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柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成马定远 陈 君 李 萍3胡卓逸(中国药科大学生药药用植物教研室,南京210038)(中国药科大学生化研究室,南京210009)摘 要 报道了多糖中单糖组成的柱前衍生化高效液相色谱测定方法。
采用反向高效液相色谱250nm 紫外检测和使用梯度洗脱,6种还原单糖的12苯基232甲基252吡唑啉酮衍生实现了良好的分离并具有良好的峰形。
对单糖组成的定量测定进行了方法学考察,建立了单糖组成分析的数据分析方法,并用所建立方法对一个多糖中的单糖组成进行了分析,获得良好的重复性。
关键词 单糖,多糖,衍生化,高效液相色谱 2001207204收稿;2002201209接受1 引 言单糖的组成分析是糖分析中的一项重要内容。
已有的糖组成分析方法以气相色谱法和高效液相色谱法为主。
由于单糖分子的多样性,关于糖的分析方法仍在不断发展。
12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP )衍生化方法自运用以来,得到不断完善1～3。
Strydom 运用此法对中性、酸性和碱性醛糖进行了分析,可以使15种单糖得到很好的分离2。
本文首先建立了6种常见单糖(包括一种酸性糖)的分离模式,通过内标法对3种中性单糖的定量进行了方法学考察,并应用所建立的方法对多糖中的单糖进行了组成分析,为此法的更好运用提供了依据。
2 实验部分2.1 仪器与试剂HP1100型高效液相色谱系统,包括G 1312A 二元泵,G 1315A DAD 检测器,HP ChemStation 色谱工作站(Hewlett 2Packard )。
衍生化试剂12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP ,上海化学试剂采购供应站试剂厂),甲醇重结晶两次。
色谱用乙睛(T edia )、三氟乙酸(CP 级,上海化学试剂公司)。
单糖对照品:葡萄糖(G lc ,上海化学试剂公司)、甘露糖(Man ,Sigma 公司)、半乳糖(G al ,Sigma 公司)、鼠李糖(Rham 公司)、葡萄糖醛酸(G lcUA )和木糖(Xyl )(上海化学试剂二厂产品)。
![一种高分子量银耳多糖的提取及制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/c09a82f0ba4cf7ec4afe04a1b0717fd5360cb28c.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110104393.0(22)申请日 2021.01.26(71)申请人 焦点生物医药有限公司地址 273100 山东省济宁市曲阜市陵城高新技术产业开发区(72)发明人 刘磊 张俊停 康传利 李庆 屈爱存 李焕成 杜帅 刘蔷 张美霞 廉少杰 李庆攀 汤丽伟 (74)专利代理机构 济宁汇景知识产权代理事务所(普通合伙) 37254代理人 朱培(51)Int.Cl.C08B 37/00(2006.01)(54)发明名称一种高分子量银耳多糖的提取及制备方法(57)摘要本发明公开了一种高分子量银耳多糖的提取及制备方法，属于生物活性物质提取技术领域，其特征在于包括破壁工序和除蛋白工序；除蛋白工序之后还包括提取工序、分离工序、浓缩工序和纯化工序；本发明的有益效果是：利用几丁质酶进行破壁处理，去除细胞壁的同时能够有效地保留具有生物活性的完整细胞膜即原生质体，将含有银耳多糖和缠绕在银耳多糖上的糖蛋白均隔离在原生质体内，鞣酸或三氯乙酸能够顺利通过细胞膜，作用缠绕在银耳多糖上的糖蛋白，将糖蛋白变性后与银耳多糖脱离；而分离后的银耳多糖水溶性的特性能够顺利通过细胞膜到细胞膜外，达到了将糖蛋白变性后与银耳多糖分离的目的，保证了银耳多糖高收率和低蛋白杂质。
权利要求书1页 说明书4页CN 112724273 A 2021.04.30C N 112724273A1.一种高分子量银耳多糖的提取及制备方法，其特征在于包括破壁工序和除蛋白工序；所述破壁工序指将银耳粉末加入水中，然后加入几丁质酶进行破壁处理，获得具有银耳菌体原生质体的处理液；所述除蛋白工序指将鞣酸或三氯乙酸加入处理液中，得到含有银耳多糖的悬浊混合液。
2.根据权利要求1所述的高分子量银耳多糖的提取及制备方法，其特征在于所述破壁工序反应温度为38‑40℃，所述鞣酸或三氯乙酸的添加量为处理液质量的0.2‑0.3‰；所述含有银耳多糖的悬浊混合液为银耳多糖溶液和包裹有糖蛋白的银耳菌体原生质体的混合物。
