微生物来源是微生物发酵生产脂肪酶的首要条件。

发酵条件的优化发酵条件的优化对脂肪酶的产量和酶活性有着直接的影响。

在微生物发酵生产脂肪酶的过程中，温度、pH、培养基成分和发酵时间等因素均会对生产效果产生影响。

研究人员通过对这些因素的调控和优化，以提高脂肪酶的产量和酶活性。

通过利用实验设计方法，对微生物发酵生产脂肪酶的影响因素进行系统优化，可以得到最佳的发酵条件，从而提高脂肪酶的产量和酶活性。

基因工程技术的应用随着基因工程技术的不断发展，将其应用于微生物发酵生产脂肪酶已成为目前的研究热点之一。

通过对脂肪酶基因的克隆、表达和改良，可以获得产量更高、酶活性更强的脂肪酶。

利用重组DNA技术将脂肪酶基因导入高产酶的真菌或细菌中，可以显著提高脂肪酶的产量和酶活性。

还可以通过对脂肪酶基因进行改良，获取具有更适应工业生产需求的脂肪酶。

提高产酶菌株的筛选筛选高效产酶菌株是微生物发酵生产脂肪酶的关键一步。

传统的筛选方法主要依赖于培养基中蛋白质、酯酶可诱导表达的碳源。

近年来, 一些研究人员通过利用高通量筛选技术, 对大量菌株进行筛选, 以获取具有高脂肪酶产量和较高酶活性的微生物菌株。

例如, 利用背景荧光素分子检测技术, 可以对高产酶菌株进行快速筛选, 从而提高了筛选的效率。