1、胶乳偶联方案的输出
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配合剂的加工1、10%酪素溶液的制备:用分度值为0.1g的天平,称取20g干酪素于干净的600mL烧杯中,并加入174mL软水,在置于40℃左右(不超过50)的恒温水浴中,使酪素充分溶胀(约需2h)。
然后加入20%氨水6mL,微热(不超过65)并搅拌至完全溶解,即制成10%酪素溶液。
若原酪素杂志多,此时还需用纱布过滤后备用。
2、50%机械油乳化剂的制备:用分度值为0.5g的台平称取150g机械油,置于600mL烧杯中,并加入130mL软水,共热至80左右,然后在搅拌机缓慢搅拌下加入14g油酸并逐滴加入20%氨水6mL,继续搅拌至油酸完全皂化(即混合液在搅拌情况下呈均一相液体)为止。
最后将此混合液转移到高速自控组织捣碎机的容器中,高速搅拌至所需分散度,即成50%机械油乳化液。
3、50%硫磺分散体:在台平上称取100g硫磺粉,置于500mL搪瓷杯中,然后加入10%酪素40mL,11.5%氨水2.5mL,软水57.5mL以及堆积体积约为150mL 的玻璃砂,搅和后将搪瓷杯加盖并固定在无极调速电动搅拌机上,用不锈钢搅拌桨快速搅拌(转速越高越好,但以无液滴飞溅为度),直到硫磺粒子的分散度达到要求为止。
一般研磨约12h。
最后取下搪瓷杯,滤去玻璃砂,既得50%硫磺分散体。
4、40%氧化锌分散体:在台平上称取氧化锌粉末(经干燥、过筛)100g,扩散剂NF 6g,置于干净的500mL搪瓷杯中,加入10%酪素80mL,20%氨水10mL,软水60mL以及堆积体积约为150mL的玻璃砂,搅和后将搪瓷杯加盖并固定在无极调速电动搅拌机上,用不锈钢搅拌桨快速搅拌(搅拌速度以快为好,但应无液滴飞溅),直到氧化锌分散度达到要求为止。
约10h。
最后取下搪瓷杯,滤去玻璃砂,所得流体为40%氧化锌分散体。
5、50%促进剂TMTD、促进剂M或促进剂ZDC分散体:在台平上称取100g促进剂TMTD、促进剂M或促进剂ZDC粉,2.3g干扩散剂NF,置于干净的500mL搪瓷杯中,加入10%酪素40mL,软水57.7mL以及堆积体积约为150mL 的玻璃砂,搅和后将搪瓷杯加盖并固定在无极调速电动搅拌机上,用不锈钢搅拌桨快速搅拌(搅拌速度以快为好,但应无液滴飞溅),直到促进剂TMTD、促进剂M或促进剂ZDC分散度达到要求为止。
绪论1、什么是胶乳?按来源和用途分可将胶乳分为哪几种?高聚物粒子分散在水介质中所形成的具有一定稳定性的胶体分散体系。
按来源及用途分:天然胶乳、合成胶乳、人造胶乳。
2、胶乳工业有什么优缺点?优点:1)工艺过程简单,不需重型设备,投资省,能耗低2)易实现连续化、自动化生产,生产效率高3)工作环境好,安全无毒,污染小,劳动强度低4)没有焦烧危险,适于不耐高温的橡胶复合材料的制备5)可以在胶体体系不变的情况下进行预硫化6)橡胶分子未受破坏,制品保持高聚物原有的优良性能缺点:1)含有大量的水,使用和运输不方便2)易受环境影响,变异性大,加工过程及产品质量难控制3)半成品脱水干燥困难,干燥后收缩大4)胶乳补强及防老化相对较困难3、天然胶乳的发展经历了哪四个阶段?1)新鲜胶乳自然凝固制造产品2)胶乳凝固物溶解成溶液制造产品3)鲜胶乳配合成型制造产品4)浓缩胶乳配合成型制造产品4、如何解决天然胶乳蛋白质过敏问题?1)降低N R L中可溶性蛋白质含量2)切断蛋白质传播途径3)寻找不含蛋白质的替代胶乳5、如何解决乳胶制品硫化时产生亚硝胺问题?1)采用过氧化物或者辐射硫化2)尽可能不用能产生亚硝胺的配合剂6、胶乳产品有哪两大类胶乳的产品主要有纯胶制品和复合制品(或非纯胶制品)两大类7、胶乳纯胶制品按照生产方法可分为哪几种?浸渍制品、海绵制品、压出制品、模铸制品第一章原料胶乳1.天然胶乳主要产自什么植物?橡胶粒子中的橡胶烃是什么?三叶橡胶树;其主要成分橡胶烃为异戊二烯的顺式-聚合物2.天然胶乳按照来源和用途可分为哪几种?通用胶乳、特种胶乳、改性胶乳3.新鲜天然胶乳由哪些成分组成?高速离心处理后天然胶乳自上而下各是什么成分?各呈什么色?橡胶烃、水、非橡胶成分;1)白色的橡胶粒子层,主要由橡胶粒子和少量的水组成2)橙黄色的粘性体或F W(弗林-威斯林)粒子层,蛋白质和类脂化合物的复合体3)透明的乳清(或浆液),含有小粒径胶粒及可溶性蛋白质、脂肪酸、无机盐和糖类。
基础胶乳反应工艺流程英文回答:The basic latex reaction process is an essential part of the production of various latex-based products, such as paints, adhesives, and coatings. It involves a series of steps that transform the raw materials into a stable and usable latex emulsion.The first step in the process is the preparation of the raw materials. This includes selecting and measuring the appropriate amounts of monomers, initiators, and other additives. For example, in the production of acrylic latex, the monomers used can include butyl acrylate, methyl methacrylate, and styrene. These monomers are mixed with water, surfactants, and stabilizers to create a monomer mixture.Once the monomer mixture is prepared, the next step is to initiate the polymerization reaction. This is typicallydone by adding a water-soluble initiator, such as ammonium persulfate or potassium persulfate, to the monomer mixture. The