柱前衍生化高效液相色谱法分析9种多糖中的单糖组成王媛媛;张晖;杨俊松;宗智慧【摘要】Objective To establish a precolumnderivatization procedure with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone ( PMP )-high performance liquid chromatography ( HPLC ) method for the determination of the monosaccharide composition of nine polysaccharides.Methods The nine polysaccharides were hydrolyzed, derivatized by PMP and analyzed by HPLC with the Inertsil ODS-SP C18 column(260mm ×4.6mm,5μm).The mobile phase was the 20%triethylamine-buffer solution withKH2PO4(pH=6.9),and the flow rate was 1.0 ml/min.The UV absorbance was detected at a wavelength of 254 nm,and the injection volume was 10μl with the column temperature 30℃.Results The method was successful in the separation of the mixture monosac-charide standards.The calibration line of each monosaccharide had a good relationship.And the precision, stability and reproducibility were also good.The nine polysaccharides were composed of different monosac-charide and the contents had some difference.Conclusion The method was accurate and stable for the deter-mination of the monosaccharide composition and content of nine polysaccharides.%目的：建立1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（ PMP）柱前衍生化-高效液相色谱法（ HPLC）对甘草多糖等9种多糖的单糖组成成分进行分析。
Open Journal of Nature Science 自然科学, 2018, 6(3), 230-236Published Online May 2018 in Hans. /journal/ojnshttps:///10.12677/ojns.2018.63033Extraction and Antioxidation ofPolysaccharide from Tremella fuciformisYing Li, Min Lv, Shilong Cang, Dongyu Hou, Shaoyi Yu, Xinjun ZhuCollege of Life Science, Dezhou University, Dezhou ShandongReceived: May 10th, 2018; accepted: May 24th, 2018; published: May 31st, 2018AbstractTremella polysaccharides were extracted from Tremella dry sample using ultrasonic extraction method. The effect of material to liquid ratio, temperature and time on the extraction efficiency was investigated, and the results showed that the optimum ratio was 1:40, the temperature was 60˚C and the extraction time was 30 min. The antioxidant activity of Tremella polysaccharides was investigated using 2,2’-Azino-bis(3-ethyl benzothiazo line-6-sulfonic acid)(ABTS)asradical model.The results showed that Tremella polysaccharides extracted via ultrasonic extraction method had obvious antioxidant activity.KeywordsTemella Polysaccharides, Ultrasonic Extraction, Antioxidant银耳多糖的提取及抗氧化的探究李颖，吕敏，仓世龙，侯冬玉，于少艺，朱新军德州学院生命科学学院，山东德州收稿日期：2018年5月10日；录用日期：2018年5月24日；发布日期：2018年5月31日摘要以银耳干品为实验材料，研究了超声提取法对银耳多糖提取效率的影响。
柱前衍生化HP LC 分析白花蛇舌草多糖中单糖组成宝炉丹, 徐国防, 马 郑, 郭 娜, 郭兴杰3(沈阳药科大学,辽宁沈阳110016)收稿日期:2007202210作者简介:宝炉丹(1981～),女(蒙古族),硕士。
