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S 132.32 Gamble HR,M urrell KD,M arti HP.Inoculation of pigs agai nstTr ichinella spiralis using larval excretory -secretory anti gens.Am J Vet Res,1986,47(11):2396-2399.33 e-l Shazly AM ,e-l Shewey K,e-l Hamshary E,et al.M ice immun -zation using crude Trichinella spiralis antigen.J Egypt SocParasitol,2002,32(2):391-403.34 王中全,崔晶.旋毛虫属分类的研究进展.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2002,20(5):310-314.35 M arinculic A,Gamble HR,Urban JF,et al.Immunity i n swineinoculated w ith l arvae or extracts of a pig isol ate and a sylvatic isolate of T richinella spir alis.Am J Vet Res,1991,52(5):754-758.36 Goyal PK,Bolas -Fernandez F,Wak elin D.Immunization of miceagainst T richinella spiralis and T.britov i using excretory and secretory antigens.J Helminthol,1997,71(2):109-112.(收稿日期:2004-02-27)#综述#杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体及其在医学中的应用胡少敏1,2 王海1 吴忠道1摘要 杆状病毒载体表达系统已被广泛用于在受纳昆虫细胞中大量表达外源蛋白。
杆状病毒介绍杆状病毒关键词：昆⾍病毒，杆状病毒，核型多⾓体病毒，颗粒体病毒，质型多⾓体病毒杆状病毒是⼀类在⾃然界中专⼀性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒⼦呈杆状，基因组为双链环状DNA分⼦，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状⾐壳内，⼤⼩在90～180 Kb之间。
⽬前杆状病毒作为⾼效、安全的⽆公害⽣物⾍剂⼴泛应⽤于害⾍防治。
杆状病毒只来源于⽆脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进⾏分⼦⽣物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单⼀闭合环状双链DNA 分⼦，⼤⼩为80～160 kb，其基因组可在昆⾍细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核⾐内，后者具有较⼤的柔韧性，可容纳较⼤⽚段的外源DNA 插⼊，因此是表达⼤⽚段DNA的理想载体。
其中，⽤作外源基因表达载体的杆状病毒，⽬前仅限于核型多⾓体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多⾓体蛋⽩包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多⾓体形状。
核型多⾓体病毒有两种形式：⼀种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另⼀种则为细胞外芽⽣病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的⾓⾊不同，包含体病毒是昆⾍间⽔平感染的病毒形式，昆⾍往往是⾷⼊污染OV的⾷物后引起感染。
包含体病毒外层裹了⼀层蛋⽩晶体，即为29 000的多⾓体蛋⽩，它对病毒的⽔平感染起以下作⽤：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏⽽失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆⾍中肠上⽪局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋⽩酶溶解多⾓体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽⽣出BV，进⼊⾎淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近⼏⼗年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深⼊的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多⾓体病毒(multiple nuclear polyhedro-sisvirus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
