基因敲除原理示意图.ppt

MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
6
基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
7
二、基因敲除的基本流程
8
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
9
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
3
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (201061).

2
实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系， 在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖， 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而 发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
11
3．Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除，需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
1
在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。

Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
33
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
24
（二）
25
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
15
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
9
• Cre-LoxP系统的特性

➢ 选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomyc素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
➢ 同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法 或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中， 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生 同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源 基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射优 点是外源基因转移率高，可直接用外源基因进行 转移；缺点是转移基因表达不稳定，技术难度较 大，效率低。电穿孔命中率比显微注射低，但便 于使用。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。

P53 gene P53基因没有被替换
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123

PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。

靶向基因技术
• 经典方法 ：
– 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
• 饱含希望与失望的技术：
– ZFN，被Sigma公司垄断
• 新的里程碑：
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
（一）ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。

生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦
前言
Ø什么是基因？
Ø为什么要研究基因？
Ø如何研究？
位置—分类--结构—功能
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定
真核过表达 转基因
基因敲除
进一步验证
定量表达 表达规律-qPCR
体内蛋白水平 验证
Western blotting
如何获取基因
Ø同源克隆： 已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统 上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术

16
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
15
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
23
2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂

LoxP
Cre
Target gene
它是将cre 基因与各种组织(位点、时间、发育阶段)
特异性的启动子连接构建载体，获得相应的转基因 小鼠。即可通过诱导表达Cre 重组酶而将lox P 位点 间的基因切除,从而实现特定基因在特定时间的失活。
1.2.3 Cre-LoxP系统的实验方案
（1）在胚胎干细胞（ES ）中通过置换型载体进 行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因， 并在其两侧引入两个同向排列的Loxp位点。将该 ES细胞打入假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”。
•neo 基因有双重作用,一方面形成靶位基因的插入突 变，同时作为正向筛选的标记。
•HSV - tk 基因是负选择基因，含有HSV - tk (胸苷 激酶蛋白)的重组细胞在GANC 培养基中不能存活。
胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而 杀死细胞。
外源 基因
整合到染色体 的其他位置
基因转座常伴随着基因缺失、重排等，因而可以 应用到基因敲除。
1.3.2 基因敲除与RNAi的关系
•RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA， 导致转录后水平基因沉默的现象。 •RNAi是从转录水平抑制基因的作用，也可以看作是 基因敲除的一种形式。
DNA mRNA
（2）显微注射方法获得转基因“Cre 小鼠”，此 转基因小鼠在特定的启动子下表达Cre重组酶。 （3）“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配，Cre 重组酶会切掉Loxp位点之间的靶基因和1个 Loxp位点，从而达到靶基因的失活或敲除。
此外，还可以从细胞水平进行Cre-LoxP系统实验。
1.3 其他基因敲除技术
3’ 5’
Exo蛋白 3’ 5’

流式细胞仪（Flow Cytometer)
02
Charged Plates
Fluorescence Activated Cell Sorting
添加标题
1
添加标题
2
+
添加标题
3
Single cells sorted into test tubes
添加标题
4
FALS Sensor
添加标题
5
Fluorescence detector
应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。
免疫胶体金标定(Immunogold labeling)
利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。
基本原理： 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。
吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。
细胞培养
在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。
人的细胞培养
细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。 细胞株: 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。

基因敲除一、基因敲除简介基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。

基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。

指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。

此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。

二、基因敲除的方法及原理1．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如：neo基因）的载体上，成为重组载体。

将重组载体通过一定的方式（如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。

将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

动物的重组概率为10-2~10-5，植物的概率为10-4~10-5，如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。

目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。

其中应用最多的是PNS法。

通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

例题(18分）1. 基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：该技术的主要步骤及应用如下：（1）第一步是构建打靶载体，把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV - TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因__________。

（2）第二步是将打靶载体通过________________技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。

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5
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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11
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12
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13
Cre/loxP系统作. 用原理示意图
14
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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1
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。