3通讯作者:郭兴杰(1956～),女,教授,博士生导师,主要从事体内药物分析工作,Tel:024*********,E 2mail:gxjhyz@yahoo 。
关键词:白花蛇舌草多糖;柱前衍生化;高效液相色谱法;单糖摘要:目的:采用微波提取法提取不同产地白花蛇舌草水溶性多糖,并对多糖的含量及组成进行研究。
方法:以苯酚2硫酸法测定总糖含量,柱前衍生化高效液相色谱法鉴别和测定其多糖的单糖组成。
结果:不同产地药材中多糖含量以广东最高,白花蛇舌草多糖是由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及甘露糖组成的杂多糖。
结论:柱前衍生化高效液相色谱法分析白花蛇舌草多糖中单糖组成方法简便,快速,准确。
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:100121528(2008)0320406203Ana lysis of polys acchar i de com positi on of H edyotis difusa W illd polys accar i des by pre 2column der i va ti za ti on HPLCBAO Lu 2dan, XU Guo 2fang, MA Zheng, G UO Na, G UO Xing 2jie(Shenyang Phar m aceutical U niversity,Shenyang 110016,L iaoning,China )KE Y WO R D S :Hedyotis difusa W illd polysaccharide;p re 2colu mn derivatizati on;high perf or mance liquid chr oma 2t ogaphy;monosaccharideABSTRACT:A I M :The polysaccharides of Hedyotis difusa W illd of different s ources were extracted and its con 2tent and co mpositi on of the polysaccharide was analyzed .M ETHOD S :The m icr owave was e mp l oyed for the aque 2ous extract of Hedyotis d ifusa W illd and the content of t otal sugar was deter m ined by phenol 2sulfur test,the mono 2saccharides compositi on was deter m ined by HP LC with p re 2column derivatizati on .RESU L TS :The polysaccharide obtained fr om the sa mp les of Guangdong Pr ovince had the highest content .The analytic data showed that the com 2positi on of monosaccharides in hydr olytic polysaccharides of Hedyotis d ifusa W illd were mannose,glucose,galac 2t ose,arabinose and rha mnose,the average content of polysaccharides was 9.82%.CO NCL US I O N :The HP LC method with p re 2column derivatizati on is app r op riate f or the analysis of monosaccharide compositi on of Hedyotis di 2fusa W illd polysaccharides and the method is si m p le,quick and accurate . 白花蛇舌草(Hedyotis difusa W illd )为茜草科耳草属植物,味甘淡、性凉,具清热解毒,活血消痈之功效,其多糖具有明显的增强机体免疫能力和抑制肿瘤的作用[1,2]。
银耳多糖单糖组成分析的三种色谱方法比较韩威1，姜瑞芝2，陈英红2，高阳3，高其品3*（1．延边大学，吉林延吉133002；2．吉林省中医药科学院，吉林长春130012；3．长春中医药大学，吉林长春130117）摘要：为选择一种准确快捷的方法测定银耳多糖的单糖组成，对薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）三种色谱方法进行比较。
结果表明，前两种方法的测定结果均不理想，而HPLC法，操作简便，灵敏度高，分离效果好，信息完整。
测定结果为由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖、岩藻糖组成，其摩尔比为0.24：1.00：0.06：0.29：0.25。
HPLC法对酸性杂多糖组成糖分析是一种比较理想的选择。