龙源期刊网 杆状病毒在癌症基因治疗方面的应用作者：骆超超杨婧如张妍陈琛刘芸菲王奕曹锦涛陈瑶来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第03期【摘; 要】随着癌症发病率居高不下，人们一直在追求如何能够高效的治疗癌症。
随着医药科学的飞速发展，利用基因治疗技术来治疗癌症有了显著成效。
基因载体的选择是基因治疗的核心技术之一，杆状病毒一直就是备受关注的一类基因转导载体。
经过研究者们的深入研究发现，杆状病毒在肝癌、胃癌、黑色素瘤及脑肿瘤等的基因治疗中具有较强的可行性。
目前还可以进一步解决杆状病毒引起的体内补体反应，同时也能不断提高其转导和表达效率。
本文将着重介绍杆状病毒在癌症基因治疗中的应用。
【中图分类号】R730.5;;;;; 【文献标识码】A;;;;; 【文章编号】1672-3783（2019）03-0073-011 杆状病毒1.1杆状病毒杆状病毒是节肢动物的病源病毒，具有囊膜的双链环状DNA，且其基因组为单一的闭合环状双链DNA分子，并以超螺旋形式压缩包装。
根据包涵体的形态及其理化性质，杆状病毒科被分为核型多角体病毒属（nuclear polyhedrosis virus）、颗粒体病毒属（Granulosis Virus，GV）。
核型多角体病毒多用于杆状病毒表达系统的运用。
与其他病毒不同的是，在其双向复制的周期中，杆状病毒以两种形态存在：一种是包涵体病毒（occluded virus， OV），是昆虫间水平感染的病毒形式;一种是细胞外芽生病毒（budded virus， BV），是个体内细胞间感染的病毒形式。
虽然它们的遗传组成相同，但有着不同的形态、囊膜结构、组成和功能。
在时序性的基因表达过程中，在极晚期基因表达的时候，会有两种高效表达的非必需蛋白产生，即多角体蛋白和P10蛋白。
正因如此，杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入点是这两个基因位点。
1.2杆状病毒表达系统杆状病毒载体系统主要分为两大类：一类是用于表达单个外源基因的载体;另一类是多元表达载体，用于插入并表达两个或多个外源基因[1]。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为解决杆状病毒表达系统存在的表达量低和毒种种子批代次窄问题，加快杆状病毒表达系统产业化进程。
本研究首次通过Red 和Cas9两种重组技术，先后对影响蛋白表达的V-cath 、ChiA 、P10和重组杆状病毒基因组稳定性的FP25K 和DA26基因进行缺失。
同时基于对CSFV-E2蛋白的结构和糖基化预测分析，突变影响同源二聚体二硫键形成的糖基化位点。
最后通过悬浮转染的方式提高拯救病毒的滴度。
结果表明对E2基因突变后，表达的E2蛋白95%以同源二聚体形式存在。
通过供体质粒优化和病毒载体基因缺失，E2蛋白的表达水平提高约4倍，可稳定表达蛋白的重组杆状病毒毒株代次从P7代延长至P20代。
悬浮转染获得的重组杆状病毒滴度提高约70倍，同时获得足量低代次的毒种，有效缩短从毒种构建到蛋白表达时间，有效解决杆状病毒表达系统表达量低和毒种种子批代次窄的问题，为猪瘟亚单位疫苗研发奠定基础。
关键词：杆状病毒；猪瘟病毒；基因缺失；E2蛋白中图分类号： S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）01-0048-08Construction and Application of Gene Deletion Baculovirus Vector收稿日期：2021-11-03基金项目：郑洛新自创区创新引领型产业集群专项（201200211200）作者简介：王同燕，女，硕士，兽医师，主要从事兽用基因工程疫苗研究与开发；仝晓丹，女，硕士，主要从事兽用基因工程疫苗研究与开发通信作者：谭菲菲，E-mail：**************；田克恭，E-mail:**************基因缺失杆状病毒载体的构建及应用王同燕1,2，仝晓丹1,2，苏晓蕊1,2，宋欢欢1,2，李伟国1,2，刘武杰1,2，谭菲菲1,2，田克恭1,2,3（1.国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳471003；2.普莱柯生物工程股份有限公司，洛阳471000；3.洛阳普泰生物技术有限公司，洛阳471003）2024,32(1):48-55Abstract: In order to solve the low protein production and virus passages in baculovirus expression system to accelerate the industrialization process, the v-cath , ChiA , P10 that aff ected protein production and FP25K , DA26 genes that related to stability of the genome were deleted by Red and Cas9 recombinant techniques in this study. At the same time, the