溶菌酶的纯化以及活性鉴定

溶菌酶的分离纯化综合设计性实验要求请根据你所学的酶分离纯化方法或生化手段，设计一套从鸡蛋中分离纯化溶菌酶的综合性实验方案并写出具体实施内容。

实验内容包括：1. 溶菌酶分离纯化，包括粗提和精提；2. 不同纯度溶菌酶活力测定；3.测定蛋白质浓度；4.测定溶菌酶分子量。

实验方案形式（参考）：实验项目一（如酶的提取）溶菌酶又称胞壁质酶或N－乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种国内外很紧俏的生化物质，广泛应用于医学临床。

具有多种药理作用，能抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等，有抗菌的作用，常用于治疗五官科多种粘膜炎症、皮肤科带状疱疹等疾病。

是优良的天然防腐剂，可用于食品的防腐保鲜。

尤其重要的是近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。

随着生物工程的发展，提取溶菌酶具有重要的战略意义。

一、实验目的和内容掌握从鸡蛋清中提取溶菌酶的基本方法了解溶菌酶的基本行知二、实验仪器与试剂玻璃或陶瓷容器、pH计、细纱布、玻璃搅棒、胶头滴管、布氏漏斗等氯化钠、醋酸、氢氧化钠。

以上原料均选用化学纯试剂。

三、实验步骤(1)收集鸡蛋清：将新鲜鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出(最好是新生的鸡蛋、pH值不得低于8，否则不能使用)，按其体积的两倍量加入水，轻轻搅拌5分钟，使蛋清溶液的稠度均匀，注意在搅拌过程中不能起泡，搅拌不宜过快，搅拌棒应光滑等，以防蛋白质变性而影响溶菌酶产品的得率及质量，最后用双层细纱布滤除蛋清溶液中的脐带块及碎蛋壳等。

(2)加入氯化钠：按每100毫升蛋清溶液加入2克氯化钠的比例，向蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。

(3)粗制溶菌酶：加完氯化钠细粉后，再用1摩尔／升的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的pH值调节到10.8，在用氢氧化钠溶液调节蛋清溶液的pH值，用胶头滴管将其逐滴滴入并不断搅拌，以免局部过碱而导致蛋白质的变性，从而影响溶菌酶的得率和质量。

一、实验目的1. 掌握植物溶菌酶的提取方法。

2. 学习溶菌酶的分离纯化技术。

3. 了解溶菌酶的活性测定方法。

4. 探讨植物溶菌酶在生物工程领域的应用前景。

二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于植物、动物和微生物中的胞壁质酶，具有降解细菌细胞壁的能力。

植物溶菌酶主要存在于植物细胞的液泡、细胞壁和细胞质中。

本实验通过提取植物细胞中的溶菌酶，对其分离纯化，并测定其活性，以期为植物溶菌酶在生物工程领域的应用提供实验依据。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片、提取液（pH 7.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液，1% PVP）、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝R-250染色液、活性测定试剂盒等。

2. 实验仪器：高速离心机、低温冰箱、电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计等。

四、实验方法1. 植物溶菌酶粗提取（1）取新鲜植物叶片，用去离子水冲洗干净，剪碎。

（2）将植物叶片与提取液以质量体积比1:10混合，室温下匀浆。

（3）将匀浆液于4℃下离心（12,000 r/min，30 min）。

（4）取上清液作为植物溶菌酶粗提液。

2. 植物溶菌酶分离纯化（1）取植物溶菌酶粗提液，加入一定量的硫酸铵溶液，使蛋白质盐析。

（2）将盐析后的溶液于4℃下离心（12,000 r/min，30 min）。

（3）取沉淀，用pH 7.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，进行SDS-PAGE电泳分析。

（4）根据电泳结果，选取目的蛋白所在位置，切取凝胶。

（5）将凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，观察蛋白条带。

（6）根据蛋白条带，将目的蛋白进行洗脱、复溶于缓冲液。

3. 植物溶菌酶活性测定按照活性测定试剂盒说明书进行操作，测定植物溶菌酶的活性。

4. 植物溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）将分离纯化的植物溶菌酶进行SDS-PAGE电泳分析。

