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cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理Cre-loxp系统是一种常用的基因敲除技术，用于特定区域的基因敲除。
该系统是通过两种转基因技术相互配合实现的，即Cre重组酶和loxp位点。
Cre重组酶是一种由细菌噬菌体产生的酶，能够识别和剪切含有loxp位点的DNA序列，从而实现特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统的原理如下：1. Cre重组酶的表达：首先，使用基因工程技术将Cre酶的编码基因嵌入到转基因小鼠的基因组中，使其能够在特定的组织或细胞类型中产生。
通过引入特定的启动子或组织特异性表达的促进子，可以实现Cre重组酶在目标组织或细胞中的表达。
2. 基因敲除载体：在目标基因的启动子或内含子区域，插入一对loxp位点。
loxp位点是一种特殊的DNA序列，约有34个碱基对，呈倒向重复，用于诱导Cre重组酶的作用。
3. Cre重组酶的介导：一旦Cre重组酶在目标组织或细胞中表达，它能够识别和结合含有loxp位点的DNA序列，并结合在loxp位点上。
Cre重组酶在loxp位点间发生酶活性，通过识别和切割这两个loxp位点间的DNA链，将目标基因位点裂解。
4. 基因敲除效应：一旦目标基因位点被裂解，无法继续正常转录和翻译，从而导致目标基因的敲除。
这样，就实现了在特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统具有以下特点和优点：1. 灵活性：Cre-loxp系统可以在不同的组织或细胞类型中实现基因敲除，由于Cre重组酶的表达是由特定启动子或组织特异性表达的促进子控制的，因此可以实现组织或细胞特定的基因敲除。
2. 高效性：Cre重组酶的催化作用很高效，能够在较短的时间内进行特定区域的基因敲除。
3. 精确性：Cre重组酶只能识别和剪切含有完整loxp位点序列的DNA链，因此能够实现精确的目标基因敲除，而不会对其他基因产生影响。
4. 可逆性：如果需要在特定的时期或特定的组织中恢复目标基因的表达，只需停止Cre重组酶的表达即可。
Creloxp重组系统介导转基因绒山羊标记基因删除的研究的开题报告一、研究背景和意义转基因绒山羊是一种非常有价值的动物模型，可以用于生物医学研究、基因功能分析等方面。
然而，随着生物医学研究的发展，越来越多的功能基因被发现，需要进行进一步的研究。
这些基因的研究需要建立相应的转基因绒山羊模型，但由于现有的转基因技术都存在一定的局限性，因此需要寻找新的方法来改进这一情况。
Cre-loxP重组系统是一种高效、原理简单的基因编辑技术，具有精准、可控、快速等特点，被广泛应用于哺乳动物基因工程技术中。
利用Cre-loxP重组技术可以实现基因敲除、替换等功能，为研究基因在细胞、组织、器官、器系等不同层次的生理和病理调节机制提供了强有力的工具。
二、研究内容和方法本研究将利用Cre-loxP重组技术对绒山羊进行基因敲除，主要包括以下内容：1. 构建ploxP -neomycin-loxP质粒首先设计、合成ploxP -neomycin-loxP质粒，并纯化得到高质量的DNA。
此质粒在Cre-loxP重组系统中起到重要的作用，是实现基因敲除的关键。
2. 优化Cre-loxP重组体系Cre-loxP重组体系是实现基因敲除的基础，需要建立一个高效、稳定、可重复的体系，才能实现对绒山羊基因的准确编辑。
优化Cre-loxP 重组体系，包括传递Cre重组酶，优化重组载体构建等方面。
3. 运用Cre-loxP重组技术敲除绒山羊标记基因选定目标基因进行敲除后，将构建好的质粒ploxP -neomycin-loxP导入到绒山羊胚胎细胞中，然后通过Cre酶介导基因重组，实现对目标基因的敲除。
随后利用PCR、Western印迹和T7E1等技术验证敲除效果。
三、预期结果本研究的预期结果包括：1. 成功构建Cre-loxP重组体系，实现对绒山羊基因的敲除。
2. 验证基因敲除效果，明确目标基因在绒山羊生长发育、健康状态等方面的影响。
3. 探究Cre-loxP重组体系的优缺点，为之后的研究提供参考。
基于CRISPRCas9技术的基因敲入敲除策略一、本文概述随着生物科技的飞速发展，基因编辑技术已成为现代生物医学研究的重要工具。
其中，CRISPR-Cas9技术以其高效、精确的特性，在基因敲入敲除策略中展现出了巨大的潜力。