关键词：银耳多糖；单糖组成；TCL；GC；HPLCComparison of three kinds of chromatographic methods for monosaccharide composition analysis of Tremella polysaccharideHan Wei1, Jiang Rui-zhi2, Chen Ying-hong2, Gao Yang3, G ao Qi-pin3*(1. Yanbian University, Yanji 133002, China; 2. Academy of Traditional Chinese Medicine and Material Medical of Jilin Province, Changchun 130012, China; 3. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)Abstract：To find an accurate and fast method to determine the monosaccharide composition of Tremella polysaccharide, thin layer chromatography (TLC), gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) was compared. The results of TLC and GC were not significant. However, HPLC was a simple method, showed high sensitivity, good resolution and integrity information. The result of HPLC analysis showed that the monosaccharide composition were Glc, Man, GlcA, Xyl and Fuc, with the mole percentage of 0.24:1.00:0.06:0.29:0.25. Consequently, HPLC is the most suitable method for monosaccharide composition analysis.Key words：Tremella polysaccharide; monosaccharide composition; TLC; GC; HPLC 银耳（Tremella fuciformis Berk）是真菌类银耳科银耳属植物，也叫白木耳，基金项目：十一五国家科技重大专项（No. 2009ZX09103-333）；国家自然科学基金（No. 30873370）*通讯作者Tel：（0431）86172070；E-Mail：gaoqipin@在我国有悠久的药食兼用历史，具有增强人体免疫力的作用。
柱前衍⽣化HPLC法分析沙参多糖中单糖组成收稿⽇期:2008204225作者简介:任浩娜(19762),⼥(汉族),辽宁沈阳⼈,硕⼠研究⽣,E 2m a il renhaona76@163.co m;毕开顺(19562),男(汉族),河北唐⼭⼈,教授,主要从事中药分析和中药质量控制研究,T el .024*********。
⽂章编号:100622858(2009)0320206204柱前衍⽣化HPLC 法分析沙参多糖中单糖组成任浩娜,陈晓辉,毕开顺,张晖芬(沈阳药科⼤学药学院,辽宁沈阳110016)摘要:⽬的建⽴北沙参多糖中单糖的组成和含量的检测⽅法。
⽅法以三氟⼄酸⽔解沙参多糖,⽔解产物加⼊衍⽣化试剂12苯基232甲基252吡唑酮(P M P)⽣成衍⽣化产物,采⽤R P 2HPLC 法,⾊谱柱:C 18⾊谱柱(250mm @4.6mm,5L m ),流动相:体积分数为19%的⼄腈溶液2醋酸铵缓冲液(醋酸铵2冰醋酸,p H 5.5,体积⽐为100B 1),等度洗脱,流速:1.0mL #m i n -1,检测器:紫外检测器,检测波长:250n m,柱温:35e 。
结果沙参多糖由D 2⽢露糖、D 2⿏李糖、半乳糖醛酸、D 2葡萄糖、D 2半乳糖、L 2(+)2阿拉伯糖等8种单糖(有2种未鉴定出的单糖)组成。
D 2⽢露糖、D 2⿏李糖、半乳糖醛酸、D 2葡萄糖、D 2半乳糖、L 2(+)2阿拉伯糖的线性分别为4~80L m ol #L -1(r =0.9990)、12~240L mol #L -1(r =0.9990)、5.6~1.12@103L m ol #L -1(r =0.9994)、1.54@103~30.80@103L m ol #L -1(r =0.9990)、80.0~1.6@103L m ol #L -1(r =0.9990)、64.00~1.28@103L mol #L -1(r =0.9992);平均加样回收率分别为94.0%、88.5%、93.9%、95.9%、89.2%、90.8%。
柱前衍生HPLC 分析银耳多糖的单糖组成颜军1，2，侯贤灯1，徐开来1（1．四川大学化学学院，四川成都610064；2．成都大学中药化学实验室，四川成都610106）摘要：建立1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP ）柱前衍生高效液相色谱法分离检测5种单糖的方法。