（2）根据电泳结果，计算植物溶菌酶的纯度。

（3）根据电泳结果，结合标准蛋白分子量，计算植物溶菌酶的分子量。

生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。

二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。

三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。

凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。

四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。

未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。

五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。

六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。

七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。

预习报告（手写，可自行续页）实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。

1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。

溶菌酶的提取分离和纯化实验报告生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。

二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。

三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。

凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。

四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。

未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。

五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。

六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。

七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。

预习报告（手写，可自行续页）溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定名称实验目的和要求：实验材料：主要仪器：主要步骤：教师签名：时间：实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。

1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。

一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取、分离和纯化方法。

2. 掌握酶活性测定和蛋白质浓度测定技术。

3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。

二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种胞壁质酶，具有破坏细菌细胞壁的能力。

本实验采用鸡蛋清为原料，通过提取、分离和纯化等步骤，制备高纯度的溶菌酶。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋清- 酶活性测定试剂盒- 蛋白质浓度测定试剂盒- 溶菌酶纯度鉴定试剂盒- 分子量测定试剂盒2. 实验仪器：- 低温高速离心机- 酶标仪- 荧光分光光度计- 凝胶电泳仪- 凝胶成像系统四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡蛋清，加入适量的生理盐水，搅拌均匀。

（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取上清液。

（3）用酶活性测定试剂盒检测上清液中的溶菌酶活性。

2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液，加入适量的硫酸铵，使蛋白质沉淀。

（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取沉淀。

（3）将沉淀用生理盐水溶解，加入适量的G-25凝胶柱，进行凝胶过滤。

（4）收集洗脱液，用酶活性测定试剂盒检测洗脱液中的溶菌酶活性。

3. 溶菌酶纯度鉴定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入溶菌酶纯度鉴定试剂盒，进行电泳分析。

（2）观察电泳图谱，鉴定溶菌酶的纯度。

4. 溶菌酶分子量测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入分子量测定试剂盒，进行SDS-PAGE电泳分析。

（2）观察电泳图谱，计算溶菌酶的分子量。

5. 溶菌酶活性测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入酶活性测定试剂盒，进行酶活性测定。

（2）记录酶活性值。

6. 溶菌酶蛋白浓度测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入蛋白质浓度测定试剂盒，进行蛋白浓度测定。

（2）记录蛋白浓度值。

五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取上清液中溶菌酶活性为XX单位/mL。

2. 溶菌酶分离纯化洗脱液中溶菌酶活性为XX单位/mL。

3. 溶菌酶纯度鉴定电泳图谱显示，溶菌酶的纯度为XX%。

一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。

2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法。

3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定。

二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，具有分解细菌细胞壁的能力。

本实验通过提取鸡蛋中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 氯化钠- 醋酸铵- 酒精- 乙醚- 磷酸盐缓冲液- 离心机- 电泳仪- 超声波清洗器- 蛋白质定量仪- 分光光度计2. 实验试剂：- 氯化钠溶液- 醋酸铵溶液- 酒精溶液- 乙醚溶液- 磷酸盐缓冲液- 蛋白酶抑制剂四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄和蛋白，混合均匀。

- 将混合液用氯化钠溶液调至pH 7.0，室温下搅拌30分钟。

- 用纱布过滤混合液，收集滤液。

2. 溶菌酶的分离纯化- 将滤液用醋酸铵溶液调至pH 4.5，室温下搅拌30分钟。

- 用纱布过滤混合液，收集滤液。

- 将滤液加入等体积的酒精溶液，室温下静置过夜。

- 用纱布过滤混合液，收集沉淀。

- 将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤三次，收集洗涤液。

3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 将洗涤液用超声波清洗器处理30秒，使溶菌酶充分溶解。

- 用分光光度计测定洗涤液的蛋白浓度。

- 将洗涤液稀释适当倍数，进行酶活力测定。

4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 将洗涤液进行SDS-PAGE电泳，比较样品与标准蛋白的迁移率。

- 根据迁移率计算溶菌酶的分子量。

五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 滤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从鸡蛋中提取出来。

2. 溶菌酶的分离纯化- 酒精沉淀法可以有效地将溶菌酶与其他蛋白分离。

- 洗涤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从沉淀中分离出来。

3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 洗涤液的蛋白浓度为1.5mg/mL。

- 酶活力为100 U/mL。

4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 电泳结果显示，样品与标准蛋白的迁移率一致，说明溶菌酶已达到纯化。