initiator triggers the reaction and starts the formation of polymer chains.During the polymerization reaction, the monomers undergo a process called emulsion polymerization. This involves the formation of small droplets of monomers dispersed in water. The initiator breaks down into free radicals, which react with the monomers to form polymer chains. These chains grow and eventually combine to form a stable latex emulsion.The polymerization reaction is typically carried out under controlled conditions, such as specific temperature and pH levels. This ensures optimal polymerization and the formation of a high-quality latex emulsion. The reaction is usually conducted in a reactor vessel equipped with agitation and temperature control systems.Once the polymerization is complete, the latex emulsion is cooled and stabilized. Stabilizers, such as non-ionicsurfactants, are added to prevent coagulation and maintain the stability of the emulsion. The emulsion may also undergo further processing steps, such as filtration or centrifugation, to remove any impurities or oversized particles.Finally, the stabilized latex emulsion is ready for further use or can be formulated into specific products. For example, in the production of paints, the latex emulsion can be mixed with pigments, fillers, and other additives to create a paint formulation. The formulation is then applied to a surface and dries to form a protective and decorative coating.中文回答:基础胶乳反应工艺流程是生产各种基于胶乳的产品(如涂料、粘合剂和涂层)的重要步骤。
抗体,胶乳基本偶联步骤免疫胶乳偶联试验方案一试剂准备:mes缓冲液500mm,ph5-6,4℃储存;edac配置浓度为52μmol/ml(称取10mgedac,加入1ml去离子水);nhs酿制浓度为50mg/ml水溶液;蛋白质溶液缓冲液稀释至浓度为1-10mg/ml。
二步偶联法:1.将包好的溶液按以下顺序几滴重新加入离心管①100μl500mmmes缓冲液;②搅拌吸收至1ml;③200μl5%微球;④230ulnhs溶液⑤edac水溶液(排序量)2.放置在恒温摇床上,37℃,120rpm,30min;3.13000rpmVergt30min,下陷后,弃上清,搜集Vergt结晶;用50mmmes缓冲液冲洗2次;Vergt下陷后,弃上清。
4.将包好的溶液按以下顺序重新加入离心管中,搅匀①100ul500mmmes缓冲液;②搅拌吸收至1ml;③蛋白质溶液。
5.放置在恒温摇床上,37℃,120rpm,2h;1ml6.13000rpmVergt20min下陷后,弃上清,搜集Vergt结晶;用1ml50mmmes缓冲液(或者调节ph至8.0左右),同时重新加入bsa溶液至其终浓度为1%,冲洗3次;Vergt 下陷后,弃上清。
7.加入0.97mlmes缓冲液(或者调节ph至8.0左右),将微球浓度调为1%,并重新悬浮,然后搅拌,接着温和的超声分散;8.重新悬浮后加入一定量的bsa溶液(比如终浓度为1%),保存。
9.福林酚法测定偶联蛋白质含量(可选)。
(如要测蛋白质含量,则前面的方法中不可加入bsa。
)免疫系统胶乳偶联试验方法二1.每ml反应混合物加入以下成分:加入diw,定容最终体积为1ml;0.1ml10x的mesbuffer,ph6.0~6.5(10x的buffer通常用0.5m);0.1ml10%的微球(终浓度为1%);0.23mlnhs水溶液(50mg/ml);11.5mg一定体积的19.2mg/ml(100mm)的edac水溶液;2.室温下烘烤反应15~30min;(note7)3.清洗:mesbuffer或diw清洗两次;(note3);4.用mesbuffe或者diw悬浮微球到浓度为1%;5.同时,用mesbuffer熔化吸收抗体。
胶乳微球偶联蛋白的使用中常见问题及解答胶乳微球使用中常见问题及解答以下问题是我们用户在使用过程中遇到的问题,我们咨询了国外的技术人员,这是他们的答复)问:产品说明书中得出的胶乳粒径就是平均值粒径吗?答:产品说明书中给出的胶乳粒径(diameter)是平均粒径。
问:如何选择胶乳微球的粒径?请问:通常挑选粒径大的胶乳微球,则须要的抗体量就多,精密度和线性相对较好,而挑选粒径小的胶乳微球性,则所须要抗体太少,精密度和线性相对极差,相对于小球,大球的灵敏度较好。
问:一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少?请问:整个测量体系中,微球的浓度大约在0.01%左右,当然这与试剂本身规定的线性存有关系。