2. 细菌送样前请先测试菌株是否具有氨苄青霉素（Ap）、 卡那霉素（Kn）、氯霉素（Cm）、四环素（Tc）抗性， 并保证至少不具有其中一种抗性。如需委托抗性测试， 另需收费300元单个抗性测试。
3. 请按附件1要求标识需要敲除的基因，以及上下游500bp 左右的序列 。
4. 细菌样品以液体或平板划线形式寄出。 5. 在样品寄出前请以电子邮件形式提供培养条件。
电话：
技术服务
七、本公司可以提供的其它实验服务
1. 细菌、真菌的多位点分子鉴定 2. 细菌API、Biolog生化鉴定 3. 基因克隆及原核表达 4. 荧光定量PCR术服务
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
合转移效率，减少非特异重组的概率。 5. 自杀载体具有自主开发的反向筛选基因vmt，用于替换
常规的sacB基因，从而大大增加基于自杀载体基因敲 除技术的适用范围，大大减少第二次重组后缺失突变克 隆的筛选工作。
电话：
技术服务
六、送样要求
1. 细菌送样前请鉴定确认好菌株的种类，以免基因扩增不 能匹配靶基因。
技术服务的梦工厂
life sciences
细菌基因敲除服务介绍
Guangzhou Maibo Bioscience Co., Ltd. Email: Tel:
创新、科技、价值
一、技术原理
电话：
细菌基因敲除原理示意图（示例）
技术服务
二、敲除结果检测
电话：
基因敲除结果鉴定（示例）
技术服务
三、革兰氏阴性菌基因敲除流程
自杀载体构建 自杀载体导入供体菌 供体菌与靶细菌接合作用，自杀载体转移 第一次同源重组及筛选 第二次同源重组及筛选 基因缺失株鉴定

．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。

2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞<ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1>：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等>的载体上，成为重组载体。

基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射>导入同源的胚胎干细胞(ES cell>中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

同源重组基因敲除原理同源重组基因敲除，也称为转基因技术，是将两个基因上的片段截取到等位基因之外的 DNA 中，再重新组合到同一个基因上的一种技术。

这个过程也被称为基因敲除技术。

这种技术用于将特殊基因编码的蛋白质从生物体中组装起来，从而达到敲除某种特定的基因，或者研究新的突变和表型。

基因敲除技术可以将DNA片段连接在一起，并且可以融合多种中性拷贝来表达新的基因，这对于基因组结构研究非常重要。

基因敲除技术主要可以分为三类：突变型、常用片段融合型及同源重组型敲除技术。

常用片段融合型敲除技术是在目标基因中添加一个特异的连接头，从而使其具有隐藏的模式，抑制其功能。

而同源重组型敲除技术则是将两个基因的片段植入另一个片段的DNA中，使两个片段插入到一起，形成新的突变。

这些突变可以减弱目标基因的功能，从而屏蔽与此有关的特性或表型。

目前，学者们可以使用同源重组型敲除技术来研究特殊基因编码的蛋白质在生物体中的作用以及在病理、发育等过程中的调控机制。

而且，它还可以用来研究新的突变及其相关的表型，从而开展更多的生物学研究。

传统的同源重组方法，如DNA克隆、引物扩增PCR等，可以很好的实现相关的突变的敲除。

然而，随着生物素质技术的进步，细胞核酸和抗原之间的关系更加清晰。

利用CRISPR/Cas9及其衍生技术，可以有效地对基因组或蛋白质结构模糊位点进行控制，从而实现敲除特定染色体上的特殊基因或者研究新的突变及其相关表型。

同源重组基因敲除技术由其可靠性和卓越的灵敏度被广泛应用于许多生物学研究中。

这种技术可以增强基因上的特性，可以用来改变类型的基因的表观遗传性，可以从模式生物中删除特定的基因，从而探索这些缺失基因在生物体中扮演的角色。

它还可以使用在基因工程领域，有助于改变生物体的结构和功能，从而开发高效的药物等。