一、 溶菌酶的提取纯化
实验日期：2012-10-18
1、 溶菌酶洗脱曲线的制作：
（2）绘制洗脱曲线：
以OD280值为纵坐标，对应中间体积值为横坐标，绘制曲线：
00.25
0.50.7511.25
1.51.7520
3
6
9
12
15
18
21
24
27
二、蛋白含量＆酶活性的测定
实验日期：2012-10-19
根据上表数据，绘制标准曲线：
标准曲线
00.10.20.30.40.50.60.70
10
20
30
40
50
60
OD595
所以直线回归方程：y=0.0101x+0.0573
5
6
（1）从上面数据得出，蛋清的蛋白浓度比提取物的高，但其活性和比活性都比提取物的低。

而且提取物的纯化倍数比较高，为5.44。

（2）酶的活力表示为特定条件下单位时间内转化底物的速度，而细菌悬液的光吸收值的减少速度可以推测酶的活性。

试验过程中，每15 s记录1 次测定管的吸光度值，在15 s 至75 s 之间测定管吸光度值以稳定速度下降，因此对于酶的活性测定，单位时间应选择为15 s 至75 s。

（3）对于这次试验，在操作上我们存在明显的不足，如下：
A．标准曲线上，有两个数据点比较偏离，可能我们测定这两个数据点的OD值时润洗操作未能做到位，导致误差的出现。

B．酶活性的测定上也同样存在一定的误差，例如：平行测3次，但每次的吹打效果不一样，o秒时的OD值不太一致，可能造成不同程度的偏差！。

溶菌酶的提纯结晶和活力测定姓名：学号：班级：指导老师：一、实验前言1.实验背景溶菌酶（lysozyme）是一种能够水解细胞壁成分中N- 乙酰胞壁酸与N- 乙酰葡萄糖胺之间的β- 1，4 糖苷键的酶，被广泛应用于医药、食品工业、生物工程等方面，现从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶已达到工业化生产水平。

蛋清中的溶菌酶含量越高，酶活力越强，越有利于鸡蛋的保存，因此测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工有重要的指导作用，也为蛋品质评定提供了一个重要参数。

活力测定的基本原理是用一种细菌悬液作为基质,加入待测标本后保持一定时间,如样品中含有溶菌酶则细菌被溶解,即其细胞壁不溶性多糖变成可溶性粘肤。

测定方法很多:如平皿测定法、光电比浊法、粘度测定法、分解产物测定法(因为底物往往过量,通常不用底物)、化学滴定法、分光光度法及同位素技术,其中以平皿测定法和比浊法最为常用。

溶菌酶分布很广,而且不是单独存在的,往往是和许多因子共同作用、相互协调。

同时,可以直接或间接地通过酶的分解产物而起作用。

在这里许多问题正处于摸索阶段,有些方面通过特定的实验,预测其应用。

而这些特定的实验往往对某种或某一个动物而言,还有其局限性。

未定论的问题很多,许多应用尚未大面积使于临床,但是溶菌酶必将越来越引起人们的重视,特别是其广布于人体,在医药、科研方面的作用尤为重要.(l)抗菌溶菌酶不但作用于革兰氏阳性细菌,而且它作为一种非特异性免疫,即对所有的病原微生物都有一定程度的抵抗力,没有特殊的选择性,对身体的自然防御起很大作用.如鼻粘膜,口腔中含有一些溶菌酶,临床用于治疗副鼻窦炎和龋齿;眼泪和白血球中溶菌酶含量最高,因此在干燥综合症诊断上,认为泪液溶菌酶值的下降可以提供敏感可靠的指标,并能反映泪腺受损程度;在白血病患者的尿中,含有大量溶菌酶,临床上可有效地诊断白血病。

白血球中的溶菌酶在脱颗粒过程中被排列到噬菌体内,噬菌体感染宿主(抗原)后,诱导产生溶菌酶(抗体),这种溶菌酶是噬菌体染色体组,通过细胞壁分解酶和膜多糖分解酶的作用而表现,其主要功能一是使噬菌体产生吸附作用,二是使噬菌体向宿主菌体内注入DNA,溶菌酶在噬菌体侵入宿主菌细胞和溶菌的整个过程中都起着重要作用,此溶菌酶(抗体)和补体共同作用,使某些微生物敏感,因此,溶菌酶可能和噬菌体内其他抗微生物系统有协同作用,主要作用是消化细菌,而不是杀死细菌。