问:在采用Vergt方法偶联乳胶微球,通常须要多小的(相对)离心力?答:需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关,一般70nm左右的微球大概13000g/min30min以上,粒径越小所需时间越长,离心力越大。
问:蛋白(抗体)与微球偶联前,是不是微球的活化时间越短,效率越不好?答:羧基微球的活化所需时间很短,一般以10-20分钟为宜,长时间的活化反而会降低偶联效率。
问:由于抗体不只是fc的氨基酸上加nh2,是不是则表示它可以在任何方向与edca 活化微球偶联呢?如果就是这样,是不是可以影响抗体与抗原的特异性反应?答:事实的确如此,当然由于抗体的空间折叠方式和fc端疏水性强,因此偶联反应的绝大多数发生在fc端,对抗体与抗原的结合的影响不大。
问:胶乳微球与抗体偶联后,当时没有辨认出存有HGPRT,但隔夜后辨认出存有HGPRT,这就是什么原因?如何掌控和防止?答:这种情况一般是偶联效率低的原因。
当体系中蛋白不足或是其它原因,使微球表面在交联后还空出许多反应基团时,这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应,结果是把球又拉在一起了,所以有聚集。
可以加一些阻断剂解决,常见的是bsa,另外,也可提高微球的交联率。
但为什么是过一段时间后才出现凝集呢,这是因为微球偶联上蛋白后,相互之间由于携拎同种电荷的关系,比较稳定(所以能够以胶体样存有),只有当偶尔相互相撞,碰上彼此的反应基团时就可以融合。
乳胶微球偶联方法乳胶微球偶联方法的步骤通常包括光敏交联聚合、功能物质固定化和乳胶微球基质处理。
首先,乳胶微球的合成是基础。
通常,聚合物乳胶微球的制备通过乳液聚合反应来实现,其中聚合物的单体通过乳化剂稳定在水相中。
这种方法的优点是可以通过调整单体的类型和含量来控制微球的性质,比如粒径、形状和表面特性。
光敏交联聚合是乳胶微球偶联的关键步骤之一、光敏交联聚合通过在聚合物单体中引入光敏剂来实现。
在光照条件下,光敏剂可以吸收光能并诱导单体分子之间的交联反应,从而形成网络结构的聚合物。
这种交联结构可以增强乳胶微球的稳定性并提高其机械性能。
在光敏交联聚合过程中,需要选择合适的光敏剂和光照条件,并根据所需的功能物质来确定单体的选择和交联程度。
功能物质固定化是另一个重要的步骤。
在乳胶微球的光敏交联聚合之后,可以通过物理吸附、共价结合或离子键结合等方法将功能物质固定在乳胶微球的表面上。
这种固定化方法的选择取决于功能物质的性质和乳胶微球的表面特性。
例如,对于含有氨基团的功能物质,可以通过与乳胶微球表面带有羧基的聚合物发生共价结合来固定在乳胶微球上。
最后,乳胶微球基质处理是乳胶微球偶联的最后一步。
乳胶微球偶联后,需要对乳胶微球进行处理以增强其稳定性和使用性能。
常用的处理方法包括洗涤、溶解和干燥。
这些处理可以去除其中的有机溶剂和未固定的功能物质,并使乳胶微球获得更好的稳定性和储存性能。
总之,乳胶微球偶联方法是一种将功能物质固定在乳胶微球表面的技术。
通过光敏交联聚合、功能物质固定化和乳胶微球基质处理等步骤,可以制备出具有特定功能和稳定性的乳胶微球。
这种方法具有简单、灵活和可控性强等特点,并在催化剂、生物传感器和药物释放等领域具有广泛的应用前景。
1. Dissolve the protein to be modified at a concentration of 1–10 mg/ml in 0.1 M sodium phosphate, pH 7.4. NaCl may be added to this buffer if desired. For the modifi cation of keyhole limpet hemocyanin (KLH; Thermo Fisher) as described by Staros et al., 1986, include 0.9 M NaCl to maintain the solubility of this high-molecular-weight protein.If lower or higher concentrations of the protein are used, adjust the amounts of the other reactants as necessary to maintain the correct molar ratios.2. Dissolve the molecule to be coupled in the same buffer used in step 1. For small molecules, add them to the reaction in at least a 10-fold molar excess over the amount of protein present. If possible, the molecule may be added directly to the protein solution in the appropriate excess. Alternatively, dissolve the molecule in the buffer at a higher concentration, and then add an aliquot of this stock solution to the protein solution.3. Add the solution prepared in step 2 to the protein solution to obtain at least a 10-fold molar excess of small molecule to protein.4. Add EDC (Thermo Fisher) to the above solution to obtain at least a 10-fold molar excess of EDC over the amount of protein present. Alternatively, a 0.05–0.1 M EDC concentrationin the reaction usually works well. Also, add sulfo-NHS (Thermo Fisher) to the reaction to bring