重组腺病毒常见问题解答(FAQs)解析

腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。

对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。

而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。

注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。

2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。

根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。

纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。

4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。

在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。

5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。

Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。

但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。

6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。

可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。

2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。

避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。

腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。

对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。

而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。

注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。

2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。

根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。

纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。

4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。

在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。

5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。

Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。

但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。

6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。

可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。

2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。

避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。

如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。

腺病毒载体常见问题汇总
1.问：腺病毒和AAV不同吗？
答：是的！AAV是一种小型单链DNA细小病毒，被发现是腺病毒制剂的一种污染物，而腺病毒是一类中型、无包膜的双链DNA病毒。

他们没有关系；然而，AAV的复制需要腺病毒基因E1、E4、E2a和VA的参与。

2.问：可以用腺病毒构建一个稳定的细胞系吗？
答：不，腺病毒载体只能瞬时表达使用。

3.问：腺病毒复制有缺陷吗？
答：通常是有的，因为复制所需的早期基因已从转移载体中删除。

早期基因E1由转染细胞系（293或911）提供。

为了避免产生具有复制能力的病毒，不应该连续扩增病毒，因为每一轮扩增都会增加产生具有复制能力的病毒的重组事件的机会。

4.问：什么是RCA？
答：RCA代表具有复制能力的腺病毒。

当你的腺病毒载体和包装细胞系中发现的早期基因之间的交叉事件产生野生型腺病毒时，可能会发生这种情况。

交叉事件的概率随着每一轮扩增而增加。

汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。

本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。

无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。

而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。

同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。

而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。

同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。

正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。

基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。

以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。

2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。

但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。

当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。

3.重组腺病毒作基因治疗，因为不是很了解，用AdEasy系统可以吗？具体的实验步骤是来自什么地方？主要细胞及试剂的来源？.BIOgene公司有整个系统，从质粒到细胞都有，我AdEasy的基本原理请参阅文献AVol.95.pp.2509-2514,March 19984.以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染，查文献，病毒滴度测定用噬斑法，但所用细胞不统一，是否有统一规定？就用肿瘤细胞来测行吗？只有能反式提供E1的细胞才能用来测腺病毒滴度，一般用HEK293细胞，用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑。

汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。

本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。

无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。

而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。

同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。

而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。

同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。

/vcore/Plasmids/pUMVC6a.htm/vcore/Plasmids/pUMVC7.htm正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。

基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。

以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。

2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。

但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。

当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。

腺病毒中⽂操作⼿册腺病毒载体操作⼿册中⽂版腺病毒重组系统AdEasyTM操作⼿册⽬录第⼀章简介13.2AdEasyTM系统中产⽣重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第⼆章应⽤重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆⼊AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英⽂全称中⽂全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5⾎清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin⼩⽜⾎清⽩蛋⽩聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide⼆甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate⼗⼆烷基硫酸钠⼄⼆胺四/⼆硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid⼄⼆胺四⼄酸⼄酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化⼄锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎⽜⾎清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋⽩⼩时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野⽣型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第⼀章简介当今基因输送技术的发展⽇趋复杂，⼀些治疗药物（⽣长激素、⼲扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋⽩（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更⾼效的基因输送⼯具。