本文旨在全面介绍基于CRISPR-Cas9技术的基因敲入敲除策略，包括其原理、应用、优缺点以及未来的发展趋势。
通过对这一技术的深入剖析，我们期望为科研人员提供一个清晰、全面的视角，以更好地理解和应用CRISPR-Cas9技术，推动生物医学领域的研究进展。
二、CRISPR-Cas9技术的基本原理CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）技术是一种强大的基因编辑工具，它源自细菌的自然防御机制，即CRISPR系统。
这一系统允许细菌存储并记忆过去遭遇过的病毒DNA片段，以便在未来遇到相同病毒时，能够识别并切割这些病毒DNA，从而抵抗病毒感染。
CRISPR-Cas9系统通过这一机制被改造为一种精确的基因编辑工具，用于在真核细胞（如人类细胞）中进行基因敲除和敲入操作。
CRISPR-Cas9技术的基本原理可以分为三个主要步骤：目标识别、DNA切割和修复。
一个由RNA和Cas9蛋白组成的复合物被设计用来识别特定的DNA序列。
这个RNA分子，通常被称为单链导向RNA（sgRNA），能够与Cas9蛋白结合，并指导Cas9蛋白在目标DNA序列上定位。
sgRNA的设计是关键，它必须能够准确地与目标DNA序列配对，以确保Cas9蛋白能够在正确的位置进行切割。
一旦Cas9蛋白在目标DNA序列上定位，它就会切割DNA双链，产生一个双链断裂（DSB）。
细胞对DSB的修复机制有两种主要方式：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。
NHEJ是一种错误易发的修复方式，它通常会导致DNA序列的插入、删除或替换，从而导致基因功能的丧失，这种机制常被用于基因敲除。
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究中，基因敲除是一种重要的技术手段，能够精确地操控特定基因的表达，进而研究基因在生物体中的功能。
近年来，随着基因编辑技术的发展，尤其是CRISPR-Cas9系统的广泛应用，基因敲除技术得到了极大的推进。
本文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法和步骤，为进一步研究DUSP9基因的功能提供技术支持。
二、CRISPR-Cas9系统简介CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，具有高效、精确的基因编辑能力。
该系统通过设计特定的RNA 引导序列与Cas9蛋白结合，形成复合物，识别并切割靶点DNA 序列，从而实现基因的敲入、敲除或替换等操作。
三、DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的构建1. 靶点设计：首先需要确定DUSP9基因的敲除靶点，设计相应的sgRNA和Cas9蛋白序列。
通过分析DUSP9基因的序列，找到合适的位置作为靶点。
2. 胚胎干细胞系的获取：选取适合的小鼠胚胎干细胞系，确保其处于稳定的生长状态。
3. CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑：将设计好的sgRNA和Cas9蛋白通过特定的方式（如质粒转染、病毒载体等）引入小鼠胚胎干细胞中。
在细胞内，sgRNA和Cas9蛋白形成复合物，识别并切割DUSP9基因的靶点。
4. 克隆筛选和鉴定：经过一段时间的培养和筛选，挑选出发生基因突变的小鼠胚胎干细胞克隆。
通过PCR、测序等分子生物学手段，鉴定克隆中DUSP9基因的敲除情况。
5. 细胞系建立：将鉴定成功的DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞进行传代培养，建立稳定的细胞系。
四、实验结果与讨论通过上述步骤，我们成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系。
在实验过程中，我们观察到CRISPR-Cas9系统对DUSP9基因的切割效率较高，成功获得了多株基因敲除克隆。
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍基因敲除小鼠是我们研究基因功能必不可少的利器，主要分为全身性基因敲除和条件性基因敲除。
然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，例如：不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能；全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。