its final concentration to 5 mM. To make it easier to add the correct quantity of EDC or sulfo-NHS, higher concentration stock solutions may be prepared if they are dissolved and used immediately. Mix to dissolve. If this ratio of EDC/sulfo-NHS to peptide or protein results in precipitation, scale back the amount of addition until a soluble conjugate is obtained.5. React for 2 hours at room temperature.6. Purify the conjugate by gel filtration or dialysis using the buffer of choice (for many conjugates 0.01 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH7.4 is appropriate). If some turbidity has formed during the conjugation procedure, it may be removed by centrifugation or filtration.。
胶乳免疫比浊法和免疫学法
首先,让我们来谈谈胶乳免疫比浊法。
胶乳免疫比浊法是一种常用的免疫学检测方法,它利用胶乳颗粒作为载体,将抗原或抗体与胶乳颗粒偶联,形成胶乳免疫复合物。
当抗原与抗体结合时,会形成较大的颗粒团簇,从而导致溶液的浊度增加。
通过测量溶液的浊度变化,可以间接地定量检测抗原或抗体的存在量。
这种方法操作简便,灵敏度高,被广泛用于临床诊断和科研实验中。
其次,让我们来谈谈免疫学法。
免疫学法是一种通过检测免疫反应来识别和测定抗原或抗体的方法。
免疫学法包括很多种技术,比如ELISA(酶联免疫吸附实验)、免疫印迹、免疫荧光等。
这些方法都是基于免疫反应原理,通过抗原与抗体的特异性结合来进行检测。
免疫学法可以用于检测感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤标志物等,具有高度的特异性和灵敏度。
总的来说,胶乳免疫比浊法和免疫学法都是用于检测抗原和抗体的实验方法,它们在原理和应用上有所不同,但都在医学诊断和科研领域发挥着重要作用。
希望这些信息能够帮助你更好地理解这两种方法。
基础胶乳反应工艺流程英文回答:The basic emulsion reaction process involves several steps to produce emulsion products. First, the raw materials, such as monomers, surfactants, and initiators, are prepared. These materials are essential for the emulsion polymerization process. Monomers are the building blocks of the polymer, surfactants help to stabilize the emulsion, and initiators initiate the polymerization reaction.Next, the emulsion polymerization reaction takes place. The monomers are dispersed in water along with the surfactants, and the initiators are added to initiate the polymerization reaction. The reaction mixture is then heated and stirred to ensure proper mixing and reaction. As the reaction progresses, the monomers polymerize and form polymer chains.After the polymerization reaction is complete, the emulsion needs to be stabilized and adjusted. Stabilizers are added to prevent coagulation and maintain the stability of the emulsion. Adjustments may also be made to the pH and viscosity of the emulsion to meet specific requirements.Finally, the emulsion product is collected and packaged. The emulsion is typically filtered to remove any impurities or particles. It is then transferred to containers or packaging materials for storage and distribution.中文回答:基础胶乳反应工艺流程涉及几个步骤来生产胶乳产品。
1、胶乳偶联方案的输出方案方案一一实验方法:实验方法:一步法共价结合实验步骤:实验步骤:1、配制50mM的MES反应缓冲溶液,pH值为6.0;2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中,其浓度为10mg/L;3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球,使其浓度为1%(W/V);4、将上述蛋白质溶液与胶乳微球混合,混合后在温室培育20分钟;5、用去离子水配制EDAC溶液,浓度为10mg/mL(52μmol/mL);6、取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中;7、用0.1M氢氧化钠(NaOH)溶液调整该反应混合液的pH值至6.5±0.2,在摇床温室培育2小时;8、将未结合的蛋白质除去,贮藏于缓冲溶液中。