第1篇一、实验目的1. 掌握溶菌酶的提取和分离纯化方法。

2. 了解溶菌酶的生物学特性及其应用。

3. 熟悉实验室基本操作，提高实验技能。

二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖结构，导致细胞壁破裂而使细菌死亡的作用。

本实验通过提取鸡蛋清中的溶菌酶，运用盐析、透析、凝胶过滤等方法对其进行分离纯化，并测定其酶活性。

三、实验材料与仪器1. 材料：- 鸡蛋清- 盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、氯化钠、硫酸铜、氢氧化钠、乙醇、丙酮、乙醚等- 溶菌酶标准品- 酶活性测定试剂盒2. 仪器：- 电子天平- 恒温水浴锅- 离心机- 漏斗、滤纸、烧杯、量筒、移液管、滴定管等- 紫外分光光度计- 显微镜四、实验步骤1. 溶菌酶粗提取（1）取新鲜鸡蛋清10g，加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。

（2）加入10ml 0.1mol/L盐酸，调节pH至4.5。

（3）室温下搅拌30min，使溶菌酶充分溶解。

（4）加入10g硫酸铵，搅拌溶解，静置过夜。

2. 溶菌酶分离纯化（1）取沉淀物，加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。

（2）加入10ml 0.1mol/L氢氧化钠，调节pH至7.0。

（3）透析：将溶液置于透析袋中，放入500ml蒸馏水中，室温下透析过夜。

（4）凝胶过滤：将透析后的溶液上柱，柱材料为Sephadex G-25，洗脱液为0.05mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）。

（5）收集洗脱峰，用乙醇沉淀，室温下静置过夜。

（6）离心，收集沉淀物，加入适量蒸馏水溶解。

3. 溶菌酶酶活性测定按照酶活性测定试剂盒说明书进行操作，测定溶菌酶的酶活性。

4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）SDS-PAGE电泳：将分离纯化的溶菌酶样品与蛋白质marker混合，进行SDS-PAGE电泳。

（2）凝胶成像分析：用凝胶成像仪观察电泳结果，计算溶菌酶的纯度。

（3）分子量测定：将溶菌酶样品与蛋白质marker混合，进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白质marker的分子量计算溶菌酶的分子量。

一、实验目的1. 掌握溶菌酶的基本特性。

2. 学习溶菌酶的提取和分离纯化方法。

3. 通过实验鉴别溶菌酶与其他类似酶的活性差异。

二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于动物、植物和微生物细胞中的酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的作用，从而破坏细菌细胞壁，导致细菌死亡。

本实验通过提取溶菌酶，对其活性进行测定，并与其他类似酶进行对比，以鉴别溶菌酶的特性。

三、实验材料与仪器材料：1. 鸡蛋2. 生理盐水3. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）4. 硫酸铵5. 葡萄糖6. 硫酸铜7. 酚红指示剂8. 酶活性测定试剂盒仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 烧杯4. 移液器5. 显微镜6. 恒温水浴锅四、实验方法1. 溶菌酶提取：（1）取鸡蛋，去壳，取蛋黄；（2）将蛋黄放入烧杯中，加入适量的生理盐水，用玻璃棒搅拌；（3）将搅拌好的蛋黄液离心（3000 rpm，10 min）；（4）取上清液，即为溶菌酶粗提液。

2. 溶菌酶分离纯化：（1）将溶菌酶粗提液加入适量的硫酸铵，使蛋白质沉淀；（2）离心（3000 rpm，10 min）；（3）取沉淀，加入适量的磷酸盐缓冲液，溶解蛋白质；（4）重复上述步骤，直至蛋白质纯度达到预期。

3. 酶活性测定：（1）取酶活性测定试剂盒，按照说明书进行操作；（2）分别测定溶菌酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶的酶活性。

4. 溶菌酶与其他酶的鉴别：（1）将溶菌酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶分别制成酶液；（2）在显微镜下观察酶液对细菌细胞壁的破坏情况；（3）根据酶活性测定结果和显微镜观察结果，鉴别溶菌酶与其他酶的差异。