因此，条件性基因敲除小鼠虽然有周期长、费用高、需要配合特定工具鼠使用等劣势，但仍获得了越来越多的选择与喜爱。
今天，就和大家一起来了解下条件性基因敲除方法必用的Cre-loxP重组系统以及应用Cre-loxP进行条件性基因敲除的原则。
概述Cre-loxP重组系统，即对一段特定的DNA序列进行定位并用Cre 重组酶对其进行剪接，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。
其中Cre蛋白，最初由“导致重组（Cause recombination）”命名，也有文献命名为“环化重组酶（Cyclizationrecombinase）”。
Cre重组酶（CyclizationRecombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。
它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除loxP片段间的基因。
loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌体基因组中34bp的特殊位点序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。
其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向，间隔区中的“N”代表这个碱基是可变的：发展历史1985年，R H Hoess, K AbremskiCre-Lox首次发表了大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统的断裂和交换机制文章。
1987年，Brian Sauer博士把大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统在酿酒酵母中即真核系统中进行了功能表达，提出了Cre介导的位点特异性重组可能是调节真核生物基因组重排的有用工具的预想。
基因敲除及基因编辑技术在病毒治疗中的应用在近年来，基因编辑技术已被广泛应用于生命科学领域。
基因编辑技术通过改变细胞或个体的基因组来改变其生物学特性。
这项技术可以用于缺失或失活的基因恢复，也可以用于用于治疗各种疾病。
其中，基因敲除是一种利用CRISPR/Cas9系统，通过抑制或消除基因来改变细胞特性的方法。
在病毒治疗中，基因敲除及基因编辑技术有着不同的应用。
本文将分别介绍基因敲除和基因编辑技术在病毒治疗中的应用。
一、基因敲除在病毒治疗中的应用病毒治疗是一种利用病毒向细胞或组织中输送治疗性基因来治疗特定疾病的技术。
然而，某些疾病可能由于存在抑制治疗的基因而难以治愈。
这时，基因敲除可以通过删除这些基因来提高治疗效果。
华盛顿大学研究人员曾在SIV感染猴实验中，通过敲除猴体内与病毒感染相关的基因TRIM5，并将治疗性基因导入体内来治疗SIV感染。
结果显示，TRIM5敲除后，治疗效果得到了显著提高，证明基因敲除可以提高基因治疗的效果。
此外，基因敲除也可以用于治疗基因突变相关疾病，其中最典型的例子是囊性纤维化(CF)。
CF是一种常染色体隐性遗传疾病，主要是由于CFTR基因的突变导致的。
CFTR是人体细胞膜上的离子通道蛋白，影响细胞内外的离子转运。
胰腺，肺和肠道是CF病人身体受到影响最严重的器官。
基因敲除可以用于删除有害的CFTR基因，并引入正常的CFTR基因恢复受影响器官的功能。
二、基因编辑技术在病毒治疗中的应用基因编辑技术包括多种方法，如CRISPR/Cas9，TALEN和ZFN等。
这些技术被广泛应用于各种治疗中，包括癌症和病毒感染等。
在病毒治疗中，基因编辑可以修改病毒的基因组，从而提高治疗效果。
西洋参多糖是一种天然的剂量依赖性病毒抑制剂，对多种病毒有广泛的抑制活性。
为了提高西洋参多糖的病毒抑制活性，研究人员通过基因编辑技术修改了西洋参多糖抑制病毒的基因，并通过病毒传递系统输送到受感染的细胞中。
实验结果表明，经过基因编辑的病毒，抑制病毒感染的能力比未经过编辑的病毒显著提高。
Cre-loxp重组酶系统是一种常用的基因编辑技术，它可以在特定的DNA序列上实现特异性的编辑和改变。
本文将从原理、应用和发展趋势等方面对Cre-loxp重组酶系统进行介绍。
一、Cre-loxp重组酶系统的原理1. Cre重组酶Cre重组酶是一种来源于大肠杆菌的酶，它能够识别和结合特定的DNA序列loxp，并在该序列上引发DNA的重组事件。