glycosylation site that aff ected the formation of disulfi de bonds were changed based on the structure and glycosylation prediction analysis of CSFV-E2. Finally, suspension transfection was performed to increase the titer of rescued viruses. The results showed that 95% of the mutant E2 protein was in the form of homodimer. The expression level of E2 protein was increased about 4 times by optimizing donor plasmid and deletion of viral vector gene and the passages of the recombinant baculovirus strain with stable expression of protein was extended from P7 to P20. The titer of recombinant baculovirus obtained by suspension transfection increased by about 70 times, and suffi cient low viral passages were obtained, which eff ectively shortened the time from strain construction to protein expression and solved the problems of low protein production of baculovirus expression system and virus passages of strain seeds. Therefore, the successful construction of the gene deletion baculoviruses laid a foundation for the research and production of a subunit swine fever vaccine.Key words: Baculovirus; Classical swine fever virus; gene deletion; E2 proteinWANG Tongyan 1,2, TONG Xiaodan 1,2, SU Xiaorui 1,2, SONG Huanhuan 1,2, LI Weiguo 1,2, LIU Wujie 1,2,TAN Feifei 1,2, TIAN Kegong 1,2,3(1. National Research Center of Veterinary Medicine, Luoyang 471003, China; 2. PULIKE Biological Engineering, INC., Luoyang 471000,China; 3. Luoyang Putai Biotechnology Co., Ltd, Luoyang 471000, China)· 49 ·王同燕等：基因缺失杆状病毒载体的构建及应用第32卷第1期猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever Virus, CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，给中国和其他国家养猪业造成了严重危害，被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病之一[1]。
综述与专论生物技术通报BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N2010年第10期杆状病毒表达系统及其应用进展韦永龙 李轶女 张志芳 沈桂芳(中国农业科学院生物技术研究所,北京100081)摘 要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。
在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。
就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。
关键词: 杆状病毒 BEVS 表达Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste mW ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng(B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081)Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce bei ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e .K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on收稿日期:2010 04 26基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863∀计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约80-160kb 之间。