方案方案二二实验方法:实验方法:简单二步法共价结合实验步骤:实验步骤:1、配制50mM的MES反应缓冲溶液,pH 值为6.0;2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中,其浓度为10mg/L;3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球,使其浓度为1%(W/V);4、1mL胶乳微球悬浮液,加入20mgEDAC,在室温培育40分钟,在20分钟后第二次加入20mg/mL;5、用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球,离心,用1倍体积的缓冲溶液重复处理;6、将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中,蛋白质浓度为1mg/mL;7、再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中,迅速加入溶解的蛋白质,37℃搅拌反应3小时;8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合,搅拌反应10分钟;9、除去未结合的蛋白质,贮藏与贮存的缓冲溶液中方案方案三三实验方法:实验方法:生成NHS-酯的中间体二步法共价结合实验步骤:实验步骤:1、每ml反应混合物加入下列各物:a.去离子水是最后容积为1.0mL;b.0.1mL的10x的贮备缓冲溶液,其pH值为6.0-6.5(一般可用0.5MMES缓冲溶液);胶乳微球最终浓度为1%(W/V);c.0.23mL的50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液;d.19.2mg/mL(100mM)的EDAC在去离子水中的溶液2、在室温将此混合物反应15-30分钟,不断搅拌;3、用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物,除去未反应的NHS和EDAC;4、重新将胶乳微球在去离子水中悬浮,使其浓度为1%(w/v);5、将结合的蛋白质溶于50-100mM的MES缓冲溶液中,浓度为1mg/mL;6、立即加入蛋白质溶液(胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%(w/v)、0.5mg/mL、25-50mM);7、将混合物反应至少2小时,轻轻搅拌;8、按1mL反应混合液加入2.5μL 乙醇胺混合,搅拌反应10分钟;9、除去未结合的蛋白质和乙醇胺,贮于适宜的贮存缓冲溶液中。
附录附录试剂:试剂:MES缓冲液500mM和50mM;PH6.1;4°C储存(如果发黄或者污染,应倒掉)。
EDAC盐酸1-乙基-3-二甲基氨基丙基二酰亚胺;52umol/ml:分析天平称取10mgEDAC,加入1ml去离子水。
(EDAC对潮气非常敏感,在水中快速水解,EDAC储存于干燥器中,-5°C保存。
)NHSN-羟基琥珀酰亚胺;50mg/ml水溶液蛋白质溶液蛋白质充分稀释溶解,浓度为1-10mg/ml技术说明技术说明::1.微球总表面积与其粒径成反比,抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变;单位质量的微球表面积(m2/g):A/M=6/PD 其中D=微球粒径(µm)P=微球密度(聚苯乙烯1.05g/ml)例如:0.8µm的聚苯乙烯微球,A/M=6/1.05×0.8=7.14m2/g1.6µm的聚苯乙烯微球,A/M=6/1.05×1.6=3.57m2/g0.8µL,10mg聚苯乙烯微球需加入125-250µL多克隆抗体1.6µL,10mg聚苯乙烯微球需加入62.5-125µL多克隆抗体2.虽然疏水性吸附与缓冲液pH值无关,但反应缓冲液的pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响,进而影响其吸附效率。
在等电点pH值条件下,更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来,利于其与微球作用;3.高效搅拌下,将微球分散液快速加入蛋白质反应缓冲液,可以获得最高的吸附效率和吸附均匀度;4.绝大部分的蛋白质很快被吸附,延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。
方案五方案五SampleProtocolforTwo-StepCarbodiimideCouplingofProteintoCarbo xylatedMicrospheresMicrospheresshouldbeprotectedfromprolongede xposuretolightthroughoutthisprocedure.1.Resuspendthestockuncoupl edmicrospheresaccordingtotheinstructionsdescribedintheProductInati onSheetprovidedwithyourmicrospheres.2.Transfer5.0x106ofthestockmicrospherestoaUSAScientificmicrocentrifugetube.3.Pelletthestock microspheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.4.Remo vethesupernatantandresuspendthepelletedmicrospheresin100μLdH2 Obyvortexandsonicationforapproximately20seconds.5.Pelletthemicr ospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.6.Removeth esupernatantandresuspendthewashedmicrospheresin80μL100mMMo