Cre酶最初是在嗜盐古细菌（Archaeoglobus fulgidus）中发现的，后来被用于基因编辑和遗传工程领域。
2. loxp序列loxp序列是Cre-loxp重组酶系统中的关键部分，它是一种DNA序列，长度为34个碱基对，其中包含了两个逆向定向重组位点。
这样的结构使得Cre酶可以选择性地将该序列分为两部分，并引发DNA片段的剪接和重组。
3. Cre-loxp重组酶系统的原理当Cre重组酶与loxp序列结合后，它将在该序列上诱导DNA的重组，使得该序列内的基因组成发生改变。
这种改变可以是插入、缺失、逆向或转向等，具体取决于Cre酶与loxp序列的相对定向。
Cre-loxp重组酶系统可以实现对特定DNA序列的编辑和改变。
二、Cre-loxp重组酶系统的应用1. 基因敲除通过Cre-loxp重组酶系统，可以实现对特定基因的敲除。
具体而言，首先需要在目标细胞中导入一个含有loxp序列的质粒，然后再导入Cre重组酶。
Cre酶与loxp序列结合后，将引发目标基因的敲除，从而实现对该基因的功能破坏或消除。
2. 基因激活除了基因敲除外，Cre-loxp重组酶系统还可以实现对特定基因的激活。
这种激活方式通常是通过插入或逆向调控目标基因的转录和翻译，从而增加目标基因产物的表达水平。
3. 细胞命运的调控在细胞生物学领域，Cre-loxp重组酶系统也被广泛应用于调控细胞的命运和功能。
通过敲除或激活特定基因，可以实现对细胞增殖、分化、凋亡等过程的调控，从而揭示细胞内部的生物学机制。
cre名词解释微生物CRE（的全称为Cre/loxP重组酶系统）是一种常用的遗传工程技术，被广泛应用于微生物学研究中。
本文将对CRE进行详细解释和探讨。
1. CRE的定义与原理CRE是一种重组酶系统，由Cre重组酶和loxP位点组成。
Cre重组酶是一种遗传物质（蛋白质），其功能是调控目标DNA分子上的重组反应。
loxP位点则是一种特定的DNA序列，它是CRE酶作用的靶标。
通过CRE和loxP的相互作用，可实现DNA分子的重组、插入或剪切等操作。
2. CRE的应用领域微生物学中，CRE被广泛用于基因组工程、基因表达调控、病毒病理研究等方面。
具体应用包括：- 基因敲除和基因突变：利用CRE的重组功能，可以靶向敲除或突变目标基因，从而实现研究该基因功能或解析其对生物体的作用。
- 基因表达调控：通过在目标基因上插入loxP位点，再利用CRE酶的活性，可以实现基因的激活或抑制，从而调控基因表达水平。
- 基因标记和追踪：结合荧光基因和CRE/loxP系统，可以标记特定细胞或组织，以追踪其在生物体内的分布和命运。
- 病原体研究：利用CRE/loxP系统，可以构建感染模型，研究病原体的致病机制、感染途径等，并探索相应的防治策略。
3. CRE的优势和局限性CRE/loxP系统在微生物学研究中具有以下优势：- 高度特异性：CRE酶对loxP位点的识别和结合具有高度特异性，因此可以实现准确的基因重组和操控。
- 灵活性：CRE/loxP系统可以在不同细胞类型和生物体中应用，且操作相对灵活，可以根据需要进行精细调整。
- 低毒性：CRE酶的表达对细胞或生物体的毒性较低，因此对被操作的生物体影响较小。
然而，CRE/loxP系统也存在一些局限性：- 依赖loxP位点：CRE/loxP系统必须在目标DNA上存在loxP位点才能发挥作用，因此需要在目标基因中进行插入或改造。
- 重组效率有限：CRE/loxP系统的重组效率受到多种因素的影响，包括CRE酶的表达水平、loxP位点的位置等，可能存在一定的不可控性。
基因敲除技术在药物发现中的应用随着科技的不断进步，生物学领域的科学家们越来越关注基因敲除技术在药物发现中的应用。
基因敲除技术是一种可以将基因的表达完全消除的方法，它对于研究细胞和生物体的生理和病理过程具有重要意义。
将这种技术应用于药物发现中，可以快速、准确地筛选出具有生物活性的化合物，为新型药物的研发提供强有力的支持。
一、基因敲除技术基因敲除技术是一种比较新颖的基因编辑技术，它的原理是利用CRISPR-Cas9系统或RNA干扰技术对靶基因进行干扰和抑制，从而实现基因的表达消除。
1. CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是一种自然存在于细菌和古细菌中的防御系统，由于它具有高效、精准、低成本等优点，近年来成为了基因编辑领域的最流行方法。
CRISPR-Cas9技术利用“指针蛋白”（Cas9酶）和CRISPR RNA（crRNA）以及传导RNA（tracrRNA）的特殊结构，可以识别到特定的DNA序列并使Cas9酶产生引导作用，从而切断靶标的DNA完整链。