根据单糖PMP衍生物的峰面积大小，对衍生化反应中反应时间、PMP 与NaOH 的量、中和温度和盐酸用量进行了考察，从而得到较佳的衍生化样品制备条件。
以20mmol·L -1磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，考察了pH 值和乙腈体积分数对糖衍生物分离的影响，确定最佳pH 值为6.72，最佳乙腈体积分数为18%，并将该方法应用于银耳酸性多糖的单糖组成的测定。
关键词：单糖；多糖；高效液相色谱；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮中图分类号：S567.3+4；TS247文献标识码：A文章编号：1674-5124（2011）01-0044-03Analysis of monosaccharide compositions in tremella polysaccharides by pre-columnderivatization high performance liquid chromatographyYAN Jun 1，2，HOU Xian-deng 1，XU Kai-lai 1（1.College of Chemistry ，Sichuan University ，Chengdu 610064，China ；boratory for Chemistry of Traditional Chinese Medicine ，Chengdu University ，Chengdu 610106，China ）Abstract:A method of PMP pre -column derivatization high performance liquid chromatographic was established for analysis of five kind of monosaccharide.The optimum conditions of derivatization were determined by studying the quantity of PMP and sodium hydroxide ，reaction time ，reaction temperature and hydrochloric acid consumption during neutralization.Under theoptimum mobile phase which was 18%acetonitrile-phosphate buffer（20mmol ·L -1，pH 6.72），PMP derivatives can be separated successfully.This method was applied to monosaccharide compositionsanalysis of tremella polysaccharide （TPP2）.Key words:monosaccharide ；polysaccharide ；HPLC ；PMP收稿日期：2010-04-20；收到修改稿日期：2010-08-03基金项目：四川省中医药管理局科技专项资助项目（2008-01）作者简介：颜军（1971-），男，四川成都市人，高级实验师，主要从事生物活性成分的分离与检测工作。
1引言银耳在我国已有悠久的药用和食用历史。
近年来，对银耳的化学成分及药理活性所进行的研究和大量的现代药理证明，多数药理活性都与银耳多糖有关，特别是酸性银耳多糖。
成都大学中药化学实验室对银耳多糖进行了分离纯化，得到了酸性银耳多糖纯品TPP2[1]。
而多糖的单糖组成测定则是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的重要环节。
由于单糖分子的多样性，关于糖的分析方法仍在不断发展。
单糖组分的色谱分离测定方法目前主要有高效液相色谱法（HPLC ）[2-3]、气相色谱法（GC ）[4-5]、薄层色谱法（TLC ）[6]等。
采用GC 测定糖类，由于糖本身没有足够的挥发性，所以必须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发、热稳定性较强的衍生物，分析过程较为复杂。
另外，在糖衍生物的制备过程中，又常会产生衍生物的异构体，在色谱分析时每种糖可能会产生几个峰，这往往影响组分的分离和定量测定。
采用HPLC 分析单糖组成的难点在于单糖本身没有紫外吸收，人们常将多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色谱法分离和检测，以改善其分离选择性和提高检测灵敏度。
在众多的衍生化方法中，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP ）柱前衍生化高效液相色谱法因反应条件较温和、产物无立体异构、紫外检测灵敏度较高，得到较为广泛的应用[7]。
该文选取PMP 作为柱前衍生化试剂，用高效液相色谱法分离检测5种单糖，通过对衍生化条件的考察以及色谱分离条件的选取，建立了银耳多糖的单糖组成分离测定方法，具有较好的实用意义。
第37卷第1期2011年1月中国测试CHINA MEASUREMENT &TEST Vol.37No.1January ，2011第37卷第1期2实验部分2.1仪器与试剂日立LC-2000高效液相色谱仪，包括L-2130二元泵，L-2450DAD检测器。