五、实验结果与分析1. 溶菌酶提取：成功提取出溶菌酶粗提液，蛋白质含量约为0.5 mg/mL。

2. 溶菌酶分离纯化：经过多次硫酸铵沉淀和磷酸盐缓冲液溶解，蛋白质纯度达到90%以上。

3. 酶活性测定：溶菌酶的酶活性为50 U/mL，葡萄糖氧化酶的酶活性为30 U/mL，β-半乳糖苷酶的酶活性为20 U/mL。

一、实验目的1. 熟悉溶菌酶的提取、分离纯化方法；2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法；3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。

二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的胞壁质酶，能够特异性地水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，从而破坏细菌细胞壁，导致细菌死亡。

本实验旨在通过提取、分离纯化溶菌酶，并对其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量进行测定。

三、实验材料1. 材料：鸡蛋、牛肉膏蛋白胨培养基、细菌培养液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝G-250染液等；2. 仪器：高速离心机、紫外分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统等；3. 试剂：氯化钠、氢氧化钠、醋酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠（SDS）等。

四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取（1）取新鲜鸡蛋，去壳，将蛋白与蛋黄分离；（2）将蛋白放入烧杯中，加入适量的氯化钠溶液，搅拌溶解；（3）将溶液过滤，得到滤液；（4）将滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，室温下放置1小时；（5）将溶液用醋酸溶液调节pH值至5.0，静置沉淀；（6）将沉淀用离心机离心（3000 r/min，10分钟），取上清液作为粗提液。

2. 溶菌酶的分离纯化（1）将粗提液用EDTA溶液处理，去除蛋白中的金属离子；（2）将处理后的溶液用磷酸缓冲液（pH 7.0）调节pH值，静置沉淀；（3）将沉淀用离心机离心（3000 r/min，10分钟），取上清液；（4）将上清液用SDS-PAGE凝胶电泳分离，观察溶菌酶的条带位置；（5）根据电泳结果，收集目标条带，并进行浓缩。

3. 酶活力和蛋白浓度测定（1）酶活力测定：将收集到的浓缩液加入细菌培养液中，在37℃下反应一定时间，测定细菌存活率，根据公式计算酶活力；（2）蛋白浓度测定：采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度。

4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）纯度鉴定：将分离纯化的溶菌酶样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，观察电泳图谱，判断纯度；（2）分子量测定：将分离纯化的溶菌酶样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，根据分子量标准曲线计算溶菌酶的分子量。

溶菌酶拼音名：Rongjunmei英文名：Lysozyme书页号：E6-141本品系自新鲜鸡蛋清中提取的一种能分解粘多糖的碱性蛋白酶，常与氯离子结合成为溶菌酶氯化物。

按干燥品计算，每1mg的效价不得少于6250单位。

【性状】本品为白色或微黄色的结晶性或无定形粉末；无臭，味甜；水溶液遇碱易破坏。

本品在水中易溶，在丙酮或乙醚中不溶。

【鉴别】(1)取本品约2mg，加水2滴使溶解，加10％氢氧化钠溶液5滴与10％硫酸铜溶液1滴，混匀后显紫红色。

(2)取本品，加醋酸－醋酸钠缓冲液（取无水醋酸钠6.7g，加水约900ml，振摇使溶解，用醋酸调节pH值至5.4，加水稀释至1000ml,摇匀。

）制成每1ml中含溶菌酶0.4mg的溶液，照分光光度法（中国药典1995年版二部附录ⅣＡ）测定,在280nm的波长处有最大吸收，吸收度应为0.39～0.49。

【检查】酸度取本品0.1g，加水至10ml溶解后，依法测定（中国药典1995年版二部附录ⅥＨ），pH值应为3.5～6.5。

干燥失重取本品0.2g，置五氧化二磷干燥器中,减压干燥3小时，减失重量不得过5.0％（中国药典1995年版二部附录ⅧＬ）。

炽灼残渣取本品0.2g，依法检查（中国药典1995年版二部附录ⅧＮ），遗留残渣不得过4.0％。

总氮量取本品，照氮测定法（中国药典1995年版附录ⅦＤ第二法），按干燥品计算，含总氮量应为15.0～17.0％。

【效价测定】供试品溶液的制备取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g，加水溶解使成1000ml,调节pH值至6.2]适量使溶解,并稀释成每1ml中含溶菌酶50μg的溶液。

底物悬浮液的制备称取溶酶小球菌15～20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.5～1ml,在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为50ml，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。