杆状病毒——一种新的哺乳类细胞传递基因载体贡成良;薛仁宇;曹广力【期刊名称】《蚕业科学》【年(卷),期】2004(30)3【摘要】在多角体蛋白基因启动子的控制之下 ,利用杆状病毒已有许多种重组蛋白在昆虫细胞中被表达。
许多常用细胞系以及原代培养细胞能被杆状病毒有效转染 ,但几乎观察不到细胞毒性。
在哺乳细胞中 ,用带有哺乳类细胞活性启动子元件的重组杆状病毒载体已成功地实现基因的瞬时和稳定传递 ,杆状病毒作为基因治疗外载体 ,能将目的基因传递给哺乳细胞 ,并直接对传递基因的表达产物产生专一性免疫反应 ;补体成份对杆状病毒向哺乳类细胞传递基因的效率有明显抑制作用 ,但假型杆状病毒对补体表现出抗性。
杆状病毒介导基因传递可评价启动子在不同细胞中的强度。
含有异源病毒基因组的杂交杆状病毒能发动病毒感染 ,并成功用于检验抗病毒药物的效果。
杆状病毒作为安全有效的专一性基因传递载体 ,有望在将来发展成更有效的新一代基因治疗载体。
【总页数】6页(P290-295)【关键词】杆状病毒;基因传递;载体;哺乳类细胞【作者】贡成良;薛仁宇;曹广力【作者单位】苏州大学农业科学与技术学院【正文语种】中文【中图分类】S881.2【相关文献】1.以杆状病毒作为基因治疗载体的一种新方法 [J], 陆爱丽;董东生;程康;伏爽;王德炳;侯纬敏2.以具有WPRE调控元件的杆状病毒为载体在鸡胚原代细胞中表达新城疫病毒F 基因 [J], 高冬妮;平文祥;金丽颖;沈万力;宋刚;唐晓艳;安琦;申燕;葛菁萍3.构建具有巨细胞病毒(CMV)启动子的杆状病毒高效表达载体并利用其在鸡胚原代细胞中表达eGFP基因 [J], 宋姗姗;葛菁萍;李梅;高冬妮;金丽颖;安琦;平文祥;楼庄伟4.长效稳定表达杆状病毒基因传递载体的构建及表达效率研究 [J], 王志昇;李梦婷;姬勇敢;杨文;杨丽;杨萌萌5.重组杆状病毒:一种新型哺乳动物细胞基因转移载体 [J], 彭伍平;仇华吉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010716613.0(22)申请日 2020.07.23(71)申请人 云舟生物科技（广州）有限公司地址 510000 广东省广州市广州高新技术产业开发区科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器（D区）D301-D309号房(72)发明人 施金秀 罗燕 林映君 蒙伟能 叶知晟 蓝田 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224代理人 戴志攀(51)Int.Cl.C12N 15/866(2006.01)C12N 5/10(2006.01)C12P 21/00(2006.01)(54)发明名称杆状病毒表达系统及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及一种杆状病毒表达系统及其构建方法和应用，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性，所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子，所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。
利用本发明的杆状病毒表达系统，可快速直接地提取得到一种能够直接用于下游杆状病毒包装的高纯度无污染的重组阳性杆状病毒载体。
权利要求书1页 说明书7页 附图3页CN 111808884 A 2020.10.23C N 111808884A1.一种杆状病毒表达系统，其特征在于，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性；所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子；所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。
2.根据权利要求1所述的杆状病毒表达系统，其特征在于，所述温敏型复制子为pSC101 ori、pBBR1MCS2-Ts复制子或RK2复制子。