nobasicSodiumPhosphate,pH6.2byvortexandsonicationforapproxima tely20seconds.7.Add10μLof50mg/mLSulfo-NHS(dilutedindH20)tot hemicrospheresandmixgentlybyvortex.8.Add10μLof50mg/mLEDC( dilutedindH20)tothemicrospheresandmixgentlybyvortex.9.Incubatef or20minutesatroomtemperaturewithgentlemixingbyvortexat10minut eintervals.10.Pellettheactivatedmicrospheresbymicrocentrifugationat ≥8000xgfor1-2minutes.11.Removethesupernatantandresuspendthemi crospheresin250μLof50mMMES,pH5.0byvortexandsonicationforap proximately20seconds.SeeTechnicalNote1.12.Pelletthemicrospheres bymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.13.Repeatsteps11.an d12.Thisisatotaloftwowasheswith50mMMES,pH5.0.14.Removethes upernatantandresuspendtheactivatedandwashedmicrospheresin100μLof50mMMES,pH5.0byvortexandsonicationforapproximately20sec onds.15.Add125,25,5or1μgproteintotheresuspendedmicrospheres.(N ote:Werecommendtitrationinthe1to125μgrangetodeterminetheoptima lamountofproteinperspecificcouplingreaction.)16.Bringtotalvolumeto500μLwith50mMMES,pH5.0.17.Mixco uplingreactionbyvortex.18.I ncubatefor2hourswithmixing(byrotation)atroomtemperature.19.Pelle tthecoupledmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2min utes.20.Removethesupernatantandresuspendthepelletedmicrospheres in500μLofPBS-TBNbyvortexandsonicationforapproximately20seco nds.SeeTechnicalNote2.21.Incubatefor30minuteswithmixing(byrotat ion)atroomtemperature.(Note:Optional–perthisstepwhenusingthemic rospheresthesameday.)22.Pelletthecoupledmicrospheresbymicrocentr ifugationat≥8000xgfor1-2minutes.23.Removethesupernatantandresu spendthemicrospheresin1mLofPBS-TBNbyvortexandsonicationfora pproximately20seconds.SeeTechnicalNote3.24.Pelletthemicrosphere sbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.25.Repeatsteps23.a nd24.Thisisatotaloftwowasheswith1mLPBS-TBN.26.Removethesup ernatantandresuspendthecoupledandwashedmicrospheresin250-1000μLofPBS-TBN.27.Countthemicrospheresuspensionbyhemacytomete r.Calculation:Totalmicrospheres=count(1cornerof4x4section)x(1x10 4)x(dilutionfactor)x(resuspensionvolumeinmL)28.Storecoupledmicr ospheresrefrigeratedat2-8°Cinthedark.TechnicalNote1:Couplingcanb eperedin100mMMES,pH6.0withsimilarresults.Forsomeproteins,bett ersolubilityandbettercouplingmaybeachievedatahighercouplingpHori nadifferentbuffer.Ifyourproteindoesnotcouplesatisfactorilyunderthese recommendations,tryPBS,pH7.4asanalternatecouplingbuffer.TechnicalNote2:EitherPBS-TBN(PBS,0.1%BSA,0.02%Tween-20,0.05%Azi de,pH7.4)orPBS-BN(PBS,1%BSA,0.05%Azide,pH7.4)maybeusedas Blocking/StorageBuffer.TechnicalNote3:EitherPBS-TBNorPBS,0.05 %Tween-20maybeusedasWashBuffer.附:蛋白质检测方法附:蛋白质检测方法实验实验7考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250染色法染色法测定蛋白质含量测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收。