CRISPR-Cas9技术已经在许多研究领域表现出突出的效果，包括基因敲除、基因突变、或者是基因替换等等。
2. RNA干扰技术RNA干扰技术是一种通过小干扰RNA (siRNA) 和 microRNA (miRNA) 抑制基因表达的方法。
它是通过RNA依赖性RNA导入复合物（RISC）将siRNA或miRNA与靶基因的mRNA结合，导致特定的mRNA被降解和/或被翻译抑制。
这种方法可以很好地模拟许多疾病的生理过程，鉴定出引起疾病的基因目标，为药物发现提供了大量的特定分子和药物靶点。
二、基因敲除技术在药物发现中的应用基因敲除技术不仅在基础生物学领域有着广泛的应用，同时也在药物发现中扮演着重要的角色。
结合基因敲除技术，科学家们可以更加准确地筛选出对疾病特异性目标作用的化合物，对药物研究和开发带来巨大的益处。
1. 寻找治疗肿瘤的新型靶点肿瘤是一种常见的疾病，对许多人造成了重大的困扰。
CRISPRCas9基因敲除原理及其应用CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。
在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。
Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。
CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA （singleguideRNA）。
融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：Cas9质粒构建pGK1.1设计2条单链oligo序列；退火形成双链DNA将双链DNA连接到载体中转化G10competentcell筛选阳性克隆；测序验证序列；质粒大提；电转染靶细胞在细胞内crRNA识别靶位点，Cas9对靶位点进行随机剪切CruiserTM酶切细胞池，计算突变率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆；将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。
CRISPR cas9基因敲除原理及其应用CRISPR Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是一种新兴的基因编辑技术，它利用CRISPR系统和Cas9酶实现对基因组的精确编辑。
本文将对CRISPR Cas9的基本原理进行详细介绍，并探讨其在生物学研究、医学治疗和农业育种等领域的应用前景。
一、CRISPR Cas9基因敲除原理CRISPR Cas9基因敲除是利用CRISPR-Cas9系统对目标基因进行精确编辑的一项技术。
CRISPR是细菌和古细菌天然免疫系统中的一种防御机制，能够通过记录并抵御外源DNA入侵来保护细菌免受病毒感染。
而Cas9是CRISPR系统中的核酸酶，具有裁剪并去除外源DNA的功能。
CRISPR Cas9基因敲除的基本步骤如下：1.设计合适的引导RNA（gRNA），通过与目标基因序列特异性结合，将Cas9酶精确引导到目标基因的靶位点。
2.Cas9酶与gRNA结合后形成复合物，通过靶向性的DNA酶切活性，在目标位点引发DNA双链断裂。
3.在细胞的DNA修复过程中，通过非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）机制，导致插入或缺失DNA碱基，从而实现基因的敲除。
二、CRISPR Cas9基因敲除的应用CRISPR Cas9基因敲除技术在生物学、医学和农业领域有着广泛的应用前景。
1.基因功能研究：通过敲除特定基因，科研人员可以深入了解该基因在生物体内的功能以及相关的生理和病理过程。
CRISPR Cas9技术的高效性和精确性使得基因功能研究更加便捷和可靠。
2.疾病治疗：基于CRISPR Cas9技术，科学家可以直接敲除或修复与疾病相关的基因突变，为基因治疗提供了新的途径。
例如，将CRISPR Cas9应用于肿瘤治疗，可以针对肿瘤细胞中的特定基因进行敲除，达到抑制肿瘤生长和扩散的目的。