S 132.32 Gamble HR,M urrell KD,M arti HP.Inoculation of pigs agai nstTr ichinella spiralis using larval excretory -secretory anti gens.Am J Vet Res,1986,47(11):2396-2399.33 e-l Shazly AM ,e-l Shewey K,e-l Hamshary E,et al.M ice immun -zation using crude Trichinella spiralis antigen.J Egypt SocParasitol,2002,32(2):391-403.34 王中全,崔晶.旋毛虫属分类的研究进展.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2002,20(5):310-314.35 M arinculic A,Gamble HR,Urban JF,et al.Immunity i n swineinoculated w ith l arvae or extracts of a pig isol ate and a sylvatic isolate of T richinella spir alis.Am J Vet Res,1991,52(5):754-758.36 Goyal PK,Bolas -Fernandez F,Wak elin D.Immunization of miceagainst T richinella spiralis and T.britov i using excretory and secretory antigens.J Helminthol,1997,71(2):109-112.(收稿日期:2004-02-27)#综述#杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体及其在医学中的应用胡少敏1,2 王海1 吴忠道1摘要 杆状病毒载体表达系统已被广泛用于在受纳昆虫细胞中大量表达外源蛋白。
近年的研究发现,这种表达载体还可用来介导外源基因投送至各种哺乳动物细胞,并且通过哺乳动物启动子的驱动使外源蛋白得到高效稳定的表达,而其自身基因组并不复制和表达。
同时,经过适当的修饰或预处理,杆状病毒表达载体还可介导外源基因在哺乳动物体内表达。
由于这种载体的容量大,感染、表达效率高,生物安全性好,因而在基因治疗、疫苗开发、药物筛选等医学各领域具有广泛的应用前景。
关键词 杆状病毒;哺乳动物细胞;蛋白表达作者单位:1.510089广州,中山大学基础医学院寄生虫学教研室;2.421001衡阳,南华大学生命科学学院生物技术实验中心E -mail:shaominh@杆状病毒具有高度的宿主特异性,其宿主主要有鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫,尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。
在杆状病毒的众多成员中,目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(A utogr apha calif onica multiple nu -clear polyhedrosis virus,AcMNPV)。
AcMNPV 的病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA,约130kb,其全基因组序列目前已测出[1]。
自1983年Smith 等首次报道利用AcMNPV 在草地贪夜蛾细胞成功地表达了人B -干扰素以来[2],杆状病毒表达载体系统作为一个新的研究领域迅速发展。
大量的外源基因通过杆状病毒表达载体系统获得了成功表达[3],其来源遍及病毒、细菌、真菌、植物和动物。
然而长期以来,由于其宿主特异性,这种高表达的载体仅限用于介导外源基因在其受纳昆虫细胞内表达,在非受纳细胞中却不能发挥作用。
而先前的研究认为,在非受纳昆虫细胞中,这种宿主特异性的产生并不是因为杆状病毒不能进入细胞,而是因为其基因不能在细胞内复制和表达[4]。
许多研究也发现,在哺乳动物细胞中,可能存在着同样的情况。
1983年,Volkman 等报道杆状病毒也能够侵入一些脊椎动物细胞系中,但病毒基因组并没有得到复制表达[5]。
随后Groener 和Tjia 等也分别报道了AcMNPV 可以侵入哺乳动物细胞,但同样也没有子代病毒产生[6,7]。
这些结果提示杆状病毒可能作为一种新型的基因表达载体将外源基因导入哺乳动物细胞内进行表达。
而且由于其自身的基因在哺乳动物细胞并不复制和表达,生物安全性高,因而随后的一段时间,在如何将外源基因重组到杆状病毒并使其在哺乳动物细胞有效表达方面做了许多探索。
1 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体1995年,Hofm ann 等[8]首次报道了将由巨细胞病毒极早期启动子(cytom egalovirus immediate early promoter,CM V -IE )驱动的萤光素酶基因重组至AcMNPV 基因组,并用此重组AcM NPV 感染几种不同的哺乳动物细胞,结果表明此重组AcM NPV 能感染原代人肝细胞且高效地表达了报告基因,其介导的报告基因的表达效率高于用磷酸钙沉淀法和脂质体转染法。
Boyce 等[9]也构建了一个包含有劳氏肉瘤病毒(rous sarcoma virus,RSV)启动子驱动的报告基因lac Z 和SV40转录终止信号的重组AcMNPV,此重组AcM NPV 介导的报告基因在人肝细胞系HepG2和鼠原代肝细胞中获得有效表达。
但在其他一些非肝脏来源的细胞系如K -562,COS -7,H L -6以及Hela 等中却表达很低或不表达。
此后,杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体系统不断地得到改进并被广泛地应用,可用于表达的宿主细胞系范围也不断扩大。