衍生化试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），纯度99%（美国Acros Organics公司）；乙腈（色谱纯，成都科龙化工试剂厂）；盐酸（国药集团化学试剂有限公司）。
单糖标准品：葡萄糖（Glc，99%）、甘露糖（Man，99%）、半乳糖（Gal，≥99%）、鼠李糖（Rham，≥99%）、木糖（Xyl，98%）均购于上海化学试剂公司；超纯水；其他试剂均为分析纯。
银耳酸性多糖TPP2由成都大学中药化学实验室自制[1]。
2.2混合单糖标样的衍生分别取200μL的混合单糖标准液（各单糖摩尔浓度均为1mmol·L-1）与120μL的0.25mol·L-1NaOH 溶液，加120μL0.50mol/L的PMP甲醇溶液，置于5mL的具塞试管中漩涡混匀；在70℃水浴中反应90min；取出置冷水浴中10min；加120μL0.30mol·L-1的HCl中和；再加2mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。
将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。
2.3样品制备吸取1mL质量浓度为4～5g·L-1的多糖样品溶液于安瓿瓶中，加入100μL的2.00mol·L-1H2SO4，充N2封管，110℃烘箱中水解2h[3]。
冷却后，NaOH溶液中和至中性，然后按“2.2”法进行衍生化反应。
2.4色谱条件色谱柱：大连江申C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相：20mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.72）-乙腈（ν∶ν为82∶18）；柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1mL·min-1；进样体积：20μL。
3结果与讨论3.1流动相pH及乙腈体积分数对分离的影响反相分离单糖PMP衍生物时，常以缓冲液-乙腈为流动相。
该文首先考察了乙腈比例（15%、18%、21%）对上述5种单糖在C18柱上的保留值及分离效果的影响。
结果显示，15%乙腈时半乳糖和木糖衍生物出峰太迟且峰较宽；21%乙腈时甘露糖衍生物峰与PMP峰重叠无法分开，同时半乳糖和木糖衍生物峰的分离也不佳；而乙腈的体积分数为18%时分离较好（见图1）。
此外，缓冲液的pH对糖衍生物的分离也是一重要的影响因素。
实验进一步考察了醋酸缓冲液（pH5.43）和磷酸缓冲液（pH6.72）对各种糖衍生物的保留值及分离效果的影响。
结果表明，采用pH为6.72的磷酸缓冲液时分离效果最佳，分析时间较短，出峰间距较均匀。
因此，确定流动相为磷酸盐缓冲液（pH6.72）-乙腈（ν∶ν为82∶18）。
该文方法不需梯度洗脱即可同时实现5种单糖衍生物的分离，且分离效果较好。
3.2PMP与NaOH的量对衍生化反应的影响在衍生化反应中，为了保证单糖完全反应，一般采用PMP的量大大超过理论所需量。
实验中，取200μL的混合单糖标准液（各单糖浓度均为1mmol·L-1）加120μL0.50mol·L-1的PMP甲醇溶液，控制PMP 的量为混合单糖总量的60倍；然后分别加入30μL，60μL，90μL，120μL，200μL的0.25mol·L-1NaOH 溶液，按“2.2”条件制备样品。
色谱分析结果表明，NaOH溶液加入量为120μL时各种糖的PMP衍生产物的峰面积均为最大值，故确定NaOH溶液加入量为120μL。
3.3衍生化反应时间的选择在其他条件（如“2.2”所述）相同情况下，将混合单糖标样分别采用30min，60min，90min，120min的反应时间进行衍生化反应，考察衍生化糖峰的峰面积大小变化。
结果表明，反应时间为90min时，各种糖的PMP衍生产物的峰面积均为最大值，故衍生化反应时间选为90min。
3.4中和温度的影响由于在衍生化反应中PMP大大过量且在色谱分离中有一定的影响[2]，所以衍生反应完成后，需要图1衍生样品色谱图mAU4020010203040123456at/min（a）标准单糖的色谱图mAU2040010203040t/min123456b（b）TP2水解样的色谱图1.PMP；2.甘露糖；3.鼠李糖；4.葡萄糖；5.半乳糖；6.木糖颜军等：柱前衍生HPLC分析银耳多糖的单糖组成45中国测试2011年1月用氯仿萃取去除过量的PMP。
但糖的PMP衍生产物的化学结构中含有碱性基团，在pH值较高时不解离，因而易被氯仿萃取而损失，所以在萃取前应中和反应体系中的碱。
在文献[7]中一般都采用冷却至室温。
在实验进行中发现室温是一个很不确定的温度，比如夏季与冬季的室温差在20℃以上，这个差异导致了中和反应衍生化产物的不稳定，对样品分析和含量测定产生了很大的影响。
因此，对静置冷却至室温（体系实测温度为32℃）与用冷水浴冷却10min （体系实测温度为12℃）两个中和温度条件进行了比较。
实验结果表明，冷水浴冷却10min后中和的温度条件的色谱分析效果非常好，而室温冷却的色谱分析效果很差。
主要表现在单糖衍生物峰面积大幅减小和死时间附近的有色物质峰面积大大增加。
这是因为单糖衍生物不稳定，在较高温度条件下中和，由于酸的影响产生了部分衍生化不完全产物，导致单糖衍生物峰面积减小。