利用CRISPR-Cas9和Cv^HoxP系统删除34个非必需基因构建L-苏氨酸生产菌丁志祥12,胡晓清12,柳亚迪12,王小元*123（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122；2,江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；3.江南大学国际食品安全联合实验室，江苏无锡214122）摘要：L-苏氨酸是一种被广泛应用于食品、饲料及医药等领域的必需氨基酸$大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中，一些非必需基因的转录和翻译会消耗碳源$利用CRISPR-Cas9和位点特异性重组系统Cre/loxP,敲除了大肠杆菌MG1655基因组中puuE和ynal区间的34个非必需基因（共30.372kb）,获得了突变菌MG003，然后通过高表达L-苏氨酸合成途径中关键基因thrA*"thrB和thrC以及L-苏氨酸转运酶编码基因rhtA和rhtC提高L-苏氨酸产量。
与对照菌MG1655/pFW01-thrA*B C比,MG003/pFW01-thrA*B C生长加快，L-苏氨酸产量提高25.5%:MG003/pFW01-thrA*B C-rhtA的L-苏氨酸产量提高了43.3%；MG003/pFW01-thrA*B C-rhtC的L-苏氨酸产量提高了74.5%。
研究结果表明，大肠杆菌基因组中34个非必需基因的删除有利于其提高L-苏氨酸合成能力。
关键词：大肠杆菌；L-苏氨酸；CRISPR-Cas9；Cre/loxP；puuE；ynal中图分类号:Q933文章编号：1673-1689（2020）11-0071-10DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2020.11.010Construction of L-Threonine-Producing Escherichia coli by Deleting34NonEssential Genes Using CRISPR-Cas9and CrelloxP System*1,2,3DING Zhixiang1,2,HU Xiaoqing1,2,LIU Yadi1,2,WANG Xiaoyuan(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.Schoolof Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,China; 3.International Joint Laboratory on Food Safety,Jiangnan University,Wuxi214122,China)Abstract:L-threonine is an essential amino acid widely used in food,feed and medicine.In theprocess of L-threonine synthesis from glucose,transcription and translation of some non-essentialgenes consume carbon source.In this study,CRISPR-Cas9and site-specific recombination systemCrel loxP were used to delete34non-essential genes(30.372kb)between puuE and ynal genes in thegenome of E.coli MG1655,resulting the mutant strain MG003.The genes thrA thrB and thrC,thekey genes in the L-threonine biosynthetic pathway,and the genes rhtA and rhtC encoding theL-threonine transporters,were then overexpressed in MG003to increase the L-threonine production.Compared to the control strain MG1655lpFW01-thrA*B C,MG003lpFW01-thrA%BC grew faster and收稿日期：2019-04-01基金项目：国家轻工技术与工程一流学科自主课题项目(LITE201P-10)(*通信作者：王小元(1965—),男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事微生物代谢工程方面的研究。