Shoji等[10]将一个强力复合启动子CAG(包含CMV-IE增强子,鸡B-肌动蛋白启动子和兔B-珠蛋白转录终止信号)重组至AcMNPV,用此重组AcM NPV介导的HCV结构蛋白基因不仅在肝脏起源细胞系而且在非肝脏起源细胞系H ela,Cple,Cos7等中得到高水平表达,其表达水平与腺病毒载体介导的相当。
Shoji等还发现杆状病毒表达载体介导外源基因表达时,其所能感染的宿主细胞范围与启动子种类有关,只要选择适当的启动子就可介导外源基因至相应的靶细胞中表达。
他设想选用一个具有普遍性的强启动子以构建可在不同细胞系中发挥作用的通用杆状病毒表达载体系统;选用特异性启动子则可使外源基因只在特定的靶细胞中表达。
此种设想在后来的实验中得到了证实[11-13]。
2杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中稳定表达除了介导的外源基因在哺乳动物细胞内瞬时表达外,Condreay等[12]报道杆状病毒载体也可用于筛选稳定表达的细胞系。
他们首先在杆状病毒基因组中插入两个由哺乳动物组成启动子驱动的表达盒。
一个为CMV-IE启动子/增强子驱动的绿色荧光蛋白基因,另一个为SV40启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因。
用此病毒感染不同细胞系并将细胞置于抗生素G418选择培养基中37e培养,结果获得了能稳定维持表达并高水平地表达报告基因的稳定细胞系,报告基因在其内表达至少维持了25代。
通过Southern印迹分析还发现在稳定的CH O细胞中存在至少有12kb的杆状病毒基因组片段,但尚不清楚是否整合到了宿主细胞基因组中。
此后,同一组研究人员[14]又报道通过mapping breakpoints、荧光原位杂交(FISH)分析以及doning viral/chromoso-mal junctions等方法发现重组杆状病毒以单拷贝小片段方式整合到了宿主细胞基因组中,片段大小从5kb至18kb不等,整合机制为非同源重组(illegit-i mate recombination)。
并且发现报告基因在CH O细胞系中表达时间达到了36代。
他们还指出,在维持外源基因在哺乳动物细胞中稳定表达方面,杆状病毒载体并不比其他基因投送(gene delivery)方式差。
Palombo等[15]构建了一个杂合杆状病毒。
该杂合杆状病毒含有由哺乳动物启动子驱动的表达盒,在表达盒两侧为腺伴随病毒反转末端重复序列ITRs,此ITRs为腺伴随病毒基因组在宿主细胞内复制和整合所不可缺少的元件。
用此重组体感染293细胞,结果发现表达盒位点特异地整合至293细胞的19号染色体上。
最近,H u等[16]还报道通过调整适当的感染策略以及在培养基中适当添加某些成分也可以使杆状病毒介导的基因在哺乳动物细胞中的表达时间延长。
3杆状病毒作为体内基因投送载体杆状病毒由于不能在哺乳动物细胞内复制,具有很高的生物安全性,因而还可以用来作为体内基因投送的载体。
Sandig等[17]首先在这方面进行了尝试。
他们将带有哺乳动物启动子驱动的报告基因的重组杆状病毒通过直接注射等多种方式导入大鼠和小鼠肝脏中,但并未检测到报告基因的转录或表达。
进一步的实验发现新鲜的血清能阻止病毒介导的基因投送至肝脏细胞系,而热灭活后的血清却无此现象。
用缺乏各种补体成分的血清进行实验,也没有阻止病毒的侵入[18]。
后来的研究者又发现运用抗C5抗体及可溶性的重组补体Ñ型受体也可保护病毒免遭失活[19],从而证实病毒失活的原因是补体经典途径。
目前针对此设计的一系列方案已使病毒介导的报告基因在不同动物体内得到了成功表达。
如Sarkis等[20]在给小鼠注射重组病毒前一天预先给其注射补体抑制剂眼镜蛇毒因子(cobra ven-om factor,CVF),使绿色荧光蛋白在小鼠大脑神经细胞中得到表达。
H user等[21]则通过将补体调节蛋白衰亡加速因子(DAF)重组至AcMNPV包膜蛋白gp64上构成融合蛋白,用此重组AcM NPV成功介导了外源基因在体内表达。
T ani等[22]通过在AcMNPV gp64上重组疱疹性口炎病毒G蛋白(vesicular stom atitis virus G protein,VSV-G)也获得了同样的效果。
在杆状病毒用于体内基因投送上还面临一个问题,即如何增加它的纯度和浓度。
常规的方法是超速离心,但超速离心常使病毒集聚在一起而不便使用。
Barsoum等[23]曾报道运用一种阳离子交换层析来浓缩病毒,在这种方法中,病毒先结合到树脂上,然后再用生理缓冲液将其洗脱下来。
4杆状病毒进入哺乳动物细胞的机制杆状病毒已被证实可进入很多哺乳动物细胞内并介导外源基因的高效表达。
其进入哺乳动物细胞的确切机制还不十分明确,现在趋向于认为这可能也是通过受体介导的内吞作用。
先前的研究已经证实杆状病毒进入昆虫细胞是通过受体介导的内吞作用,然后通过其包膜与内吞体膜发生pH依赖性融合,使核衣壳释放至细胞质中[24,25]。
Hofmann等[8]用不同感染复度(multiplicity of infection,MOI)的AcMNPV-巨细胞病毒极早期启动子(CM VL)感染Huh7细胞,结果发现报告基因的表达随着MOI的增加而增加,但达到一定程度后,增加病毒的M OI 报告基因活性却不再增加。
